- 00:00Visão Geral
- 00:41Size-Exclusion Chromatography
- 02:08Operation of Size-Exclusion Chromatography
- 02:58Affinity Chromatography
- 05:11Operation of Affinity Chromatography
- 06:25Applications
- 07:30Summary
Métodos de purificación de biomoléculas basados en cromatografía
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Visão Geral
En Bioquímica, se emplean métodos basados en cromatografía de purificación para aislar compuestos de una mezcla compleja. Dos tales métodos utilizados comúnmente por los bioquímicos son cromatografía por exclusión de tamaño y cromatografía de afinidad. En cromatografía por exclusión de tamaño, una columna de granos porosos separa los componentes de una mezcla basada en tamaño. Por otro lado, cromatografía de afinidad permite una separación más específica de biomoléculas utilizando una columna compuesta de fase estacionaria, que contiene ligandos específicos del destino.
Este video sirve como una introducción a la exclusión de tamaño y cromatografía de afinidad, así como los conceptos que los rigen. Se describe un procedimiento paso a paso para la purificación de una proteína histidina etiquetados mediante cromatografía de afinidad metálica inmovilizados. Aplicaciones para ambos de estos métodos cromatográficos en Bioquímica e investigación biomédica también están perfilados.
“Cromatografía” se refiere a una amplia gama de métodos utilizados para aislar un componente de una mezcla compleja, un paso esencial antes de que pueden determinarse una biomolécula características y actividades. Cada técnica cromatográfica tiene un mecanismo diferente para la separación, dependiendo de la matriz de la muestra y el objetivo compuesto. Este video se centrará en los principios y funcionamiento de los dos métodos comunes para bioquímica: cromatografía de exclusión de tamaño y afinidad.
Cromatografía por exclusión de tamaño o la SEC se basa en el tamaño de los compuestos en la muestra. Una fase móvil que contiene la muestra se agrega a una columna con un material poroso: la fase estacionaria. Las moléculas de la muestra caigan en 1 de 3 categorías.
Moléculas demasiado grandes para entrar en los poros del recorrido la distancia más corta a través de la columna. Cualquier especie con un peso molecular por encima de este límite de”exclusión” sale la columna a la vez. Moléculas suficientemente pequeñas como para entrar libremente en los poros se conservarán más tiempo y sale de la columna a. El peso molecular que permite el ingreso de poro completa es el “límite de permeación”.
Sólo las moléculas entre estos límites se separarán unos de otros, como gastan cantidades variables de tiempo de difusión dentro y fuera de los poros. Moléculas más pequeñas son retenidas ya en la columna porque pasan más tiempo en la fase estacionaria, mientras que moléculas más grandes dentro de estos límites la salida anterior.
Pesos moleculares entre 1 a 2 órdenes de magnitud caen dentro de estos límites. Columnas son elegidas con esto en mente, o pueden utilizar varias columnas en serie si hay una amplia gama de compuestos deseados.
Ahora que has visto la teoría de la SEC, echemos un vistazo a cómo se lleva a cabo.
Para comenzar el procedimiento de la SEC, debe equilibrarse la columna con agua desionizada y tampón de cromatografía. Una vez preparado, tampón que contiene la muestra se inyecta en la columna. El búfer se impulsó con un caudal bajo. Un detector controla lo que sale de la columna para determinar la presencia del analito deseado. Grandes moléculas con pesos moleculares por encima del límite de exclusión salir la columna al mismo tiempo. Pequeñas fracciones de la columna se recogen en tubos. Cada fracción se comprueba la calidad de la molécula objetivo por electroforesis en gel u otras técnicas analíticas.
Ahora echemos un vistazo a cromatografía de afinidad o de la CA, una de las maneras más eficientes para purificar proteínas. Muchas biomoléculas se unen selectivamente a cierto ligandos, una propiedad que utiliza el AC por adhesión de un ligando específico del destino en la fase estacionaria.
Cuando la mezcla pasa a través de la columna, las moléculas blanco Conecte el ligando y el resto atraviesa. Después de la mezcla a través de la columna, la molécula de la blanco puede recogerse a través de uno de dos métodos de elución basados en especificidad.
Elución de bioespécifico puede decirse que una tiene un “normal” o “reverse-rol”. En papel normal bioespécifico elución, se le agrega un agente que compite con el ligando adherido para enlazar con las biomoléculas del destino.
En reverso-papel bioespécifico elución, agente compite con el objetivo de enlazar con el ligando adherido. El segundo tipo de elución, no específico de elución, reduce el objetivo ligando por cambio de pH, fuerza iónica de la solución o polaridad. Si una proteína no se une a un ligando que puede ser inmovilizado, puede expresarse la proteína que contiene una “etiqueta”: breves secuencias de péptidos diseñadas para enlazar con el ligando.
Una variedad es iones metálicos inmovilizados cromatografía de afinidad, “IMAC” para el cortocircuito, donde un ligando metal adherido, como níquel o cobalto, se une a residuos de histidina en la proteína modificada. A través de técnicas de biología molecular, las proteínas blanco se generan con repetición residuos de histidina, llamados una polyhistidine-etiqueta, que se une al metal a través de la cadena lateral de imidazol en la histidina. Una vez, la proteína se pueden recoger con imidazol gratis mediante elución específico de función inversa y posteriormente utilizado en una amplia variedad de aplicaciones posteriores.
Ahora que has visto la teoría de la cromatografía de afinidad, echemos un vistazo a un procedimiento IMAC en el laboratorio.
En IMAC, la fase estacionaria puede ser añadida directamente a la mezcla de la fase móvil y la muestra, lo que permite a la Unión de la proteína de su etiquetado. Esta mezcla se vierte entonces en la columna, donde el no-limite compuestos inyectados en residuos, mientras que la mezcla se mantiene. Se enjuaga el recipiente de mezcla para recoger resina residual y la muestra, que se agrega a la columna.
La resina se agita para asegurar que los componentes son fluidas. Añadido wash buffer ayuda lávelos lejos. Una vez que todos los componentes hayan sido retirados, los residuos se sustituye por un recipiente para recoger la proteína diana.
Tampón que contiene imidazol es añadido, agitar y reposar para desvincular la molécula objetivo. El imidazol se une al metal, sustitución y liberación de la proteína de etiquetado. La proteína liberada se recoge y se repite el paso de imidazol para colección total. Para purificar más lejos el ejemplo, s se pueden ejecutar en la muestra antes del análisis.
Ahora que hemos visto la teoría y el procedimiento de estas dos técnicas, Veamos algunas de las formas en que están aplicadas en el campo de la bioquímico.
Una razón común para purificar proteínas es estudiar su papel en la enfermedad. La fibrosis quística es causada por defectos en la proteína de regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis quística o CFTR. Después de crecer la proteína con una su-etiqueta en la levadura, afinidad y cromatografía por exclusión de tamaño permiten el aislamiento de la proteína, seguido por el estudio de su función.
En algunos casos, la presencia de una etiqueta del polyhistidine cambiar estructura de la proteína, afectando su función. Otro común es proteína maltosa vinculante o MBP, que se unirá a amilosa en una columna. Maltosa se utiliza para liberar el complejo. La MBP se puede troceado y remover con SEC para producir la proteína deseada pura.
Sólo has visto video de Zeus en cromatografía de exclusión de tamaño y afinidad. Cubre la teoría de las técnicas, pasó de procedimientos generales y había cubierto algunos de los usos de las técnicas.
¡Gracias por ver!
Procedimento
Transcrição
“Chromatography” refers to a wide range of methods used to isolate a component from a complex mixture, an essential step before a biomolecule’s properties and activities can be determined. Each chromatographic technique has a different mechanism for separation, depending on the sample matrix and target compound. This video will focus on the principles and operation of two methods common to biochemistry: size-exclusion and affinity chromatography.
Size-exclusion chromatography or SEC is based on the size of the compounds in the sample. A mobile phase containing the sample is added to a column with a porous material: the stationary phase. The molecules in the sample fall into 1 of 3 categories.
Molecules too large to enter the pores travel the shortest distance through the column. Any species with a molecular weight above this “exclusion limit” will exit the column at the same time. Molecules small enough to freely enter the pores will be retained the longest, and will exit the column together. The molecular weight allowing complete pore entry is the “permeation limit”.
Only molecules between these limits will be separated from one another, as they spend varying amounts of time diffusing into and out of the pores. Smaller molecules are retained longer on the column because they spend more time in the stationary phase, whereas larger molecules within these limits exit earlier.
Molecular weights across 1 to 2 orders of magnitude fall within these limits. Columns are chosen with this in mind, or multiple columns can be used in series if there is a wide range of desired compounds.
Now that you’ve seen the theory of SEC, let’s look at how it is carried out.
To begin the SEC procedure, the column must be equilibrated with deionized water and chromatography buffer. Once prepared, buffer containing the sample is injected onto the column. The buffer is then pushed through at a low flow rate. A detector monitors what exits the column to determine the presence of the desired analyte. Large molecules with molecular weights above the exclusion limit exit the column at the same time. Small fractions from the column are collected in tubes. Each fraction is tested for the quality of the target molecule by gel electrophoresis or other analytical techniques.
Now let’s have a look at affinity chromatography or AC, one of the most efficient ways to purify proteins. Many biomolecules bind selectively to certain ligands-a property which AC utilizes by adhering a target-specific ligand to the stationary phase.
When the mixture flows through the column, the target molecules attach to the ligand, and the rest flow through. After the mixture has passed through the column, the target molecule can be collected through one of two elution methods based on specificity.
Biospecific elution can be said to a have a “normal-” or “reverse-role”. In normal-role biospecific elution, an agent is added that competes with the adhered ligand to bind with the target biomolecule.
In reverse-role biospecific elution, an agent competes with the target to bind to the adhered ligand. The second elution type, nonspecific elution, lowers the target-to-ligand binding by changing the solution’s pH, ionic strength, or polarity. If a protein does not bind to a ligand that can be immobilized, the protein can be expressed containing a “tag”: short peptide sequences engineered to bind to the ligand.
One variety is immobilized metal ion affinity chromatography, “IMAC” for short, where an adhered metal ligand, like nickel or cobalt, binds to histidine residues on the modified protein. Through molecular biology techniques, target proteins are generated with repeating histidine residues, called a polyhistidine-tag, which binds to the metal via the imidazole side chain on histidine. Once bound, the protein can be collected with free imidazole via reverse-role specific elution and later used in a wide variety of downstream applications. Now that you’ve seen the theory of affinity chromatography, let’s look at an IMAC procedure in the laboratory.
In IMAC, the stationary phase can be added directly to the mixture of mobile phase and sample, allowing the binding of the his-tagged protein. This slurry is then poured into the column, where the non-bound compounds drip into waste, while the slurry remains. The slurry container is rinsed to collect residual resin and sample, which is added to the column.
The resin is stirred to ensure the unbound components are free-flowing. Added wash buffer helps flush them away. Once all of the unbound components have been removed, the waste is replaced with a container to collect the target protein.
Buffer containing imidazole is added, stirred, and allowed to rest to unbind the target molecule. The imidazole binds to the metal, replacing and releasing the tagged protein. The freed protein is collected, and the imidazole step is repeated to ensure total collection. To further purify the sample, SEC can be run on the sample prior to analysis.
Now that we’ve seen the theory and procedure of these two techniques, let’s look at some of the ways they’re applied in the biochemical field.
A common reason to purify proteins is to study their role in disease. Cystic fibrosis is caused by defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein, or CFTR. After growing the protein with a his-tag in yeast, both affinity and size-exclusion chromatography allow the isolation of the protein, followed by the study of its function.
In some instances, the presence of a polyhistidine tag can change a protein’s structure, thereby affecting its function. Another common tag is maltose-binding protein or MBP, which will bind to bound amylose in a column. Maltose is then used to release the complex. The MBP can then be cleaved and removed with SEC to produce the pure desired protein.
You’ve just watched JoVE’s video on size-exclusion and affinity chromatography. It covered the theory of the techniques, went over general procedures, and covered some of the uses of the techniques.
Thanks for watching!
