Cristallizzazione delle proteine
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Visão Geral
La cristallizzazione delle proteine, ottenendo un reticolo solido di biomolecole, chiarisce la struttura delle proteine e consente lo studio della funzione proteica. La cristallizzazione comporta l’essiccazione di proteine purificate sotto una combinazione di molti fattori, tra cui pH, temperatura, forza ionica e concentrazione proteica. Una volta ottenuti i cristalli, la struttura proteica può essere chiarita mediante diffrazione a raggi X e calcolo di un modello di densità elettronica.
Questo video introduce la cristallizzazione delle proteine e mostra una procedura generale. L’espressione e la purificazione delle proteine, la cristallizzazione e la diffrazione a raggi X sono trattate nella procedura. Le applicazioni della cristallizzazione delle proteine includono la progettazione di farmaci in silico, la determinazione del sito di legame e l’analisi della struttura proteica di membrana.
La cristallizzazione delle proteine è il processo per ottenere una forma solida reticolo di una proteina. Questi cristalli sono particolarmente preziosi per i biologi strutturali, assistendo nello studio della funzione proteica. Altre tecniche, come le specifiche di massa o SDS-PAGE, possono solo fornire informazioni sulla struttura unidimensionale delle proteine. La cristallizzazione delle proteine è completata dalle tecniche di espressione proteica ricombinante e diffrazione a raggi X. Questo video mostrerà i principi della cristallizzazione delle proteine, una procedura di laboratorio generale e molte delle sue applicazioni in campo biochimico.
Il primo passo richiesto nel processo è quello di ottenere quantità di milligrammi di proteine molto pure, in genere utilizzando l’espressione proteica ricombinante. Il gene corrispondente alla proteina di interesse viene clonato in un vettore di espressione e la proteina espressa viene fusa in un tag di affinità, come la poli-istidina, per aiutare nella purificazione mediante cromatografia di affinità. Per saperne di più, guarda il video di questa raccolta sulla cromatografia di affinità.
La formazione della proteina purificata in cristalli dipende dalla corretta combinazione di molti fattori, tra cui pH, forza ionica, concentrazioni di precipitante e proteine, temperatura e velocità di equilibrio. Il metodo più comune utilizzato è la diffusione del vapore, di cui esistono due categorie: goccia sospesa e goccia seduta. Una goccia contenente proteine pure, tampone e precipitante, che è un solido ionico che lega le molecole d’acqua, riducendo la disponibilità di acqua per la proteina e imitando una maggiore concentrazione proteica, si trova in un microwell chiuso con un serbatoio con una miscela più altamente concentrata dello stesso tampone e precipitante. All’inizio, le concentrazioni di proteine e precipitanti sono troppo basse per causare la cristallizzazione. Durante il corso dell’esperimento, l’acqua vaporizza dalla goccia e si raccoglie nel serbatoio; una diminuzione della quantità di acqua nella goccia fa sì che il sistema diventi supersaturo e può verificarsi la nucleazione, seguita dalla cristallizzazione. Il trasferimento netto di acqua dalla goccia è in equilibrio e il sistema viene mantenuto fino al completamento del processo.
Per visualizzare la struttura 3D, viene utilizzata la diffrazione a raggi X. Per ottenere dati a raggi X da un cristallo, viene posto in un fascio di raggi X monocromatico, dove è esposto al fascio a tutti gli angoli. Ogni esposizione fornisce un’immagine, in cui ogni punto è una radiografia diffratta, che emerge dal cristallo e viene registrata da un rilevatore. I dati sono combinati per produrre un modello della disposizione degli atomi all’interno del cristallo. La struttura cristallina risultante dimostra il posizionamento tridimensionale degli atomi, con una risoluzione tipica di 2 angstrom.
Ora che abbiamo coperto i principi della cristallizzazione delle proteine, diamo un’occhiata a un protocollo generalizzato.
Per iniziare la procedura un vettore di espressione contenente il gene di interesse viene trasformato in cellule. Le cellule vengono incubate e nella fase mid-log, l’espressione viene avviata aggiungendo un induttore, come IPTG, che innesca la trascrizione dell’mRNA del gene. Dopo l’espressione proteica, il materiale grezzo viene sospeso in un tampone di lisi e quindi chiarito mediante centrifugazione.
Il lisirato chiarificato viene quindi caricato su una colonna di nichel e la proteina marcata con poliistidina si lega alla colonna mentre tutte le altre biomolecole vengono lavate via.
Una volta ottenuti diversi milligrammi di proteina pura, è pronto per la cristallizzazione mediante diffusione del vapore. Un vassoio a goccia sospeso / seduto a 24 pozzetta è riempito con concentrazioni variabili di soluzioni tampone di cloruro di sodio e acetato di sodio. Per il metodo della goccia seduta, volumi uguali di proteine e soluzione di serbatoio vengono pipettati sul ripiano sopra ciascun pozzo, quindi il vassoio viene coperto con nastro trasparente. Il vassoio viene quindi posto in una camera di incubazione e i pozzedi vengono monitorati per la crescita il giorno seguente, quindi ogni pochi giorni.
Una volta ottenuto un cristallo adeguato, è pronto per l’analisi della diffrazione a raggi X. Il cristallo è montato su un goniometro per posizionare il cristallo agli orientamenti selezionati. Il cristallo è illuminato con un fascio monocromatico di raggi X a tutti gli angoli, producendo un modello di diffrazione. Il software converte le immagini bidimensionali, scattate con diversi orientamenti, in un modello tridimensionale della densità degli elettroni all’interno del cristallo determinando le posizioni degli atomi nel cristallo.
Ora che abbiamo esaminato una procedura, esaminiamo alcune utili applicazioni della cristallizzazione delle proteine e un’altra tecnica di cristallizzazione.
La cristallizzazione delle proteine può essere utilizzata per la progettazione di farmaci in silico. La struttura tridimensionale della proteina base 2 della polimerasi del virus dell’influenza, che è stata collegata all’infezione virale nei mammiferi, è stata determinata dalla cristallizzazione e dalla diffrazione a raggi X. Vengono visualizzati potenziali siti di legame nella proteina e, con l’uso di un programma di aggancio, è stata progettata una molecola tridimensionale che si inserirebbe in una fessura nella proteina.
Anche la co-cristallizzazione di complessi proteina-DNA è una tecnica utile. Le proteine leganti il DNA modulano un’ampia varietà di funzioni biologiche come la trascrizione e la polimerizzazione del DNA e la riparazione del DNA; e le strutture cristalline di questi complessi possono fornire informazioni sulla funzione, sul meccanismo e sulla natura dell’interazione specifica. La proteina E. coli SeqA, un regolatore negativo della replicazione del DNA, è stata co-cristallizzata con DNA emimetilato.
Le proteine di membrana integrali come i recettori accoppiati alla proteina G, o GCPR, sono difficili da cristallizzare a causa della loro quantità limitata di superficie polare disponibile per la formazione di contatti reticolari cristallini, che ha portato allo sviluppo della cristallizzazione proteica assistita da proteine di fusione. I geni che codificano per il recettore adrenergico β2, un GCPR e un lisozima sono stati inseriti in un vettore di espressione. La cristallizzazione della proteina di fusione β2AR-lisozima è stata ottenuta a causa dell’aumento della superficie idrofila extracellulare sul β2AR naturalmente idrofobo, fornito dal lisozima, necessario per formare interazioni di imballaggio nel reticolo cristallino.
Hai appena visto il video di JoVE sulla cristallizzazione delle proteine. Questo video ne descrive i principi, un protocollo generalizzato e alcuni dei suoi usi in campo biomedico. Grazie per l’attenzione!
Procedimento
Declarações
Transcrição
Protein crystallization is the process of obtaining a latticed solid form of a protein. These crystals are especially valuable to structural biologists, assisting in the study of protein function. Other techniques, such as mass spec or SDS-PAGE, can only provide information on the one-dimensional structure of proteins. Protein crystallization is complemented by the techniques of recombinant protein expression and x-ray diffraction. This video will show the principles of protein crystallization, a general laboratory procedure, and several of its applications in the biochemical field.
The first step required in the process is to obtain milligram quantities of very pure protein, typically using recombinant protein expression. The gene corresponding to the protein of interest is cloned into an expression vector, and the expressed protein is fused to an affinity tag, such as poly-histidine, to assist in the purification by affinity chromatography. To learn more, see this collection’s video on affinity chromatography.
Formation of the purified protein into crystals is dependent on the proper combination of many factors, including pH, ionic strength, concentrations of precipitant and protein, temperature, and rate of equilibration. The most common method used is vapor diffusion, of which there are two categories: hanging drop and sitting drop. A droplet containing pure protein, buffer, and precipitant, which is an ionic solid that binds water molecules, reducing water availability for the protein and mimicking higher protein concentration, is in an enclosed microwell with a reservoir with a more highly concentrated mixture of the same buffer and precipitant. At the beginning, the concentrations of protein and precipitant are too low to cause crystallization. During the course of the experiment, water vaporizes from the droplet and collects in the reservoir; a decrease in the amount of water in the droplet causes the system to become supersaturated, and nucleation, followed by crystallization, can occur. The net transfer of water from the droplet is in equilibrium, and the system is maintained until the process is complete.
To visualize the 3D structure, x-ray diffraction is used. To obtain x-ray data from a crystal, it is placed in a monochromatic x-ray beam, where it is exposed to the beam at all angles. Each exposure provides an image, where each spot is a diffracted x-ray, which emerges from the crystal and is registered by a detector. The data are combined to produce a model of the arrangement of atoms within the crystal. The resulting crystal structure demonstrates the 3-dimensional placement of the atoms, with a typical resolution of 2 angstroms.
Now that we have covered the principles of protein crystallization, let us look at a generalized protocol.
To begin the procedure an expression vector containing the gene of interest is transformed into cells. The cells are incubated and at mid-log phase, expression is initiated by adding an inducer, such as IPTG, which triggers transcription of the gene’s mRNA. After protein expression, the crude material is suspended in lysis buffer, and then clarified by centrifugation.
The clarified lysate is then loaded onto a nickel column, and the polyhistidine-tagged protein binds to the column while all other biomolecules are washed away.
Once several milligrams of pure protein have been obtained, it is ready for crystallization by vapor diffusion. A 24-well hanging/sitting drop tray is filled with varying concentrations of sodium chloride and sodium acetate buffer solutions. For the sitting drop method, equal volumes of protein and reservoir solution are pipetted onto the shelf above each well, and then the tray is covered with transparent tape. The tray is then placed in an incubation chamber, and the wells are monitored for growth the following day, then every few days.
Once a proper crystal has been obtained it is ready for x-ray diffraction analysis. The crystal is mounted on a goniometer to position the crystal at selected orientations. The crystal is illuminated with a monochromatic beam of x-rays at all angles, producing a diffraction pattern. The software converts the two-dimensional images, taken at different orientations, to a three-dimensional model of the density of electrons within the crystal by determining the positions of the atoms in the crystal.
Now that we have reviewed a procedure, let’s review some useful applications of protein crystallization, and another crystallization technique.
Protein crystallization may be used for in silico drug design. The three-dimensional structure of Influenza virus’s polymerase basic protein 2, which has been linked to viral infection in mammals, was determined by crystallization and x-ray diffraction. Potential binding sites in the protein are visualized, and with the use of a docking program, a three-dimensional molecule was designed that would insert into a cleft in the protein.
Co-crystallization of protein-DNA complexes is also a useful technique. DNA-binding proteins modulate a wide variety of biological functions such as transcription and DNA polymerization and DNA repair; and crystal structures of these complexes can provide insight into protein function, mechanism, and the nature of the specific interaction. The E. coli protein SeqA, a negative regulator of DNA replication, was co-crystallized with hemimethylated DNA.
Integral membrane proteins such as G-protein coupled receptors, or GCPRs, are difficult to crystallize due to their limited amount of polar surface area available for forming crystal lattice contacts, which has led to the development of fusion-protein-assisted protein crystallization. Genes encoding β2 adrenergic receptor, a GCPR, and a lysozyme were inserted into an expression vector. The crystallization of the β2AR- lysozyme fusion protein was achieved due to the increased extracellular hydrophilic surface over the naturally hydrophobic β2AR, provided by the lysozyme, necessary for forming packing interactions in the crystal lattice.
You’ve just watched JoVE’s video on protein crystallization. This video described its principles, a generalized protocol, and some its uses in the biomedical field. Thanks for watching!
