Name: カメの中で脳神経のIn Vitro刺激を用いて眼球運動 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 学ぶ、赤耳亀の離体頭部標本を用いた脳神経刺激による眼球運動運動学の測定法。行動訓練不要で眼回転と瞳孔径変化を定量化し、視覚の進化と眼運動制御メカニズムの研究に応用できる。

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著者は、夫人ポーレット ・ マッケナと秘書のサポート、この研究ではリサ Pezzino 氏フィル アウエルバッハをテクニカル サポートありがちましょう。著者も培養で分離されたヘッド準備にご紹介夫妻マイケル アリエルとマイケル ・ s ・ ジョーンズ (セントルイス大学医学部) に感謝します。この共同作業のサポートのための資金は、ラファイエット大学で神経科学プログラム、学術研究委員会生物学科 (ロバート ・ s. チェイス基金) によって提供されました。最後に、この作品は 2016 年 9 月 28 日に亡くなった氏フィル アウエルバッハに捧げられて彼は走査型電子顕微鏡を使用停止し、このプロトコルで使用するため、5 軸ステージの有用性を認識しました。彼の友情と機知を大幅に惜しまれるでしょう。

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

重要なステップ:
このプロトコルの中で重要な手順次のとおりです: 1) 解剖および切断の神経の生存を維持するために取られる心配2) 一貫した応答を提供するために脳神経に吸引電極によるサイズのマッチング・ 3) の目の回転の適切な校正を提供するジンバル ヘッドの配置。
トラブルシューティング。
解剖は、挑戦することができますが、それを完了すると、数回、手順必要があります比較的まっすぐになります。神経応答のない場合は、最も可能性の高い原因は、解離障害です。脳の削除中にのみ最小限の張力および圧力の切削時に神経に適用するべき。金属製の手術器具で、神経に触れることも避けるべき、できるだけしのでガラス フックとプラスチックの鉗子、代用できます金属ツール トラブル34が持続する場合。亀組織は、焼きたての酸素の使用の変数のレベルを生き残るために能力を持っている亀リンゲル液バブル 95/5% O2/CO2冷蔵お...

電気生理学的実験ではミシシッピアカミミガメ カメを使用するための理論的根拠:
ミシシッピアカミミガメ カメ (Trachemys scripta elegans) の世界の最悪の侵略的な種の1つと考えられ、生態系が困っていることを示すことができます。ミシシッピアカミミガメ カメが成功した理由はよくわかっていないが、その耐性の生理と低酸素の条件2,3,4 の下で生き残ることができる神経組織の所有物のための一部ことがあります。.実験は自分の番号を脅かすことはない、最小限の努力、電気生理学的製剤残ることができる実行可能な拡張の期間、18 時間5,6限り上を使用します。メリットは、これも酸素8の低レベルに耐える能力を持っているザリガニ7など無脊椎動物の動物を使用する利点に似ています。
眼球運動の測定方法:
ヒト以外の霊長類を用いた前頭葉目動物の眼球運動を測定する方法は、よく発達した9をされています。3 軸軌道回転目: 水平方向、垂直方向、およびねじり。磁気サーチコイル法は一般的に測定の回転の最も信頼性の高いと見なされますが、動物10,11scleras に挿入される小さなコイルを必要とする侵襲的です。ビデオ ベースのシステムは、回転を測定し、非侵襲的であることの利点を持っていることができます。革新的な画像処理と一緒により良いカメラの開発、拡張、機能12,13,14を考慮する魅力的な代替ビデオ ベースのシステムを作るします。
Nonmammals 中の眼球運動を測定するための技術は大いにより少なく重要なされています。対策は、いずれか低解像度または回転15,16,17,18の一部のみを記述します。開発の欠如は、部分的に視標に従う訓練 nonmammals の難しさのせいにできます。眼球運動はミシシッピアカミミガメ カメ19,20,21,22,23,24,25 でよく研究されているが、26,27,28,29,30、ターゲットを追跡する訓練動物の挑戦のための眼球運動の正確な運動が不十分で理解しました。
ミシシッピアカミミガメのカメでは、脊椎動物の外側眼が考えられているが、甲による横方向の視野の重要な咬合が32を発生します彼らのシェル31に頭完全に撤回することができます、ため。結果は視覚的視界正面目の哺乳類のように動作し、正面に向かってならないこと。したがって、眼球運動を測定するためのアプローチを開発するためのモデルとして使用する際は、独自の進化論的視点を提供しています。
この作品で説明されているプロトコルは、ミシシッピアカミミガメ カメにおける眼球運動の運動学を識別するために培養で分離されたヘッド準備を使用します。脳は脳神経をそのまま頭蓋骨から解剖しました。頭は、目の筋肉を支配する脳神経の電気刺激による眼球運動を調整し、応答を換起するジンバルに配置されます。目の回転の措置は、暗い瞳孔と虹彩のマーキングを追跡、ソフトウェア アルゴリズムを使ってビデオ ベースのシステムによって行われます。(すなわち、水平方向、垂直方向、およびねじり回転) 両方の眼の運動を測定する機会を提供する、32と眼内 (すなわち瞳孔の変化)33動き。
遠心性神経経路の解析のモデル システム:
一般的に、どのように遠心性の神経信号を勉強する機会眼球運動を生成は、筋肉がリラックスした状態から開始脳32、によって処理される統合された感覚情報のない状態で捜査官を提供するアプローチ 33。したがって、のみ残して脳と筋肉に synapsing 遠心性の神経線維によって処理される、モデル系で目の運動を調べることができます。

<table><tbody><tr><td>アカミミガメ</td><td>Kons Scientific</td><td>Trachemys scripta elegans</td><td>大型(甲羅長15-20cm)</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>マグネシウムチョライド</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>M7304</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>S5761</td><td></td></tr>デ<tr><td>キストロース</td><td>シグマ-アルドリッチ株式会社LLC.</td><td>C5767</td><td></td></tr><tr><td>濃塩酸</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>H7020</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>オークトン</td><td>pH 6+</td><td></td></tr><tr><td>吸引刺激電極</td><td>A-M Systems</td><td>573000</td><td>バイポーラ吸引電極。573000 は 573050 に置き換えられていることに注意してください。</td></tr><tr><td>キャピラリーガラス</td><td>A-M システム</td><td>626000</td><td>マイクロフィラメントなしのシングルバレルホウケイ酸キャピラリーガラス、長さ 10 cm、外径 1.0 mm、内径 0.50 mm</td></tr><tr><td>代替吸引刺激電極</td><td>A-M システム</td><td>573050</td><td>バイポーラ吸引電極。大口径の毛細管ガラスが必要:627000、外径1.2mm、内径0.68mm</td></tr><tr><td>ステレオスコープ</td><td>Lieca</td><td>GZ7</td><td>倍率範囲、10倍 &ndash; 70倍</td></tr><tr><td>光ファイバー光源</td><td>Amscope</td><td>HL250-A</td><td>150W 光ファイバー顕微鏡イルミネーターライトボックス</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>625654</td><td>ステンレス鋼、ストレートスプリング、5.25インチ</td></tr><tr><td>鈍い解剖プローブ</td><td>カロライナバイオロジカルサプライカンパニー</td><td></td><td>627405 フーバーモールプローブ、ダブルエンドプローブとシーカー、6インチ</td></tr><tr><td>マイクロハサミ</td><td>カロライナバイオロジカルサプライカンパニー</td><td>623555</td><td>アイリスマイクロ解剖ハサミ、ステンレス鋼、0.5インチブレード、4.75インチ長</td></tr><tr><td>ファイン鉗子</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>F6521</td><td>ジュエラーズ鉗子、デュモンNo.5、イノックス合金、4.25インチ</td></tr><tr><td>湾曲鉗子</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC。</td><td>Z168696</td><td>ミディアムチップ、湾曲した鉗子、ステンレス鋼、4 "</td></tr><tr><td>メスハンドル</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC。</td><td>S2896</td><td>メスハンドル、No.3、ステンレス鋼</td></tr><tr><td>メスブレード</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC。</td><td>S2771</td>メス<td>の刃、No.11、鋼鉄</td></tr><tr><td>ギロチン</td><td>ハーバード装置</td><td>73-1918</td>クライ<td>ネギロチンタイプ7575</td></tr>へ<tr><td>ら</td><td>シグ</td><td>マZ648299</td><td>マイクロスプーンとヘラの計量セット。小さなヘラを使用:5.9インチ長い x 0.07"スクエアエンドの直径ハンドル:0.17インチx 1.3インチ長い、他の端のラウンド:0.17 "x 1.27インチロング</td></tr><tr><td>フック</td><td></td><td>Autozone98069SureBilt</td><td>フックとピックセット。グラインダーを使用してフックの鋭い先端を鈍くし、動物の口への損傷を防ぎます。</td></tr><tr><td>95/5% O2/CO2</td><td>Airgas, Inc.</td><td>X02OX95C2003102</td><td>5% 二酸化炭素バランス 酸素認証標準ガス混合物、サイズ 200 シリンダー、CGA-296</td></tr><tr><td>レギュレータ</td>ー <td>エアガス株式会社</td><td>Y11244D296-AG</td><td>単段真鍮 0-100 psi 分析シリンダーレギュレーター CGA-296 針出口付き。真ちゅう製の調整可能なエアラインパイプバルブを使用して、内径3/8インチ、レギュレーターに接続されたビニールエアラインチューブから3/16インチ、エアストーンまたはガラスパスツールピペットへのエアライン接続に移動します。</td></tr><tr><td>調整可能なエアラインパイプバルブ</td><td>ドクターズ・フォスター&スミス</td><td>CD-12061</td><td>真鍮製バルブ</td></tr><tr><td>硬質テーブル</td><td>不明 不明</td><td>頑丈な</td><td>テーブルの上に敷設されたオートクレーブドア。直径5インチのテニスボール9個がテーブルの上面から振動を遮断します。</td></tr><tr><td>5インチテニスボール</td><td>Petco Animal Supplies, Inc.</td><td>712868</td><td>Petco Jumbo Pet Tennis Ball: ボールはスライスされず、オートクレーブ ドアの下側にある一体型フレーム内に保持されます。</td></tr><tr><td>代替除振テーブル</td><td>ニューポートコーポレーション</td><td>INT1-36-6-N</td><td>硬質振動制御システム、完全性 1: 表面寸法、3' x 6'</td></tr><tr><td>ジンバル</td><td>ISI、International Scientific Instruments, Inc.</td><td>SUPER III-AスキャニングEM5</td><td>軸ユーセントリックステージからのステージ:X、Y、Zの直線運動、&plusmn;20 mm、0.1 mmの精度。回転、垂直、およびプラス。10&deg;、および水平、&plusmn;12.5°C、1.25°C;精度。注:デコミッション機器から。</td></tr><tr><td>ジンバル用チャック</td><td></td><td></td><td>不明 製造不明の古いミクロトームから、スキャニングEMステージ</td></tr><tr><td>代替ジンバル</td><td>ThorLabs, Inc.</td>の試料ホルダーのシャフトに合うように機械加工されました。<td>GN2/M with MBT602/M</td><td>3軸マイクロブロックステージに搭載された蝶ネジアジャスター付(MBT602/M)2軸ゴニオメーター(GN2/M):ゴニオメーター上面12.7mm(回転点までの距離)に亀の頭を目で保持するチャックを設計</td></tr>ビデオ<tr><td>ベースのアイトラッキングシステム</td><td>Arrington Research, Inc.</td><td>ViewPoint EyeTracker、PC-60</td><td>追跡方法:暗い瞳孔による赤外線ビデオ。白黒カメラ(アイテムBC02):30 Hz、640 x 480;システム要件:Windows 2000、XP、7、8、8.1、10;視認範囲:水平+/- 44&deg;;垂直 +/- 20&deg;;精度 ~0.5&deg;;空間分解能 ~0.15&deg;;瞳孔サイズ解像度 ~0.03 mm;目のデータ:視線のX、Y位置、瞳孔の高さと幅、ねじれ、デルタ時間、合計時間、および関心領域(ROI)。リアルタイム通信(アイテム0022):データファイルにコードをマークするための8つのTTL入力チャネルを備えた4チャンネルAnalogOut</td></tr>マルチ<tr><td>ポジション磁気ベース</td><td>Harbor Freight Tools</td><td>Pittsburg、アイテム#5645</td><td>磁気ホルダーは最大12インチに達し、45ポンドの磁気プルを生成します。カメラの位置に使用します。ロッドの端にネジ穴を開けて、カメラを取り付けます。</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>Kopf</td><td>900</td><td>5軸マニピュレーション 吸引電極のマウント用:X、Y、Zリニアトラベル、2軸回転</td></tr><tr><td>ブームの解剖スコープ</td><td>Lieca</td><td>GZ6</td><td>倍率範囲、6.7倍 &ndash; 40倍</td></tr><tr><td>神経/筋肉刺激装置</td><td>Astro-Med Grass テレファクター</td><td>グラス S88</td><td>デュアルパルス電圧刺激装置:2つの出力チャンネルを独立して動作させることも、同期させて非絶縁定電圧パルス(10 mv〜150 V)も生成できます。パルスは単一(10 &mu;sec から 10 sec)、反復 (0.01 Hz から 1 KHz)、およびトレイン (1 ms から 10 秒) で、TTL 入力と出力と同期しています。DB25コネクタの出力チャンネルを介してTTL出力をViewPoint EyeTrackerのTTL入力チャンネルに送信します。注:Astro-Med Grass Telefactorは販売を終了しました。</td></tr><tr><td>電流遮断装置</td><td>Astro-Med Grass Telefactor</td><td>PSIU6</td><td>電流刺激遮断ユニット:S88による定電流の安全な供給を可能にします。PSIU6は、BNCケーブルでS88の出力チャンネルの1つに接続します。PSIU6の乗算器スイッチにより、S88は0.1〜マイクロの範囲の幅広い電流振幅を生成できます。Aから15mA。</td></tr><tr>分離<td>A-Mシステム</td><td>2100</td>分離パルス刺激装置を備えた<td>代替神経/筋肉刺激装置</td><td>:ユニットには、一定の電流を生成するためのアイソレータが内蔵されています。</td></tr></tbody></table>

カメの中で脳神経のin vitro刺激を用いて眼球運動

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

動物を安楽死させた後死ぬこと彼らの組織を始めます。温血脊椎動物と比べると、カメは彼らの組織の長期生存時間のため利点を提供しています。このため、彼らのターゲットの行動の神経信号を調査する時間の延長期間のカメでの in vitro実験を実行できます。分離ヘッド準備を使用して、カメ、眼球運動の運動を測定したし、脳神経によって運ばれる電気信号によって彼らの変調。脳が頭蓋骨から削除されたり、脳神経のインスタンスはそのままにして、この切り裂かれた頭は眼球運動を調整するジンバルに置かれました。ガラス電極は、脳神経に接続されていた (眼球運動, 滑車神経, と外転)、眼球運動を喚起する電流で刺激。赤外線ビデオ システムと目の定量化された回転を追跡眼球運動を監視しました。電流パルス振幅、周波数の範囲と、電車の時間が応答に及ぼす影響を観察するために使用されました。準備は脳から切り離されているため筋ターゲットに遠心性経路を一元的に処理された感覚情報の欠如の神経シグナリングを調査する単独で調べることができます。

図 1は、解剖を説明するビデオから撮影した画像の静止画を示しています。画像は、前に切断し、脳からの神経の代表的な場所を提供します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56864/56864fig1.jpg"> 図 1: 解剖のビデオからキャプチャしたイメージの (nII) 視神経、動眼神経 (nIII)、滑車神経節 (nIV) および外転神経 (nVI) の位置を表示する静止画.(A) イメージ脳、髄膜を除去した後のラベルの付いた領域を持つ。白のスケール バー = 10 mm。 (B) ショーの画像の場所新居、nIII、そしてわたし (後大脳の嗅球の除去)、中脳の右側に接続します。(C</...

このプロトコルでは、目の動きの運動を測定するため体外に分離されたカメ頭の準備を使用する方法について説明します。頭蓋から脳を除去した後回転目と瞳孔径の変化を定量化する電流脳神経を刺激することができます。

カメの中で脳神経のIn Vitro刺激を用いて眼球運動

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when ...

この電気生理学的プロトコルの全体的な目標は、in vitroで単離された頭部調製物を使用して、アカミミガメの眼球運動の運動学を測定する能力を提供することです。この方法は、カメの視覚がどのように進化したかなど、眼球運動分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、動物がターゲットを追跡するために訓練する必要がなく、ジンバルを使用して目の動きを調整することです。この手法を実証しているのが、私の研究室の学部生である Steven Nesbit です。解剖皿の中のカメの頭から始めます。組織を洗浄するのに十分なタートルリンガー溶液を手元に用意してください。皿の外側に氷を置いて、組織を摂氏4度に保ちます。鈍い解剖プローブを口に通して、頭の取り扱いを容易にします。次に、解剖顕微鏡で作業しながら、歯の骨と頭蓋骨をつなぐ関節をメスで切断します。次に、ロンゲールを使用して下顎を頭蓋骨から引き離します。次に、頭蓋骨の背側と外側の領域にある皮膚と筋肉のアタッチメントから引き抜きます。頭蓋骨の空洞端にある脊柱を特定した後、脊柱を腹側に曲げて脊髄を露出させ、マイクロハサミを使用して脊髄を切り取ります。ロンゲールを使用して、尾側に引っ張ることにより、頭蓋骨から脊柱やその他の組織を取り除きます。次に、大孔から始めて背側頭蓋骨に2つの表面的な切り込みを入れ、背側頭蓋骨を慎重に引き抜きます。マイクロハサミを使用して髄膜を取り除き、脳の残りの部分を露出させます。前頭蓋腔内の嗅球を識別できるように、十分な髄膜を取り除きます。.必要に応じて、タートルリンガー溶液で脳の洗浄を続けます。次に、湾曲した鉗子を使用して大脳をゆっくりと尾側に引っ張り、脳神経にわずかな張力をかけます。湾曲した鉗子で嗅球と大脳を丁寧に切り取り除きます。次に、マイクロハサミを使用して中脳を正中線に向かって優しく押し、脳神経を露出させます。脳神経3は、脳神経4の前に見ることができます。神経4の直径は神経3よりもわずかに小さいです。次に、視神経の左右の乗り物、または脳神経を2つ切断します。神経3と4を切断し、中脳に付着します。これを反対側で繰り返します。脳幹を片側に傾け、橋と髄質の接合部近くの腹面から出てくる外転神経である脳神経6を観察します。脳神経を左右ともに6本切除します。細かい鉗子とマイクロハサミで脳幹の残りの部分を頭から取り除きます。頭蓋骨が空になったら、頭蓋腔の床を調べて、神経3、4、および6を特定します。最後に、細かい鉗子とマイクロハサミで上まぶたと下まぶたを取り除きます。タートルヘッドをジンバルチャックに入れます。次に、小さな水準器を使用して、頭の背側表面が地平線と平行であることを確認します。片方の目をジンバルの水平回転と垂直回転の中心に配置します。赤外線カメラを目の視線から45度上に傾けます。赤外線LE

ocular-kinematics-measured-vitro-stimulation-cranial-nerves

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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