- 00:00Visão Geral
- 00:41Size-Exclusion Chromatography
- 02:08Operation of Size-Exclusion Chromatography
- 02:58Affinity Chromatography
- 05:11Operation of Affinity Chromatography
- 06:25Applications
- 07:30Summary
Metodi di purificazione di biomolecole basati sulla cromatografia
English
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Visão Geral
In biochimica, i metodi di purificazione basati sulla cromatografia sono impiegati per isolare i composti da una miscela complessa. Due di questi metodi usati comunemente dai biochimici sono la cromatografia ad esclusione dimensionale e la cromatografia di affinità. Nella cromatografia ad esclusione dimensionale, una colonna piena di perle porose separa i componenti di una miscela in base alle dimensioni. D’altra parte, la cromatografia di affinità consente una separazione più specifica delle biomolecole utilizzando una colonna composta da fase stazionaria, che contiene ligandi specifici del bersaglio.
Questo video serve come introduzione alla cromatografia di esclusione delle dimensioni e affinità, nonché ai concetti che li governano. Viene descritta una procedura passo-passo per la purificazione di una proteina marcata con istidina mediante cromatografia di affinità metallica immobilizzata. Sono inoltre profilate le applicazioni per entrambi questi metodi cromatografici in biochimica e nella ricerca biomedica.
“Cromatografia” si riferisce a una vasta gamma di metodi utilizzati per isolare un componente da una miscela complessa, un passo essenziale prima che le proprietà e le attività di una biomolecola possano essere determinate. Ogni tecnica cromatografica ha un meccanismo di separazione diverso, a seconda della matrice del campione e del composto bersaglio. Questo video si concentrerà sui principi e sul funzionamento di due metodi comuni alla biochimica: l’esclusione dimensionale e la cromatografia di affinità.
La cromatografia ad esclusione dimensionale o SEC si basa sulla dimensione dei composti nel campione. Una fase mobile contenente il campione viene aggiunta a una colonna con un materiale poroso: la fase stazionaria. Le molecole nel campione rientrano in 1 delle 3 categorie.
Molecole troppo grandi per entrare nei pori percorrono la distanza più breve attraverso la colonna. Qualsiasi specie con un peso molecolare superiore a questo “limite di esclusione” uscirà dalla colonna allo stesso tempo. Le molecole abbastanza piccole da entrare liberamente nei pori saranno trattenute più a lungo e usciranno insieme dalla colonna. Il peso molecolare che consente l’ingresso completo dei pori è il “limite di permeazione”.
Solo le molecole tra questi limiti saranno separate l’una dall’altra, poiché trascorrono quantità variabili di tempo a diffondersi dentro e fuori dai pori. Le molecole più piccole vengono trattenute più a lungo sulla colonna perché trascorrono più tempo nella fase stazionaria, mentre le molecole più grandi entro questi limiti escono prima.
I pesi molecolari da 1 a 2 ordini di grandezza rientrano in questi limiti. Le colonne vengono scelte con questo in mente, oppure più colonne possono essere utilizzate in serie se esiste una vasta gamma di composti desiderati.
Ora che hai visto la teoria della SEC, diamo un’occhiata a come viene eseguita.
Per iniziare la procedura SEC, la colonna deve essere bilanciata con acqua deionizzata e tampone cromatografico. Una volta preparato, il buffer contenente il campione viene iniettato sulla colonna. Il buffer viene quindi spinto attraverso a una bassa portata. Un rilevatore monitora ciò che esce dalla colonna per determinare la presenza dell’analita desiderato. Molecole di grandi dimensioni con pesi molecolari superiori al limite di esclusione escono contemporaneamente dalla colonna. Piccole frazioni dalla colonna sono raccolte in tubi. Ogni frazione viene testata per la qualità della molecola bersaglio mediante elettroforesi su gel o altre tecniche analitiche.
Ora diamo un’occhiata alla cromatografia di affinità o AC, uno dei modi più efficienti per purificare le proteine. Molte biomolecole si legano selettivamente a determinati ligandi, una proprietà che AC utilizza aderendo un ligando specifico del bersaglio alla fase stazionaria.
Quando la miscela scorre attraverso la colonna, le molecole bersaglio si attaccano al ligando e il resto scorre attraverso. Dopo che la miscela è passata attraverso la colonna, la molecola bersaglio può essere raccolta attraverso uno dei due metodi di eluizione basati sulla specificità.
Si può dire che l’eluizione biospecifica abbia un ruolo “normale” o “inverso”. Nell’eluizione biospecifica a ruolo normale, viene aggiunto un agente che compete con il ligando aderente per legarsi alla biomolecola bersaglio.
Nell’eluizione biospecifica a ruolo inverso, un agente compete con il bersaglio per legarsi al ligando aderente. Il secondo tipo di eluizione, l’eluizione non specifica, abbassa il legame bersaglio-ligando modificando il pH, la forza ionica o la polarità della soluzione. Se una proteina non si lega a un ligando che può essere immobilizzato, la proteina può essere espressa contenente un “tag”: brevi sequenze peptidiche progettate per legarsi al ligando.
Una varietà è la cromatografia di affinità ionica metallica immobilizzata, “IMAC” in breve, in cui un ligando metallico aderente, come nichel o cobalto, si lega ai residui di istidina sulla proteina modificata. Attraverso tecniche di biologia molecolare, le proteine bersaglio vengono generate con residui ripetuti di istidina, chiamati tag polistidina, che si legano al metallo attraverso la catena laterale dell’imidazolo sull’istidina. Una volta legata, la proteina può essere raccolta con imidazolo libero tramite eluizione specifica a ruolo inverso e successivamente utilizzata in un’ampia varietà di applicazioni a valle. Ora che hai visto la teoria della cromatografia di affinità, diamo un’occhiata a una procedura IMAC in laboratorio.
In IMAC, la fase stazionaria può essere aggiunta direttamente alla miscela di fase mobile e campione, consentendo il legame della proteina his-tagged. Questo liquame viene quindi versato nella colonna, dove i composti non legati gocciolano nei rifiuti, mentre il liquame rimane. Il contenitore del liquame viene risciacquato per raccogliere la resina residua e il campione, che viene aggiunto alla colonna.
La resina viene agitata per garantire che i componenti non legati siano a flusso libero. Il tampone di lavaggio aggiunto aiuta a lavarli via. Una volta rimossi tutti i componenti non legati, i rifiuti vengono sostituiti con un contenitore per raccogliere la proteina bersaglio.
Il tampone contenente imidazolo viene aggiunto, mescolato e lasciato riposare per slegare la molecola bersaglio. L’imidazolo si lega al metallo, sostituendo e rilasciando la proteina etichettata. La proteina liberata viene raccolta e la fase di imidazolo viene ripetuta per garantire la raccolta totale. Per purificare ulteriormente il campione, SEC può essere eseguito sul campione prima dell’analisi.
Ora che abbiamo visto la teoria e la procedura di queste due tecniche, diamo un’occhiata ad alcuni dei modi in cui vengono applicate nel campo biochimico.
Un motivo comune per purificare le proteine è studiare il loro ruolo nella malattia. La fibrosi cistica è causata da difetti nella proteina regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica, o CFTR. Dopo aver coltivato la proteina con un his-tag nel lievito, sia l’affinità che la cromatografia di esclusione dimensionale consentono l’isolamento della proteina, seguito dallo studio della sua funzione.
In alcuni casi, la presenza di un tag polistidina può modificare la struttura di una proteina, influenzando così la sua funzione. Un altro tag comune è la proteina legante il maltosio o MBP, che si legherà all’amilosio legato in una colonna. Il maltosio viene quindi utilizzato per rilasciare il complesso. L’MBP può quindi essere scisso e rimosso con SEC per produrre la proteina pura desiderata.
Hai appena visto il video di JoVE sull’esclusione delle dimensioni e la cromatografia di affinità. Ha coperto la teoria delle tecniche, ha esaminato le procedure generali e ha coperto alcuni degli usi delle tecniche.
Grazie per l’attenzione!
Procedimento
Transcrição
“Chromatography” refers to a wide range of methods used to isolate a component from a complex mixture, an essential step before a biomolecule’s properties and activities can be determined. Each chromatographic technique has a different mechanism for separation, depending on the sample matrix and target compound. This video will focus on the principles and operation of two methods common to biochemistry: size-exclusion and affinity chromatography.
Size-exclusion chromatography or SEC is based on the size of the compounds in the sample. A mobile phase containing the sample is added to a column with a porous material: the stationary phase. The molecules in the sample fall into 1 of 3 categories.
Molecules too large to enter the pores travel the shortest distance through the column. Any species with a molecular weight above this “exclusion limit” will exit the column at the same time. Molecules small enough to freely enter the pores will be retained the longest, and will exit the column together. The molecular weight allowing complete pore entry is the “permeation limit”.
Only molecules between these limits will be separated from one another, as they spend varying amounts of time diffusing into and out of the pores. Smaller molecules are retained longer on the column because they spend more time in the stationary phase, whereas larger molecules within these limits exit earlier.
Molecular weights across 1 to 2 orders of magnitude fall within these limits. Columns are chosen with this in mind, or multiple columns can be used in series if there is a wide range of desired compounds.
Now that you’ve seen the theory of SEC, let’s look at how it is carried out.
To begin the SEC procedure, the column must be equilibrated with deionized water and chromatography buffer. Once prepared, buffer containing the sample is injected onto the column. The buffer is then pushed through at a low flow rate. A detector monitors what exits the column to determine the presence of the desired analyte. Large molecules with molecular weights above the exclusion limit exit the column at the same time. Small fractions from the column are collected in tubes. Each fraction is tested for the quality of the target molecule by gel electrophoresis or other analytical techniques.
Now let’s have a look at affinity chromatography or AC, one of the most efficient ways to purify proteins. Many biomolecules bind selectively to certain ligands-a property which AC utilizes by adhering a target-specific ligand to the stationary phase.
When the mixture flows through the column, the target molecules attach to the ligand, and the rest flow through. After the mixture has passed through the column, the target molecule can be collected through one of two elution methods based on specificity.
Biospecific elution can be said to a have a “normal-” or “reverse-role”. In normal-role biospecific elution, an agent is added that competes with the adhered ligand to bind with the target biomolecule.
In reverse-role biospecific elution, an agent competes with the target to bind to the adhered ligand. The second elution type, nonspecific elution, lowers the target-to-ligand binding by changing the solution’s pH, ionic strength, or polarity. If a protein does not bind to a ligand that can be immobilized, the protein can be expressed containing a “tag”: short peptide sequences engineered to bind to the ligand.
One variety is immobilized metal ion affinity chromatography, “IMAC” for short, where an adhered metal ligand, like nickel or cobalt, binds to histidine residues on the modified protein. Through molecular biology techniques, target proteins are generated with repeating histidine residues, called a polyhistidine-tag, which binds to the metal via the imidazole side chain on histidine. Once bound, the protein can be collected with free imidazole via reverse-role specific elution and later used in a wide variety of downstream applications. Now that you’ve seen the theory of affinity chromatography, let’s look at an IMAC procedure in the laboratory.
In IMAC, the stationary phase can be added directly to the mixture of mobile phase and sample, allowing the binding of the his-tagged protein. This slurry is then poured into the column, where the non-bound compounds drip into waste, while the slurry remains. The slurry container is rinsed to collect residual resin and sample, which is added to the column.
The resin is stirred to ensure the unbound components are free-flowing. Added wash buffer helps flush them away. Once all of the unbound components have been removed, the waste is replaced with a container to collect the target protein.
Buffer containing imidazole is added, stirred, and allowed to rest to unbind the target molecule. The imidazole binds to the metal, replacing and releasing the tagged protein. The freed protein is collected, and the imidazole step is repeated to ensure total collection. To further purify the sample, SEC can be run on the sample prior to analysis.
Now that we’ve seen the theory and procedure of these two techniques, let’s look at some of the ways they’re applied in the biochemical field.
A common reason to purify proteins is to study their role in disease. Cystic fibrosis is caused by defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein, or CFTR. After growing the protein with a his-tag in yeast, both affinity and size-exclusion chromatography allow the isolation of the protein, followed by the study of its function.
In some instances, the presence of a polyhistidine tag can change a protein’s structure, thereby affecting its function. Another common tag is maltose-binding protein or MBP, which will bind to bound amylose in a column. Maltose is then used to release the complex. The MBP can then be cleaved and removed with SEC to produce the pure desired protein.
You’ve just watched JoVE’s video on size-exclusion and affinity chromatography. It covered the theory of the techniques, went over general procedures, and covered some of the uses of the techniques.
Thanks for watching!
