Name: Produção e purificação de Baculovirus para aplicação de terapia gênica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Aprenda a produzir e purificar baculovirus em cultura de células Sf9 usando cromatografia de afinidade com heparina e ultracentrifugação. Este método elimina contaminantes celulares para aplicações seguras em terapia gênica.

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Este trabalho é apoiado em parte financiando o start-up de Cincinnati infantil Research Foundation (CCRF) M.N. e inovador núcleo Grant (ICG) apoiado pelo centro nacional para Ciências translacionais avançando do National Institutes of Health, sob Prêmio número UL1 TR001425. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.

Veja a Figura 1 para uma ilustração resumindo o protocolo.
1. purificação de Baculovirus plasmídeo
<ol><li>Crescer a cultura bacteriana contendo baculoviral Plasmideo DNA (bacmid)14 em 200 mL de caldo LB com antibióticos; canamicina (50 µ g/mL), tetraciclina (10 µ g/mL) e gentamicina (7 µ g/mL), para 16 h a 37 ° C, em um cenário de agitador orbital a 300 rpm.</li>
	<li>Purificar o bacmid DNA da cultura bacteriana usando lise alcalina padrão protocolo15e dissolver o bacmid em tampão TE.</li>
</ol>2. produção de Baculovirus
<ol><li>Células de cultura Sf9 em uma incubadora de agitador orbital a 135 rpm e 28 ° C, em um frasco de Erlenmeyer contendo meio de cultura livre de soro inseto1,2,3de policarbonato. Nota: Se Sf9 células são descongeladas de estoque congelado, deixe pelo menos duas semanas para as células para recuperar e digite a fase exponencial de crescimento.</li>
	<li>Conte as células de Sf9 colhidas na fase exponencial de crescimento com um hemocytometer após coloração com azul de Tripan. 1 x 106 células viáveis Sf9 por alvéolo em uma placa de cultura de tecidos tratados 6-poços em 2 mL do meio da semente. Permitir que a célula anexar por 1h a 28 ° C em uma incubadora.</li>
	<li>Substitua o meio de crescimento com 1 mL de meio de cultura de livre de soro unsupplemented Grace inseto.</li>
	<li>Transfect o bacmid de DNA nas células Sf9 usando o reagente de Transfeccao de células de inseto.<ol>
<li>Mix 8 µ l célula inseto reagente de transfeccao com 100 µ l de meio de inseto da Grace.</li>
		<li>Diluir 2 µ g de bacmid DNA em 100 µ l de meio unsupplemented de insetos e misture suavemente pela utilização do vortex.</li>
		<li>Combinar o DNA diluído com o reagente de Transfeccao de célula inseto diluídos e misture delicadamente. Incube durante 15 a 30 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Adicione a mistura de DNA-lipídico gota a gota sobre as células. Incube a 28 ° C em uma incubadora para aproximadamente 5h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire a mistura de transfecção de células e lavar as células com 2 mL de PBS.</li>
	<li>Adicionar 2 mL de meio de cultura de inseto e continuar a cultura a 28 ° C em uma incubadora, sem alterar a mídia. Nota: Se o bacmid contém uma proteína fluorescente, sua expressão pode ser detectado em transfeccao pós de células 48 h. Baculoviridae é produzido por células transfectadas de Sf9 e secretada para o meio de cultura que posteriormente infecta as células untransfected. A população de toda a célula torna-se infectado com baculovirus em 5 dias e mostra sinais de infecção viral, também chamado de efeito citopático. Estes incluem o diâmetro maior célula, vacúolos/grânulos no citoplasma, cessação do crescimento celular e células mortas ou lisadas estão presentes na cultura de pilha. No entanto, se a eficiência da transfecção ou infecção não é o ideal, a cultura não pode apresentar um efeito citopático óbvio. O efeito citopático pode ser visualizado com um microscópio de fase invertido na ampliação de X 200-400. Célula de Baculovirus infectado pode ser detectada pela coloração com de anticorpo anti-gp6411.</li>
	<li>Colheita de baculovirus sobrenadante 5 dias depois transfection e rótulo como o estoque de vírus1 P.</li>
	<li>Armazene o baculovirus sobrenadante, que é sensível à luz, no escuro, com 0,5% albumina de soro bovino (BSA) em PBS. Armazenar a 4 ° C para o curto prazo (até 90 dias) ou a-80 ° C para o longo prazo.</li>
	<li>Semente 6 × 106 Sf9 células em uma placa de cultura de tecidos tratados 10 cm em 10 mL de meio de cultura de insetos. Adicione 1 mL do sobrenadante inicial baculovirus (P1) para as células.</li>
	<li>Colheita de baculovirus sobrenadante (P2) em 5 pós-infecção dia deth .</li>
	<li>50 mL de Sf9 células (3 x 106 células/mL) na cultura de suspensão em meio de cultura inseto em um policarbonato 250 mL frasco Erlenmeyer e coloque o frasco em uma incubadora de agitador orbital de semente. Adicionar 2 mL de caldo de2 P para as células e agitar a 135 rpm, mantendo uma temperatura constante de 28 ° C. Nota: Três ou quatro dias após a infecção, toda a população de células Sf9 mostrará o efeito citopático, que é uma indicação de baculovirus sendo o título de alta produção.</li>
	<li>Sequencialmente, amplificar os sobrenadantes de baculovirus até o volume desejado é obtido (P.3, P4,...), aumentando 10 a 50-fold volume de cultura de células em cada infecção subsequente. Nota: P3 é o 3rd redondo de infecção em qual 500 mL para 1 L de Sf9 cultura celular pode estar infectada com 10 a 20 mL de P2 baculovirus sobrenadante; P4 é 4th redondo de infecção em que 5 a 10 L de Sf9 cultura celular pode estar infectada com 100 a 200 mL do sobrenadante de baculovirus P3 e assim por diante. Normalmente, as células Sf9 são semeadas em 3 × 106 células/mL em meios de cultura livre de soro inseto.</li>
	<li>Centrifugue o baculovirus sobrenadante a 1.000 x g durante 30 min a 4 ° C para remover restos celulares e tratar o baculovirus sobrenadante com nuclease de 50 unidades/mL (250 unidades / µ l de estoque) por 2 h a 37 ° C para digerir o genoma de DNA e RNA. Filtre os sobrenadantes através de uma unidade de filtração 0,45 μm.</li>
</ol>3. preparação do sistema de cromatografia
<ol><li>Preparar o sistema de cromatografia enxaguando sequencialmente as amostra e buffer de linhas cada com água estéril, 1 N de hidróxido de sódio, água e lavar o tampão (20 mM de fosfato de sódio tampão contendo 150 mM de cloreto de sódio, pH 7.0) a uma taxa de fluxo linear de 50 mL/min.</li>
	<li>Preparar uma coluna µm de heparina 50 (10 × 10 cm, 7,9 mL de volume de coluna (CV)) executando sequencialmente coluna limpeza Reserva (5 CV estéril 20 mM de fosfato de sódio tampão contendo 2 M de cloreto de sódio, pH 7.0) e o tampão de lavagem 5 CV em uma taxa de fluxo linear de 7 mL/min.</li>
</ol>4. purificação de Baculovirus Vector
<ol><li>Configure o sistema de cromatografia da seguinte forma:<ol>
<li>Use o exemplo de porta de entrada para carregar o baculovirus sobrenadante de carregamento.</li>
		<li>Use a porta de entrada do tampão A1 para carregar o tampão de lavagem. Prepare uma garrafa pelo menos 500 mL de tampão de lavagem e coloque a linha de tampão de lavagem no frasco.</li>
		<li>Use a porta de entrada do tampão A2 para carregar o buffer de eluição (20 mM de fosfato de sódio com 1,5 M de cloreto de sódio, pH 8.0). Prepare uma garrafa pelo menos 500 mL de tampão de eluição e coloque a linha do tampão de eluição para a garrafa.</li>
		<li>Inserir diversos tubos de 50ml cónico o coletor de fração para coletar a coluna passagem baculovirus sobrenadante, o tampão de lavagem e o baculovirus eluted.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Equilibrar a coluna de heparina com cinco volumes de coluna de 7,9 mL (CVs) de tampão de lavagem (40 mL) em uma taxa de fluxo linear de 7,0 mL/min.</li>
	<li>Carrega 250 mL do sobrenadante para a coluna de heparina usando a bomba de amostra (porta de amostra de entrada) do sistema de cromatografia em uma taxa de fluxo linear de 2,0 mL/min de baculovirus.</li>
	<li>Executar 10 CVs (80 mL) de tampão de lavagem através da coluna de heparina em uma taxa de fluxo linear de 2,0 mL/min até a curva de absorção ultravioleta (UV) (280 nm) retornou à linha de base e torna-se estável.</li>
	<li>Eluir as baculovirus partículas da coluna 7,9 mL de heparina com 5 CVs (40 mL) de tampão de eluição, a uma taxa de fluxo linear de 4,0 mL/min. relógio para um pico de eluição afiada de proteína no cromatograma, quando as partículas de baculovirus dissociam a coluna de heparina.</li>
	<li>Pós-eluição, imediatamente, diluir o sobrenadante de baculovirus eluted usando 10-fold 20 mM de tampão de fosfato de sódio em água para evitar a inativação de partículas de baculovirus de choque osmótica durante a subsequente centrifugação.</li>
	<li>Loja de 100 µ l de cada uma das frações, incluindo a coluna de passagem recolhidos durante o carregamento de baculovirus sobrenadante, o tampão de lavagem e o eluato. Infectar estas frações de baculovirus para HT1080 para avaliar o processo de purificação (ver secção 6).</li>
	<li>Limpe a coluna com coluna limpar o buffer e o tampão de lavagem. Finalmente, lavar a coluna com 5 CV estéril 20% de etanol em água a uma taxa de fluxo linear de 7,0 mL/min e armazenar a 4 ° C.</li>
	<li>Limpar o sistema de cromatografia com água, 1 N de hidróxido de sódio, novamente com água e 20% de etanol em água a uma taxa de fluxo linear de 50,0 mL/min e armazenar o sistema em 20% de etanol.</li>
</ol>5. concentração de Baculovirus
<ol><li>Pre-esterilize tubos de centrífuga usando uma autoclave. Adicione um volume igual de baculovirus sobrenadante para cada tubos se numa vizinhança de cultura de tecidos. Medir o peso do tubo por um equilíbrio e ajustar o peso do conteúdo dos tubos se com PBS estéril.</li>
	<li>Cada um dos tubos se coloque em oposição balde do rotor SW 32 Ti.</li>
	<li>Executar o se a 80.000 g × para 90 min a 4 ° C.</li>
	<li>Abra os tubos se numa vizinhança de cultura de tecidos e assepticamente, aspirar o líquido sem retirar a pelota de baculovirus.</li>
	<li>Resuspenda o pellet de cada tubo pipetando vigorosamente acima e para baixo com 200 µ l de PBS contendo 0,5% (w/vol) BSA.</li>
	<li>Transferir o baculovirus concentrado para cryovials (50 a 100 µ l por frasco) e armazenar a-80 ° C.</li>
</ol>6. titulação de Baculovirus
<ol><li>O dia antes da infecção, conte as células de HT1080 usando um hemocytometer após coloração de células com Trypan azul. Semente de 1 x 105 HT1080 células por poço em uma placa de 6 em 2 mL de modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS). Sementes vários poços adicionais para ser capaz de determinar o número exato de células presentes no momento da infecção. Cultura de células em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO2. Nota: Células HT1080 são utilizadas para a titulação como eles expressam um maior nível de sulfato de heparan em comparação com as outras células linhas16. Uma vez que as células HT1080 são aderentes, titulação é mais simples e menos demorado em comparação com usando a titulação Sf9-baseado tradicional.</li>
	<li>No dia de infecção, determine o número de células por poço pela contagem de células de poços. Infectar as células, adicionando o baculovirus original diluída que tinha foram retiradas antes da purificação da coluna e com amostras da coluna de passagem, lavagem e frações de eluição. Para cada amostra, determine a diluição e volume empiricamente com base em partículas infecciosas baculovirus e infectar a cada poço em triplicado.</li>
	<li>Dois dias após a infecção, analise as células para a expressão do gene de interesse. As células podem ser analisadas utilizando um citômetro de fluxo se expressam uma proteína fluorescente (por exemplo, GFP)17.</li>
	<li>Calcular a concentração (unidade infecciosa por mL) baseada no número de células presentes no momento da infecção, o factor de diluição e porcentagens de proteína fluorescente nas células usando a fórmula: (número de células durante a porcentagem de infecção × de proteína fluorescente factor de diluição × células positivas) / volume de baculovirus no mL. Nota: Por exemplo, se o número total de células por bem no momento da infecção é 1.2 × 105, a porcentagem de proteína fluorescente é de 5%, o factor de diluição é 100 e o volume de baculovirus diluídos adicionado é de 10 µ l, o título é 6 × 107 unidades infecciosas (IU) /mL.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram não haverá conflito de interesses.

O protocolo aqui apresentado descreve a produção de baculovirus no Sf9 células em cultura de suspensão e purificação de baculovirus usando uma cromatografia de afinidade de heparina. Os parâmetros usados neste protocolo maximizar o rendimento e minimizar a inactivação de baculovirus infecciosas. O protocolo fornecido aqui mostra que uma recuperação significativamente melhorada de baculovirus partículas em comparação com as recuperações alcançado por outros9.
Devido ao t...

Baculoviridae é usado principalmente para a produção de proteínas recombinantes e vacinas em lepidopteran Spodoptera fugiperda (Sf) 9 células de insetos usando recombinante Autographa californica vírus de poliedrose nuclear multicapsid (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. mais recentemente, está emergindo como um vetor promissor para gene terapia aplicação5. Ele é conhecido por ter um amplo acolhimento e tecido tropismo, infecta células quiescentes e proliferação, é não-patogênicas e não integrar o anfitrião cromossoma4,5,6. Além disso, baculovirus pode ser produzida em cultura de suspensão isento de soro que é escalável e permite o sistema fechado de processamento para produção futura Clínica1.
A pureza de baculovirus partículas é importante para a realização eficaz transdução minimizando a citotoxicidade7,8,9. Baculovirus pode ser concentrados por ultracentrifugação ou filtragem de fluxo tangencial (TFF) com impacto limitado na sua infecciosidade. No entanto, estes procedimentos não só concentrar partículas de vírus mas também restos celulares e proteínas de Sf9 cultura, que pode ser tóxico em vitro (observação pessoal) e podem induzir a inflamação ou uma resposta imune quando usado na vivo. Para evitar isso, especialmente quando usando altamente concentradas ações de vírus, baculovirus infecciosas precisa ser purificado e separado da contaminação de partículas.
Vários métodos têm sido relatados para a purificação e concentração de baculovirus vetores10,11,12. As abordagens disponíveis, cromatografia de afinidade de heparina permite um nível elevado de etapa única de purificação com a baixa concentração de proteínas12a contaminar. O método baseia-se na identificação do sulfato de heparan como receptor para baculovirus13,14. Depois de carregar Sf9 sobrenadante de célula na coluna e vinculação de baculovirus, a coluna pode ser lavada com buffer (isotônico) fisiológico para remover as partículas contaminantes frouxamente acopladas ou não acopladas. Desde que a ligação a heparina é reversível, baculovirus partículas podem ser eluídas com um buffer de sal elevado, o que dilui-se imediatamente a concentração de sal (isotônica) fisiológica para evitar inativação por choque osmótica12. Além disso, a produção de baculovirus, bem como captura na e eluição da coluna de cromatografia, pode ser realizada usando um processo do sistema fechado que é compatível com o atual boas práticas de fabricação (cGMP).
Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para a manufatura, purificação e concentração de baculovirus infecciosas usando centrifugação e cromatografia de afinidade. Brevemente, produzimos baculovirus por transfecção de células Sf9 com um plasmídeo baculovirus em cultura aderente e expandir ainda mais o baculovirus infecciosas na cultura de suspensão livre de soro. Podemos purificar baculovirus usando cromatografia de afinidade de heparina e usar ultracentrifugação como etapa final para altamente concentrado do vetor para a aplicação de terapia de gene.

<table><tbody><tr>Sistema <td>de</td><td>cromatografia</td> <td>28976337 de saúde Akta Avant 150</td><td>GE</td></tr><tr><td>POROS Heparina 50 &micro; m Coluna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4333414</td><td>Coluna de heparina</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Item não catalogado</td><td>Concentra vírus em alta velocidade</td></tr><tr><td>Polyallomer Tubo de ultracentrífuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>326823</td><td>Concentra vírus em alta velocidade</td></tr><tr><td>Incubadora de agitador orbital MaxQ 8000&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Item não catalogado</td><td>Agitador para cultura em suspensão</td></tr><tr><td>250 mL Frascos Erlenmeyer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>238071</td><td>Frasco para cultura em suspensão</td></tr> 1 <tr><td>L Frascos Erlenmeyer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>238072</td><td>Frasco para cultura em suspensão</td></tr><tr><td>Microscópio (Olympus CKX41)</td><td>Olympus</td><td>Item não catalogado</td><td>Monitoramento e contagem de células&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75253839/433607</td><td>Para esclarecimento do sobrenadante de Baculovirus</td></tr><tr><td>50 ml Tubo cônico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td>Para coleta de sobrenadante de Baculovirus</td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>07-200-80</td><td>Placa tratada para cultura de tecidos</td></tr><tr><td>Placa de 10 cm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-772E</td><td>Placa tratada para cultura de tecidos</td></tr><tr><td>Stericup-HV, 0.45&nbsp; &micro; m, PVDF</td><td>EMD-Millipore</td><td>SCHVU05RE</td><td>Unidade de filtração</td></tr><tr><td>Canamicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15160-054</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Kit de vetores Bac-to-Bac</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10360-014</td><td>Sistema de expressão de baculovírus</td></tr><tr><td>DH10B-T1R&nbsp; Célula competente</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12331-013</td><td>Célula competente para</td></tr><tr><td>tampão</td> bacmid TE <td>Item interno</td><td>não catalogado</td><td>10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0.</td></tr><tr><td>Kit Plasmid Maxiprep</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K2100-06</td><td>Para purificação de bacmid</td></tr><tr><td>Células Sf9</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11496-015</td><td>Células de insetos</td></tr><tr><td>Grace' s Meio de cultura de células de insetos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11605-094</td><td>Meio de transfecção</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20012227</td><td>Lavagem de células, diluindo amostras</td></tr><tr><td>HyClone SFX-Meio de células de insetos</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30278.02</td><td>Meio de crescimento de células de insetos sem soro</td></tr><tr><td>Benzonase Nuclease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>Enzima para degradar DNA e RNA</td></tr><tr><td>DNA de plasmídeo de baculovírus (bacmid)</td><td>Item interno</td><td>não catalogado</td><td>Bacmid para produção de baculovírus</td></tr><tr><td>Cellfectin II&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10362</td><td>Reagente de transfecção para células de insetos</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4737</td><td>estabiliza o baculovírus</td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Thomas Scientific</td><td>1222C24</td><td>Para armazenamento de baculovírus</td></tr><tr><td>Linha celular HT1080</td><td>Linha celular de fibroblastos ATCC</td><td>CCL-121</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td>Crescimento tampão de</td></tr><tr><td>lavagem</td><td></td><td>Tampão interno Não catalogado 20</td><td>mmol/l tampão fosfato contendo 150 mmol/l cloreto</td></tr><tr><td>de sódio Tampão de eluição</td><td>Interno</td><td>Item não catalogado</td><td>20 mmol/l tampão fosfato contendo 1,5 mol/l cloreto de sódio</td></tr><tr><td>Tampão de limpeza de coluna</td> Item <td></td><td>interno não catalogado</td><td>Tampão fosfato 20 mmol/l contendo 2,0 mol/l cloreto</td></tr> <tr><td>de sódioÁgua estéril</td><td>Item não catalogado</td><td></td><td>interno Para limpeza Akta Avant</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.09137</td><td>Para limpeza Akta Avant</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7073</td><td>Para limpeza Akta Avant</td></tr></tbody></table>

produção e purificação de baculovirus para aplicação de terapia gênica

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Baculovirus tem sido tradicionalmente usada para a produção de proteínas recombinantes e vacina. No entanto, mais recentemente, baculovirus está emergindo como um vetor promissor para aplicação de terapia de gene. Aqui, baculovirus é produzido por transfecção transiente o baculovirus do ADN do plasmídeo (bacmid) numa cultura de Sf9 células aderente. Baculovirus posteriormente é expandido em Sf9 células em uma cultura livre de soro suspensão até obter o volume desejado. Em seguida é purificado da cultura sobrenadante usando cromatografia de afinidade de heparina. Sobrenadante de vírus é carregado na coluna de heparina, que se liga a partículas de baculovirus no sobrenadante devido a afinidade de heparina para baculovirus envelop glicoproteína. A coluna é lavada com um buffer para remover contaminantes e baculovirus é eluída da coluna com um buffer de elevado-sal. O eluato é diluído a uma concentração de sal isotônica e baculovirus partículas estão mais concentradas usando ultracentrifugação. Usando esse método, baculovirus pode ser concentrado até 500-fold com uma recuperação de 25% de partículas infecciosas. Embora o protocolo descrito aqui demonstra a produção e purificação do baculovirus de culturas até 1 L, o método pode ser dimensionado-se em uma cultura fechada-sistema de suspensão para produzir um vetor de grau clínico para aplicação de terapia de gene.

O protocolo apresentado é em um diagrama de fluxo (Figura 1). As etapas incluem o transfection transiente de Sf9 células com bacmid DNA para produzir baculovirus em cultura aderente em uma placa, a subsequente amplificação em cultura de suspensão isento de soro, tratamento de nuclease e clarificação por centrifugação e filtração, e a purificação usando a cromatografia de afinidade de heparina seguido de concentração com ultracentrifugação.
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Neste protocolo, baculovirus é produzido pelo transfection transiente de baculovirus plasmídeo em células Sf9 e amplificado em uma cultura de suspensão livre de soro. O sobrenadante é purificado por cromatografia de afinidade de heparina e mais concentrado por ultracentrifugação. Este protocolo é útil para a produção e purificação de baculovirus para aplicação de terapia de gene.

Produção e purificação de Baculovirus para aplicação de terapia gênica

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

O objetivo geral deste protocolo é produzir baculovírus em cultura de células de inseto, purificá-lo por cromatografia de afinidade com heparina e concentrá-lo por ultracentrifugação. O produto final pode ser usado para transferência gênica in vivo ou como vacina. Este método pode auxiliar pesquisadores que desejam utilizar baculovírus purificado e concentrado para aplicações em terapia gênica.Partículas de baculovírus podem conter detritos celulares e proteínas do cultivo de Sf9 que podem induzir inflamação ou uma resposta imune quando usadas em humanos. Para evitar toxicidade, o baculovírus é purificado e separado de partículas contaminantes. Algumas partes do procedimento serão demonstradas por Marilou Narciso, uma assistente de pesquisa do meu laboratório.Para estabelecer o cultivo em suspensão, semeie 50 mililitros de células Sf9 em meio de cultura para insetos em um frasco de Erlenmeyer de 250 mililitros de policarbonato. Coloque o frasco em um incubador com agitação orbital. Adicione dois mililitros do estoque de baculovírus P2 às células e agite a 135 rpm, mantendo uma temperatura constante de 28 graus Celsius.Quatro dias após a infecção, toda a população de células Sf9 apr

production-purification-baculovirus-for-gene-therapy

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Neste vídeo, demonstramos a técnica para isolar o baculovírus de um sobrenadante de célula de inseto usando cromatografia de afinidade de heparina. O isolamento é facilitado pela afinidade entre a heparina na coluna e a glicoproteína do envelope do baculovírus.

Purificação de Baculovírus Baseada em Cromatografia de Afinidade de Heparina: Uma Técnica para Isolar Baculovírus do Sobrenadante de Células de Insetos

Complexos proteína de catalisar as funções celulares importantes. Caracterização estrutural e funcional detalhada de muitos complexos essenciais exige a produção recombinante. MultiBac é um sistema de células de baculovirus / insecto particularmente adaptado para a expressão de proteínas eucarióticas e seus complexos. MultiBac foi implementado como uma plataforma de acesso aberto, e procedimentos operacionais padrão desenvolvidos para maximizar a sua utilidade.

A Plataforma de Produção de Proteína Complexo MultiBac no EMBL

No presente protocolo, demonstramos um método altamente eficiente e de baixo custo purificação de proteínas em pequena escala, que permite a purificação de proteínas recombinantes, combinando de forma única um GST-tag quebrável e uma pequena His-tag.

GST-Sua purificação: A Two-step Affinity Purification Protocolo Cedendo Full-length proteínas purificadas

Kindlins são fundamentais para a adesão celular através de integrinas mas os estudos deles foram prejudicados pela dificuldade encontrada em expressá-las de forma recombinante em hospedeiros bacterianos. Descrevemos aqui métodos para a sua produção eficiente em células de insecto infectadas com baculovírus.

Produção eficiente e Purificação de recombinante murino Kindlin-3 a partir de células de insetos de Estudos biofísicos

Aqui, apresentamos um protocolo para a síntese de partículas semelhantes a vírus, seja através de baculovírus ou sistemas de expressão de mamíferos e purificação ultracentrifugação. Esta abordagem altamente personalizada é utilizado para identificar antigénios virais como alvos de vacinas de maneira segura e flexível.

Expressão e purificação de partículas semelhantes a vírus para a vacinação

Este protocolo descreve um calor induzida por choque proteína expressão (sistema pDHsp/V5-His/sf9 célula), que pode ser usado para expressar proteínas estranhas ou avaliando a atividade anti-apoptotic de potenciais proteínas estranhas e seus truncado amino ácidos em células de inseto.

Expressão transiente de estrangeiros Genes em células de inseto (sf9) para o ensaio funcional da proteína

A purificação dos canais iônicos é muitas vezes um desafio, mas uma vez alcançado, pode potencialmente permitir investigações em vitro das funções e estruturas dos canais. Aqui, descrevemos os procedimentos passo a passo para a expressão e purificação de proteínas de mamíferos bestrophin, uma família de Ca2 +-ativado canais Cl– .

Expressão e purificação dos canais de íon Bestrophin mamíferos

Aqui, apresentamos os protocolos para utilizando o inseto sistema expressão da proteína celular e baculovirus para produzir grandes quantidades de proteínas vegetais secretada por cristalização de proteínas. Um vetor de expressão de baculovirus foi modificado com GP67 ou inseto hemolin peptídeo sinal planta secreção na expressão de proteínas nas células de inseto.

Modificar vetores de expressão de Baculovirus para produzir secretado proteínas vegetais em células de inseto

O sistema vetorial de expressão baculovírus (BEVS) é uma plataforma robusta para triagem de expressão e produção de metiltransferases de arginina proteica (PRMTs) a serem utilizadas para estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais. Quantidades de miligrama de material podem ser produzidas para a maioria dos PRMTs e outras proteínas de interesse que requerem uma plataforma de expressão eucariótica.

Produção de Proteínas PRMT Recombinantes utilizando o Sistema Vetorial de Expressão baculovírus

Neste protocolo, o vetor AAV2 é produzido por células de insetos Spodoptera frugiperda (Sf9) com baculovírus (BV)-AAV2-green fluorescente protein (GFP) ou gene terapêutico e células Sf9 infectadas por BV-AAV2-rep-cap na cultura de suspensão. As partículas de AAV são liberadas das células usando detergente, clarificadas, purificadas pela cromatografia da coluna de afinidade, e concentradas pela filtragem de fluxo tangencial.

Desenvolvimento de processos para a produção e purificação do vírus associado ao Adeno (AAV)2 Vetor usando o sistema de cultura de células de baculovírus-inseto

Estudos estruturais e bioquímicos de transportadores de membrana humana requerem quantidades de miligramas de proteína estável, intacta e homogênea. Aqui descrevemos métodos escaláveis para selecionar, expressar e purificar transportadores de solutos humanos usando genes otimizados para códons.

Expressão de alto rendimento e purificação de carreadores de solutos humanos para estudos estruturais e bioquímicos

Aprenda a produzir e purificar baculovirus em cultura de células Sf9 usando cromatografia de afinidade com heparina e ultracentrifugação. Este método elimina contaminantes celulares para aplicações seguras em terapia gênica.

Produção e purificação de Baculovirus para aplicação de terapia gênica

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