Espectrometría de masas MALDI-TOF
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Visão Geral
Ionización de la desorción del laser asistida por matriz (MALDI) es una fuente de iones espectrometría de masas ideal para el análisis de biomoléculas. En lugar de radiaciones ionizantes compuestos en estado gaseoso, las muestras son embebidas en una matriz, que es golpeada por un láser. La matriz absorbe la mayoría de la energía; entonces algo de esta energía se transfiere a la muestra, que se ioniza como resultado. Los iones de la muestra pueden identificarse entonces con un analizador de tiempo de vuelo (TOF).
Este video cubre principios de MALDI-TOF, incluyendo selección de matriz y cómo TOF se utiliza para aclarar relaciones masa / carga. Este procedimiento muestra la preparación de una placa MALDI, la carga de muestras en la placa y la operación del espectrómetro de masas TOF. En la sección final, aplicaciones y variaciones se muestran, incluyendo análisis de celulares, caracterización de muestras biológicas complejas e ionización del electrón spray.
Ionización de desorción láser asistida por matriz MALDI, es una fuente de iones espectrometría de masas ideal para el análisis de biomoléculas. Más fuentes de iones quitar información estructural de biomoléculas grandes, frágiles. MALDI mantiene la integridad estructural y por lo tanto información, aceleración de las moléculas en el analizador de masas, que separa los compuestos basados en el tamaño y la carga. El más comúnmente junto con MALDI es el tiempo de vuelo o TOF, analizador de la masa. Este video le mostrará los conceptos de MALDI ionización, un procedimiento general y algunas de sus aplicaciones en bioquímica.
Para espectrometría de masas a función, deben ser ionizadas las moléculas en estado gaseoso. En MALDI, la muestra está incrustada en una matriz, normalmente un orgánico compuesto que contienen aromáticos y conjugado enlaces dobles.
Cuando un pulso de láser esta mezcla la matriz absorbe la mayoría de la energía, rápidamente se calienta y es desorbida o liberado, de la superficie. La matriz de energía transfiere algo de su energía a las biomoléculas, desorbing y luego les ionizante.
MALDI se empareja típicamente con un tiempo de vuelo o TOF, analizador de la masa. Un campo eléctrico se aplica energía cinética a los iones, moviéndose en una región libre de campo llamada tubo de la deriva. La velocidad de los iones como se mueven a través del tubo está relacionado con su relación masa / carga, para que partículas más pesadas viajan más lentamente a través del instrumento. Un detector en el extremo del tubo mide el tiempo de vuelo de cada ion. Con este conocimiento, así como la longitud del tubo y la fuerza de campo aplicado, la relación masa / carga de cada ion puede ser aclarada.
Esta parcela de la intensidad de la señal a masa-de-carga-ratio, conocido como espectro de masa, puede ser comparado con una biblioteca de espectros recogidos. Si no encuentra ninguna coincidencia, puede las moléculas pueden ser identificados por otras técnicas, como la espectrometría total en tándem. Para obtener más información, vea el vídeo de la colección sobre el tema.
Ahora que se han discutido los fundamentos de la MALDI-TOF, veamos el proceso en el laboratorio.
Antes de comenzar un experimento, es importante considerar la elección de la matriz de que muestras se ser desorbidas. Debe absorber la energía del láser, sea estable en el vacío, no reaccionan con las moléculas blanco y ser capaces de desorción. Dependiendo de la muestra, se prefieren los diferentes matrices. Para una proteína grande, una combinación de CHCA y DHB ha demostrado mejor separación de los picos, llamado resolución, que las matrices individuales.
Hay un número de maneras de preparar las muestras. Mostraremos lo que se conoce como la “doble capa” o “sandwich”, método. Para empezar, limpie la placa MALDI con reactivos ultra puras, como la espectrometría de masas es muy sensible a la contaminación. Secar la placa con una corriente de gas inerte.
A continuación, una solución saturada de la matriz se hace típicamente con un disolvente orgánico. La solución se trata la placa MALDI y se seca. Una segunda solución saturada de matriz que contienen ácido trifluoroacético, TFA, está preparada. TFA ayuda a los iones en la fase gaseosa.
A continuación, se agrega la solución de la muestra sobre el lugar de secado de la matriz. Añadir la solución de la matriz que contiene TFA encima de la muestra, de tal modo completar la matriz de “sandwich”. Homogeneidad del punto puede ser verificado bajo un microscopio de baja potencia.
Un estándar de calibración, que es una mezcla con una amplia gama de masas conocidas y se utiliza para correlacionar el tiempo de vuelo de m/z de la placa. Por último, la placa de la matriz sola como control negativo.
Para analizar los puntos, coloque la placa de la blanco en el instrumento. No Asegúrese de residuos presentes, lo que permite la formación de un vacío apretado. En el software, seleccione el control estándar, negativo y muestras de interés. Los puntos con la correcta identificación de la etiqueta.
Los voltajes de la fuente y la lente de ion pueden ser manipulados para mejorar el rendimiento del análisis. Esto dependerá de las características del instrumento y la muestra. En el lugar estándar y calibrar el instrumento con el software.
A continuación, recoger espectros de cada uno de los puntos de muestra. Pruebe algunos lugares diferentes en el mismo lugar para maximizar la calidad de los datos recogidos. Una vez terminado, la placa MALDI puede ser recogida y reutilizada después de la limpieza.
Ahora que hemos revisado un procedimiento, Veamos algunas de las maneras que MALDI se utiliza y una técnica de ionización diferentes.
Además de biomoléculas, MALDI puede utilizarse para analizar las células vivas. Los macrófagos son las células inmunes que toman una de varias formas diferentes, basadas en su microambiente. Después de exponer las células a varios señalización moléculas, o citoquinas, pueden ser añadidos directamente a la placa y analizados. Los espectros MALDI pueden utilizarse como únicas “huellas digitales”, dependiendo de la citocina utilizado.
Muestras biológicas complejas como las secreciones sebáceas mamíferas requieren un paso de purificación antes del análisis MALDI. Cromatografía en capa fina es una tal técnica que depende de la polaridad de los componentes. Los compuestos son recogidos desde la coronilla de TLC, purificados y transferidos a una matriz MALDI. Los espectros resultantes verificar la identidad y pureza de las biomoléculas separadas de las secreciones sebáceas mamíferas.
Otra fuente de ion común por biomoléculas es ionización electrospray ESI. En este método, la muestra se inyecta en el instrumento, donde se aplica un alto voltaje, creando un aerosol de gotas cargadas. Como se evapora el solvente en la gota, la carga se mueve a las moléculas de la muestra, hasta que son completamente gaseosos. ESI no requiere el procedimiento de localización, y la muestra se puede inyectar directamente en el instrumento. Por otro lado, ESI es más sensible a la presencia de componentes buffer y otros contaminantes, MALDI es más robusto.
Sólo has visto video de Zeus en espectrometría de masas MALDI. Este video describe la teoría detrás del instrumento, fue un procedimiento general y cubre algunos de los usos de la técnica. ¡Gracias por ver!
Procedimento
Declarações
Transcrição
Matrix-assisted laser desorption ionization, or MALDI, is a mass spectrometry ion source ideal for the analysis of biomolecules. Most ion sources remove structural information from large, fragile biomolecules. MALDI maintains structural integrity, and therefore information, while accelerating the molecules into the mass analyzer, which separates the compounds based on size and charge. The most commonly coupled with MALDI is the time of flight, or TOF, mass analyzer. This video will show the concepts of MALDI ionization, a general procedure, and some of its uses in biochemistry.
For mass spectrometry to function, molecules must be ionized into the gaseous state. In MALDI, the sample is embedded in a matrix, typically an organic compound containing aromatic and conjugated double bonds.
When a laser pulse strikes this mixture the matrix absorbs the majority of the energy, rapidly heats, and is desorbed, or released, from the surface. The energized matrix transfers some of its energy to the biomolecules, desorbing and then ionizing them.
MALDI is typically paired with a time of flight, or TOF, mass analyzer. An electric field applies kinetic energy to the ions, moving them into a field-free region called a drift tube. The velocity of the ions as they move through the tube is related to their mass-to-charge ratio, so heavier particles travel slower through instrument. A detector at the end of the tube measures each ion’s flight time. With this knowledge, as well as the tube length and applied field strength, the mass-to-charge ratio of each ion can be elucidated.
This plot of signal intensity to mass-to-charge-ratio, known as a mass spectrum, can be compared to a library of collected spectra. If no matches are found, it can molecules can be identified by further techniques, such as tandem mass spectrometry. For more information, see this collection’s video on the topic.
Now that the basics of MALDI-TOF have been discussed, let’s look at the process in the laboratory.
Before beginning an experiment, it’s important to consider the choice of matrix from which samples will be desorbed. It must absorb the laser energy, be stable in a vacuum, not react with the target molecules, and be able to desorb. Depending on the sample, different matrices are preferred. For a large protein, a combination of CHCA and DHB has shown better separation of the peaks, called resolution, than the individual matrices.
There are a number of ways to prepare samples. We’ll show what is known as the “double-layer”, or “sandwich,” method. To begin, clean the MALDI plate with ultra-pure reagents, as mass spectrometry is very sensitive to contamination. Dry the plate with a stream of inert gas.
Next, a saturated matrix solution is made, typically with an organic solvent . The solution is streaked onto the MALDI plate and dried. A second saturated solution of matrix containing trifluoroacetic acid, or TFA, is prepared. TFA helps ions into the gaseous phase.
Next, the sample solution is added on top of the dried matrix spot. Add the matrix solution containing TFA on top of the sample, thereby completing the matrix “sandwich”. Homogeneity of the spot can be verified under a low-powered microscope.
Plate a calibration standard, which is a mixture with a wide range of known masses and is used to correlate the time-of-flight to m/z. Finally, plate the matrix alone as a negative control.
To analyze the spots, place the target plate into the instrument. Ensure there’s no debris present, allowing for the formation of a tight vacuum. In the software, select the standard, negative control, and samples of interest. Label the spots with the correct identification.
The ion source and lens voltages can be manipulated to improve performance of the analysis. This will depend on the specifics of the instrument and sample. Focus on the standard spot and calibrate the instrument with the software.
Next, collect spectra from each of the sample spots. Try a few different locations on the spot to maximize the quality of the collected data. Once finished, the MALDI plate can be collected and reused after cleaning.
Now that we’ve reviewed a procedure, let’s look at some of the ways MALDI is utilized, and a different ionization technique.
In addition to biomolecules, MALDI can be used to analyze living cells. Macrophages are immune cells that take on one of several different forms, based on their microenvironment. After exposing the cells to various signaling molecules, or cytokines, they can be added directly to the plate, and analyzed. The MALDI spectra can be used as unique “fingerprints”, depending on the cytokine used.
Complex biological samples like mammalian sebaceous secretions require a step of purification before MALDI analysis. Thin layer chromatography is one such technique that relies on the components’ polarity. The compounds are collected from the TLC pate, purified, and transferred to a MALDI matrix. The resulting spectra verify the identity and purity of the separated biomolecules from the mammalian sebaceous secretions.
Another common ion source for biomolecules is electrospray ionization, or ESI. In this method, the sample is injected into the instrument, where a high voltage is applied, creating an aerosol of charged droplets. As the solvent in the droplet evaporates, the charge is moved to the sample molecules, till they are completely gaseous. ESI doesn’t require the spotting procedure, and the sample can be injected directly into the instrument. On the other hand, ESI is more sensitive to the presence of buffer components and other contaminants, meaning MALDI is more robust.
You’ve just watched JoVE’s video on MALDI mass spectrometry. This video described the theory behind the instrument, went over a general procedure, and covered some of the uses of the technique. Thanks for watching!
