Dialyse: Diffusion basiert Trennung
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Visão Geral
Dialyse ist ein verbreitetes Verfahren zur Trennung von Molekülen basierend auf Diffusion in der Biochemie verwendet. In diesem Verfahren ermöglicht eine halbdurchlässige Membran die Bewegung von bestimmten Molekülen basierend auf Größe. Diese Methode kann zur Entfernung von Puffer, Entsalzung, genannt oder den Austausch von Puffer Moleküle oder Ionen von einer Proteinlösung.
Dieses Video behandelt die Grundsätze der Dialyse nebst einer allgemeinen Verfahren mehrere Anwendungen der Dialyse überprüft werden, einschließlich der Beseitigung von gradient Reagenzien nach Ultrazentrifugation, Waschmittel nach einem Membranprotein entfernen Extraktion und die Wiederherstellung von Proteinen durch Ändern der Lösungsumgebung.
biochemischen Proben haben in der Regel hohe Puffer-Konzentrationen, die Weiterverarbeitung und Analyse stören können. Dialyse ist eine gemeinsame, kostengünstige Technik verwendet, um Moleküle, die basierend auf Diffusion zu trennen. Die Methode nutzt eine semipermeable Membran, die die Bewegung bestimmter Komponenten, basierend auf Größe ermöglicht. Dieses Video zeigt die Konzepte der Dialyse, ein allgemeines Verfahren, und einige seiner Verwendungen in Biochemie.
der wichtigste Aspekt der Dialyse ist eine semipermeable Membran, die Poren, die ein Molekulargewicht Cut-off, so dass Moleküle einer bestimmten Größe passieren zu verhängen. Beispielsweise wird ein 10 k-Membran in der Regel Moleküle größer als 10 Kilodaltons beibehalten. Die Molekulargewicht Cutoff ist jedoch keine diskrete oder genaue Grenze. Die Membran enthält in der Regel eine Vielzahl von Porengrößen, also ein kleiner Bruchteil der Moleküle in der Nähe des Grenzwertes verloren gehen kann.
Da die Molekulargewicht Cutoff über kugelförmige Proteine, lineare Moleküle ähnliche Masse, wie DNA oder RNA, definiert ist kann durch Rutschen. Membranen sind in der Regel gewählt, eine Hälfte auf ein Drittel das Molekulargewicht des gewünschten Moleküls.
, Das Verfahren, eine Probe durchzuführen befindet sich in der Membran, die wiederum ein großes Volumen der Lösung, als das Dialysat hinzugefügt wird. Im Laufe der Zeit werden kleinere Moleküle frei durch die Membran zwischen der Probe und das Dialysat, diffundieren, während die größeren Biomoleküle im Rahmen gehalten werden. Dialyse ist ein langsamer Prozess. Es ist üblich, über Nacht laufen lassen, oder auch über mehrere Tage.
Wenn das Dialysat reines Wasser ist, wird die Gesamtkonzentration Puffer, ein Prozeß bekannt als Entsalzung verringern. Wenn die Lösung andere kleine Partikel enthält, werden einige in der Probe führt zu Buffer Tausch bewegen. Da Dialyse ein Gleichgewicht Prozess ist, kann das Dialysat mehrmals aktualisiert, um kleine Moleküle weiter zu verdrängen. Sobald der Vorgang abgeschlossen ist wird die Probe wieder gesammelt für die Weiterverarbeitung.
Nun, dass Sie ' Ve gesehen die Grundlagen der Dialyse, lassen Sie ' s werfen Sie einen Blick auf ein allgemeines Verfahren.
vor Beginn des Verfahrens, die Membran ist presoaked im Dialysat. Dies macht es einfacher zu bedienen, und keine Konservierungsmittel entfernt. Einmal fertig, die Probe ist in der Regel mit einer Spritze gesammelt und wird dann an die Dialyse-Container hinzugefügt. Dies kann nackten Schläuche, oder in einer Kassette enthalten. Überschüssige Luft wird entfernt, der Dialyse-Einrichtung, um die Probe zu maximieren ' s Fläche mit der Membran. Die Einrichtung befindet sich dann in das Dialysat unter Rühren um die Verbreitung zu maximieren. Es sollte um nicht rühren hemmen schweben.
Das Dialysat wird geändert in entsprechenden Abständen als Gleichgewicht zwischen Probe und Dialysat erreicht ist. Nach der letzten Änderung bleibt die Reaktion in der Regel über Nacht laufen. Nach einer ausreichenden Zeit wird die Puffer frei oder -ausgetauschte Probe aus der Kassette entfernt. Einmal gesammelt, kann die Probe analysiert oder weiterverarbeitet, abhängig von der Art des Experiments.
nun, dass wir ' Ve sah eine allgemeine Dialyse-Verfahren, lassen Sie ' s sehen Sie einige der Möglichkeiten, die diese Technik wird in der Biochemie verwendet.
-Dichtegradienten sind eine gängige Methode, komplexe biologische Proben zu trennen. Dieses Konzept stützt sich auf die Verteilung auf kleine Partikel, in der Regel Saccharose oder Cäsium Chlorid-Ionen. Nach Abschluss dieser Reagenzien in der Regel müssen entfernt werden, bevor die gesammelten Probe verarbeitet werden kann. Dialyse macht es möglich, die gereinigte Probe für spätere Analysen zu nutzen.
Bestimmter Proteine befinden sich innerhalb einer Zelle ' s Lipid Bilayer und sind in der Regel von ihnen zu kugelförmig Lipid Vesicles bekannt als Liposomen einstreuen untersucht. Die Proteine und Lipide werden zuerst mit einem Reinigungsmittel extrahiert. Dialyse kann verwendet werden, um langsam zu entfernen, das Waschmittel, bilden Proteoliposomes.
Nach der Reinigung, einigen Proteinen misfolded oder denaturiert, was zu einem Verlust an Funktionalität. Die Verbindungen, die dazu führen, diese Änderungen in der Struktur dass mit Dialyse, führt zur Reformation von funktionierenden Analyten entfernt werden können.
Sie ' Ve beobachtete, wie Jupiter ' s-video an der Dialyse. Sie sollten jetzt verstehen diese Diffusion-basierte Methode, ein einfaches experimentelle Verfahren und die Verwendung dieser Technik.
Vielen Dank für das Ansehen von!
Procedimento
Declarações
Transcrição
Biochemical samples typically have high buffer concentrations that can disrupt downstream processing and analysis. Dialysis is a common, inexpensive technique used to separate molecules based on diffusion. The method utilizes a semi-permeable membrane that allows the movement of certain components, based on size. This video will show the concepts of dialysis, a general procedure, and some of its uses in biochemistry.
The most important aspect of dialysis is a semi-permeable membrane, which has pores that impose a molecular weight cut-off, allowing molecules below a certain size to pass through. For example, a 10k membrane will generally retain molecules larger than 10 kilodaltons. However, the molecular weight cutoff is not a discrete or precise boundary. The membrane typically contains a broad range of pore sizes, so a small fraction of molecules near the cutoff may be lost.
Since the molecular weight cutoff is defined using globular proteins, linear molecules of similar mass, like DNA or RNA, may slip through. Membranes are typically chosen one half to one third the molecular weight of the desired molecule.
To perform the procedure, a sample is placed into the membrane, which is in turn added to a large volume of solution, called the dialysate. Over time, smaller molecules will diffuse freely across the membrane between the sample and the dialysate, while the larger biomolecules are held within. Dialysis is a slow process. It is common to allow it to run overnight, or even across multiple days.
If the dialysate is pure water, the overall buffer concentration will decrease, a process known as desalting. If the solution contains other small particles, some will move into the sample, leading to buffer exchange. Because dialysis is an equilibrium process, the dialysate can be refreshed multiple times to further displace small molecules. Once the process is complete the sample is re-collected for further processing.
Now that you’ve seen the basics of dialysis, let’s take a look at a general procedure.
Before beginning the procedure, the membrane is presoaked in dialysate. This makes it easier to use, and removes any preservatives. Once ready, the sample is collected, typically with a syringe and is then added to the dialysis container. This can be bare tubing, or contained within a cassette. Excess air is removed from the dialysis setup to maximize the sample’s surface area with the membrane. The setup is then placed into the dialysate with stirring to maximize the diffusion. It should float to not inhibit stirring.
The dialysate is changed at relevant intervals as equilibrium between sample and dialysate is reached. After the last change, the reaction is typically left to run overnight. After a sufficient time period, the buffer-free or -exchanged sample is removed from the cassette. Once collected, the sample can be analyzed or further processed, depending on the nature of the experiment.
Now that we’ve looked at a general dialysis procedure, let’s see some of the ways this technique is used in biochemistry.
Density gradients are a common way to separate complex biological samples. This concept relies on the distribution on small particles, typically sucrose or cesium chloride ions. Once complete, these reagents typically need to be removed before the collected sample can be processed. Dialysis makes it possible to utilize the purified sample for future analysis.
Certain proteins are found within a cell’s lipid bilayer, and are usually studied by interspersing them into spherical lipid vesicles known as liposomes. The proteins and lipids are first extracted with a detergent. Dialysis can be used to slowly remove the detergent, forming proteoliposomes.
After purification, some proteins are misfolded, or denatured, leading to a loss in functionality. The compounds that cause these changes in structure can be removed with dialysis, leading to the reformation of functioning analytes.
You’ve just watched JoVE’s video on dialysis. You should now understand this diffusion-based method, a simple experimental procedure, and the use of this technique.
Thanks for watching!
