Name: Een In Vivo bloed - hersenbarrière permeabiliteit Assay in muizen met behulp van Fluorescently label Tracers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Leer een kwantitatieve bloed-hersenbarrière permeabiliteitsassay bij muizen met fluorescerende tracers. Deze methode combineert fluorometrie en microscopie voor onderzoek naar neurovasculaire dysfunctie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs wil erkennen Sphingonet consortium gefinancierd door de Leduq foundation ter ondersteuning van dit werk. Dit werk werd ook ondersteund door het Collaborative Research Center "vasculaire differentiatie en remodeling" (CRC / Transregio23, Project C1) en door de 7. FP, COFUND, Goethe internationale Postdoc programma GO-IN, No. 291776 financiering. Wij erkennen verder Kathleen Sommer voor haar technische bijstand met muizen, behandeling en genotypering.

Alle dieren die werden behandeld met de grootste zorg minimaliseren van pijn of ongemak tijdens de procedure. Deze procedure volgt de dierenverzorgers richtsnoeren van onze instelling en is goedgekeurd door het plaatselijke comité (Regierungspraesidium Darmstadt, erkenningsnummer FK/1044).
Een schematische voorstelling van de werk-stappen voor in vivo permeabiliteit assay in muizen is afgebeeld in Figuur 1. De details voor elke stap worden hieronder beschreven.
1. dier behandeling
<ol><li>
Voorbereiding en het beheer van de traceurs en anesthetica
	<ol>
<li>Gelabelde buizen en mallen voorbereiden door weefsel insluiten ten minste een dag voor de bepaling van de waterdoorlatendheid. Handhaving van steriele omstandigheden in het gehele protocol door te werken onder schone zuurkast en hulpprogramma's gereinigd met 80% ethanol. Mannelijke of vrouwelijke wild-type (WT) of angiopoietin-2 (Ang-2) winst-van-functie (GOF) CD1 muizen in de volgroeide volwassen leeftijdsgroep van 3-6 maanden voor het huidige protocol gebruiken. Genotypering van de muizen zoals eerder beschreven 10uit te voeren. Opmerking: 80% alcohol zal niet resulteren in steriele instrumenten maar zal het minimaliseren van verontreiniging van de monsters bereid.</li>
		<li>Verdun alle de traceurs in steriele PBS in 2 mM voorraden en slaan de aliquots beschermd tegen licht bij-20 ° C.</li>
		<li>Kies traceurs zoals (Tetramethyl Rhodamine) TMR en (fluoresceïne isothiocyanaat) FITC met verschillende excitatie/emissie spectra en dat zijn lysine corrigeerbare wat resulteert in minimale interferentie tussen de kleurstoffen door fluorescentie microscopie (met behulp van de TMR of FITC filteren respectievelijk) en door fluorometry in een afleesapparaat voor de permeabiliteit assay. Opmerking: TMR dextran 3 kD FITC dextran 3 kD gebruikt in de studie zijn beide corrigeerbare lysine en vandaar kon ook worden gebruikt voor de immunohistochemische analyse na fixatie met aldehyden te onderzoeken van regionale verschillen.</li>
		<li>Met alle dieren omgaan met uiterste zorg samengesteld volgens de richtlijnen van de institutionele zorg. Injecteren intraperitoneally elke muis met 100 µL tracer oplossing die kan worden verhoogd tot 200 µL als een extra tracer wordt gecombineerd met behulp van 100 µL van elke tracer in een 1:1 mix10,13. Ten minste één dier injecteren met PBS alleen in plaats van de traceurs om te dienen als sham controle voor autofluorescence achtergrond aftrekken.</li>
		<li>5 min na tracer injectie, anesthetize het dier met een i.p injectie van Ketamine en Xylazine (100 mg en 5-10 mg in 0.9% zout per kg lichaam gewicht respectievelijk 150 µL van de cocktail per 25 g muis). Opmerking: Dierenarts zalf was niet toegepast op de ogen tijdens de procedure als de periode tussen dierlijke anesthesie en perfusie/offer korte was (10 minuten) waar elke drogen van de ogen niet werd waargenomen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Collectie en cardiale bloedverspreiding
	<ol>
<li>De dieren voor te bereiden voor cardiale perfusie 10 min na toediening van de verdoving. Het uitblijven van paw kramp antwoord controleren om ervoor te zorgen dat het dier een chirurgische vliegtuig van de verdoving bereikt.</li>
		<li>Leg de dieren op hun rug en 80% ethanol toe te passen op de huid van de buikstreek. Met behulp van kleine schaar, openstellen van de buikwand met een kleine incisie (2 cm) net onder de ribbenkast. Lever scheiden van het middenrif en vervolgens langzaam doorsnijden van het middenrif bloot van de pleura holte 15.</li>
		<li>De ribbenkast bilateraal knippen en monteren van het gesneden borstbeen om bloot het linkerventrikel. Invoegen van een naald 21-gauge vlinder aangesloten op een systeem van de peristaltische perfusie in de posterior van de linkerventrikel.</li>
		<li>Punctie van de juiste atrium en snel (binnen 10 s) verzamelen 200-300 µL bloed vrijkomen in de borstholte met behulp van 1 mL pipet tips (met einde cut-off) in serum collectie buizen en op te slaan op het ijs. Opmerking: Deze procedure perfusie is niet-survival.</li>
		<li>Zodra het bloed is verzameld, zet het systeem van de perfusie (10-12 rpm, 5 mL/min) en perfuse van het dier gedurende 3 minuten met warm (RT) 1 x PBS (gratis voor Ca2 +/Mg2 + -ionen). Opmerking: PBS met Ca2 +/Mg2 + -ionen kunnen worden gebruikt voor betere hartactiviteit tijdens de perfusie. Het totale bedrag van PBS gebruikt voor perfusie is in de range van 15-20 mL.</li>
		<li>Perfusie kwaliteit beoordelen door op te merken van de kleur van lever, nieren, die wit/pale na perfusie verschijnen. Opmerking: Nier of lever perfusie doen niet te betekenen perfusie van de hersenen als de slagaders (halsslagader/Vertebrale) bereiken van de hersenen van de aorta kan krijgen gescheurd tijdens de voorbereiding in stap 3 met name tijdens de atriale punctie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. de weefsels Processing
<ol><li>Orgel inzameling en opslag
	<ol>
<li>Bevestig aan het einde van de perfusie, dood van het dier door cervicale dislocatie en oogst hersenen en nieren. Controleer of hersenen perfusie door de kleur van de hersenen (geen zichtbaar bloed in de vaten van de hersenvliezen), zodat de dieren van permeabiliteit analyse uitsluiten wanneer perfusie kwaliteit niet goed is. Het scheiden van de hersenen in 2 hemibrains met behulp van een scalpel (Figuur 1).</li>
		<li>Ontleden met een scalpel een hemibrain vrij van bulbus lobben en cerebellum en de hemicerebrum overbrengen in een 2-mL-buis. Hemi-cerebellum in een extra buis opslaan als nodig zijn voor cerebellaire permeabiliteit evaluatie.</li>
		<li>Een één nier overbrengen in een andere 2 mL-buis. Bewaar de monsters onmiddellijk op droog ijs.</li>
		<li>Insluiten native het resterende nier en de hemi-hersenen (bestaande uit het cerebellum en de bulbus lobben) in weefsel-tek optimale scherpe temperatuur (O.C.T) samengestelde op droog ijs.</li>
		<li>Op het einde, centrifugeer de bloedmonsters opgeslagen op ijs in serum collectie buizen op 10, 000 g, 10 min bij 4 ° C. Serum supernatant overbrengen in 1,5 mL buizen en plaats hen in de container droogijs.</li>
		<li>Overdracht van alle monsters verzameld op droogijs naar-80 ° C vriezer totdat zij worden verwerkt. Opmerking: Het is belangrijk dat de monsters voordat u verdergaat met de stappen van homogenisering als verhogingen van de efficiëntie van de homogenisering na bevriezen, zoals het bevriezen, ontdooien.</li>
	</ol></li>
	<li>Homogenisering en centrifugeren
	<ol>
<li>De hemi-hersenen en nieren monsters van bevroren bij-80 ° C op ijs ontdooien en weegt de buizen met de organen. Aftrekken van deze gewichten, de gemiddelde waarde van verschillende lege buizen (ongeveer 20) om het weefsel gewicht. Voeg 300 µL en 200 µL van koude 1 X PBS de buizen met nier- en hemi-hersenen, respectievelijk. Opmerking: voor lagere hoeveelheden weefsel (zoals hemi-cerebellum, onder 100 mg) met een gewicht van de afzonderlijke buizen wordt aanbevolen.</li>
		<li>Elk monster in de oorspronkelijke eppendorf buis meng met een stamper van polytetrafluorethyleen (PTFE) gekoppeld aan een elektrische Bovenroerder (1, 000 rpm) door het uitvoeren van ongeveer 15 lijnen (1 lijn = 1 op en 1 neer). Spoel de stamper met PBS tussen monsters en veeg droog alvorens tot het volgende monster. Opmerking: Het gebruik van detergentia tijdens homogenisering werd vermeden vanwege mogelijke storing met fluorometry. Intracellulaire tracer wordt echter ook ontdekt in dit protocol, zoals het weefsel is grondig gehomogeniseerd, die efficiënter is na één ronde van bevriezen ontdooien.</li>
		<li>Bewaar de gehomogeniseerde monsters op ijs beschermd tegen licht en centrifuge allemaal samen in het einde op 15.000 g, 20 min, 4 ° C in een tafelblad centrifuge. Supernatant overbrengen in een nieuwe 1,5 mL-buizen op het ijs voor onmiddellijke fluorometry of bij-80 ° C tot naderhand worden geanalyseerd.</li>
	</ol></li>
	<li>Fluorescentie-meting en kwantificering
	<ol>
<li>Indien bevroren aan het einde van de vorige stap, ontdooien op ijs de weefsel supernatant en serum monsters opgeslagen bij-80 ˚C hen te beschermen tegen licht met de folie.</li>
		<li>Pipeteer 50 µL van verdund serum (30 µL 1 x PBS + 20 µL serum) of weefsel supernatant (zoals) in een 384-well zwarte plaat. Omvatten ten minste één monster van sham dier voor serum en weefsel supernatant om ervoor te zorgen de juiste achtergrond aftrekken, zoals dit weefsel homogenaat achtergrond meestal hoger dan die van PBS gebruikt als het oplosmiddel is. Opmerking: Een gemiddelde van 3 sham dieren kan worden gebruikt voor autofluorescence hoewel een weinig variabiliteit in sham autofluorescence waarden (gegevens niet worden weergegeven) werd waargenomen. De hoeveelheid serum gebruikt kan worden verminderd door het verdunnen met PBS, die ook de signaal / ruisverhouding voor monsters met lage fluorescentie zoals de hersenen monsters kan verhogen. T/m 10 µL serum werd getest verdunnen het met 40 µL PBS. Zorg ervoor dat geen luchtbellen aanwezig in de putjes zijn.</li>
		<li>De 384-well zwarte plaat in de afleesapparaat invoegen en open een nieuw script selecteren fluorescentie-meting.</li>
		<li>De winst ingesteld op optimale en excitatie / (nm) emissiewaarden voor 550/580 of 490/520 respectievelijk voor TMR of FITC dyee gebruiken en start de meting om te verkrijgen van de ruwe fluorescentie-eenheden (RFUs).</li>
		<li>De ruwe fluorescentie-eenheden (RFUs) van de afleesapparaat gebruiken om te berekenen de permeabiliteit index (PI) na het aftrekken van de waarden van de bijbehorende sham.<ol>
<li>
* Permeabiliteit Index (mL/g) = (Weefsel RFUs/g weefsel gewicht) / (Serum RFUs/mL serum)
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Voorbeeld berekening voor hersenen permeabiliteit index (PI) van het dier GOF1 (tabel 1):<ol>
<li>GOF1 brain RFUs - SHAM hersenen RFUs = 154-22,5 = 131.5</li>
			<li>GOF1 serum RFUs - SHAM serum RFUs = 38305-27 = 38278</li>
			<li>Brain gewicht (g) = 0.195</li>
			<li>Serum volume (ml) = 0,02</li>
			<li>Brain permeabiliteit Index (10-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0,352 Opmerking: De berekeningen van de index permeabiliteit heeft waarden opgeleverd die absolute en vergelijkbare tussen experimenten en weefseltypes (HLA zijn). Deze kunnen echter worden gepresenteerd als ratio's voor het gemak van vergelijking tussen 2 groepen 12. Dit kan worden bereikt door het verdelen van de PI van elk dier in beide groepen met de gemiddelde PI van de controlegroep, rijden de controle groep gemiddelde via 1 nog houden van de inter dierlijke variatie in de controlegroep. Deze transformatie levert waarden voor experimentele groep (of groepen) ten opzichte van de controlegroep ingesteld op 1.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Immunofluorescentie visualisatie van tracer
	<ol>
<li>Snijd de blokken van de nier/hemi-hersenen native ingebed in weefsel-tek compound (O.C.T) (stap 2.1) in 10 µm secties op een cryostaat ingesteld op-20 ° C en breng de secties naar dia's geplaatst bij kamertemperatuur. Zodra de secties zijn gedroogd (ongeveer 30 min), overbrengen in dia's-80 ° C, vriesvak tot gebruik.</li>
		<li>Op de dag van de kleuring, ontdooien van de dia's bij 37 ° C gedurende 10 minuten en vervolgens het herstellen van de secties met 4% paraformaladehyde (PFA) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur gevolgd door snelle wassen in PBS.</li>
		<li>De secties in permeabilization/blokkeren buffer gemaakt van steriel PBS, met 1% BSA en 0,5% Triton X-100 pH 7.5 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur incuberen.</li>
		<li>Incubeer de dia's gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur met CD31 primair antilichaam (0,5 mg/ml, kloon MEC 13,3), verdund in 1:100 in buffer met steriel PBS, 0,5% BSA, 0,25% Triton X-100 (pH 7,2) gevolgd door drie 5 min wast in PBS.</li>
		<li>Incubatie van secundair antilichaam in de bovenstaande buffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met soortspecifieke uitvoeren, fluorescently label antilichamen verdunde 1:500 (2 mg/mL). Voor CD31, kan geit anti-rat Alexa 568 of Alexa 488 worden gebruikt bij een verdunning van 1:500. Omvatten van de DAPI (300 µM) in het secundair antilichaam (1:1, 000 verdunning uit de voorraad) te mengen om de vlek voor de kernen.</li>
		<li>De gekleurde secties met aqua polymount mount en laat het 's nachts voor polymerisatie bij kamertemperatuur in donker.</li>
		<li>Verwerven van beelden met behulp van een spectrale imaging confocale laser scanning microscoop systeem. Het analyseren van beelden met NIS elementen software (versie 4.3). Software zoals Photoshop kan worden gebruikt voor de generatie van montage cijfers.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16371949">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li>
<li>Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26590417">Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier.</a> Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).</li>
<li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li>
<li>Devraj, K., Klinger, M. E., Myers, R. L., Mokashi, A., Hawkins, R. A., Simpson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLUT-1+glucose+transporters+in+the+blood-brain+barrier%3A+differential+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">GLUT-1 glucose transporters in the blood-brain barrier: differential phosphorylation.</a> Journal of neuroscience research. 89 (12), 1913-1925 (2011).</li>
<li>Banks, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+blood-brain+barrier+to+blood-brain+interface%3A+new+opportunities+for+CNS+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery.</a> Nature reviews. Drug discovery. 15 (4), 275-292 (2016).</li>
<li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+pathways+to+neurodegeneration+in+Alzheimer%27s+disease+and+other+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders.</a> Nature reviews. Neuroscience. 12 (12), 723-738 (2011).</li>
<li>Paganetti, P., Antoniello, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+efflux+of+amyloid-%CE%B2+peptides+through+the+blood-brain+barrier+by+muscarinic+acetylcholine+receptor+inhibition+reduces+pathological+phenotypes+in+mouse+models+of+brain+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+disease%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Increased efflux of amyloid-β peptides through the blood-brain barrier by muscarinic acetylcholine receptor inhibition reduces pathological phenotypes in mouse models of brain amyloidosis.</a> Journal of Alzheimer's disease: JAD. 38 (4), 767-786 (2014).</li>
<li>Devraj, K., Poznanovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BACE-1+is+expressed+in+the+blood-brain+barrier+endothelium+and+is+upregulated+in+a+murine+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cerebral+blood+flow+and+metabolism%3A+official+journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">BACE-1 is expressed in the blood-brain barrier endothelium and is upregulated in a murine model of Alzheimer's disease.</a> Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1281-1294 (2016).</li>
<li>Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+neurology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier in health and disease.</a> Annals of neurology. 72 (5), 648-672 (2012).</li>
<li>Gurnik, S., Devraj, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiopoietin-2-induced+blood-brain+barrier+compromise+and+increased+stroke+size+are+rescued+by+VE-PTP-dependent+restoration+of+Tie2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Angiopoietin-2-induced blood-brain barrier compromise and increased stroke size are rescued by VE-PTP-dependent restoration of Tie2 signaling.</a> Acta neuropathologica. 131 (5), 753-773 (2016).</li>
<li>Scholz, A., Harter, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-derived+angiopoietin-2+is+a+therapeutic+target+in+treatment-naive+and+bevacizumab-resistant+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-derived angiopoietin-2 is a therapeutic target in treatment-naive and bevacizumab-resistant glioblastoma.</a> EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 39-57 (2016).</li>
<li>Gross, S., Devraj, K., Feng, Y., Macas, J., Liebner, S., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoside+diphosphate+kinase+B+regulates+angiogenic+responses+in+the+endothelium+via+caveolae+formation+and+c-Src-mediated+caveolin-1+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cerebral+blood+flow+and+metabolism%3A+official+journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Nucleoside diphosphate kinase B regulates angiogenic responses in the endothelium via caveolae formation and c-Src-mediated caveolin-1 phosphorylation.</a> Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2471-2484 (2017).</li>
<li>Ziegler, N., Awwad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Catenin+Is+Required+for+Endothelial+Cyp1b1+Regulation+Influencing+Metabolic+Barrier+Function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">β-Catenin Is Required for Endothelial Cyp1b1 Regulation Influencing Metabolic Barrier Function.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 36 (34), 8921-8935 (2016).</li>
<li>Vutukuri, R., Brunkhorst, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+sphingolipid+metabolism+as+a+putative+mechanism+underlying+LPS-induced+BBB+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Alteration of sphingolipid metabolism as a putative mechanism underlying LPS-induced BBB disruption.</a> Journal of Neurochemistry. , (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J Vis Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Hoffmann, A., Bredno, J., Wendland, M., Derugin, N., Ohara, P., Wintermark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+and+Low+Molecular+Weight+Fluorescein+Isothiocyanate+%28FITC%29-Dextrans+to+Assess+Blood-Brain+Barrier+Disruption%3A+Technical+Considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+stroke+research%22%5BJournal%5D)">High and Low Molecular Weight Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-Dextrans to Assess Blood-Brain Barrier Disruption: Technical Considerations.</a> Translational stroke research. 2 (1), 106-111 (2011).</li>
<li>Armulik, A., Genové, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).</li>
<li>Bell, R. D., Winkler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+control+key+neurovascular+functions+and+neuronal+phenotype+in+the+adult+brain+and+during+brain+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging.</a> Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).</li>
<li>Banks, W. A., Gray, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+blood-brain+barrier+disruption%3A+roles+of+cyclooxygenase%2C+oxidative+stress%2C+neuroinflammation%2C+and+elements+of+the+neurovascular+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 223(2015).</li>
<li>Krause, G., Winkler, L., Mueller, S. L., Haseloff, R. F., Piontek, J., Blasig, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+claudins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Structure and function of claudins.</a> Biochimica et biophysica acta. 1778 (3), 631-645 (2008).</li>
<li>Johansson, B. B. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-4-431-67899-1_5">Blood-Brain Barrier: Role of Brain Endothelial Surface Charge and Glycocalyx.</a> Ischemic Blood Flow in the Brain. , 33-38 (2001).</li>
<li>Fu, B. M., Li, G., Yuan, W. <a target="_blank" href="http://www.fasebj.org/content/22/1_Supplement/734.1.short">Charge effects of the blood-brain barrier on the transport of charged molecules.</a> The FASEB Journal. 22 (1 Supplement), (2008).</li>
<li>Goebl, N. A., Babbey, C. M., Datta-Mannan, A., Witcher, D. R., Wroblewski, V. J., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Fc+receptor+mediates+internalization+of+Fc+in+transfected+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells.</a> Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).</li>
<li>Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-pore+model+describes+transport+properties+of+bovine+retinal+endothelial+cells+in+normal+and+elevated+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).</li>
<li>Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mouse+endothelial+cell+surface+marker+is+suppressed+during+differentiation+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier.</a> Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Bloed - hersenbarrière dysfunctie wordt geassocieerd met een aantal neurologische aandoeningen, met inbegrip van de primaire en secundaire hersentumor of beroerte. BBB-verdeling wordt vaak geassocieerd met levensbedreigende CNS oedeem. Het ontrafelen van de moleculaire mechanismen die leiden de opening tot of sluiting van de BBB wordt daarom van therapeutische belang in neurologische aandoeningen en vaak onderzocht door onderzoekers. Methoden te onderzoeken BBB permeabiliteit in vivo gemeld in de literatuur, zij...

De bloed - hersenbarrière (BBB) bestaat uit de microvasculaire endotheliale cellen (ECs) ondersteund door nauw pericytes (PCs), die ensheathed in de basale lamina, en astrocyten (ACs), die het membraan van de kelder met hun einde-voeten1 omhullen ,2. ECs interactie met verschillende celtypes die ondersteuning en regelen de barrièrefunctie, vooral ACs en PC's, en ook neuronen en microglia, die allemaal samen de neurovasculaire eenheid (NVU vormen). De NVU is van cruciaal belang voor het functioneren van de BBB, waardoor het vervoer van bloed van toxinen en ziekteverwekkers uit het invoeren van de hersenen wordt beperkt. Deze functie is een gevolg van strakke-junctie moleculen zoals claudin-5, occludin, zonula occludens-1, die aanwezig zijn tussen de ECs en ook als gevolg van het optreden van vervoerders zoals p-Glycoproteïne (P-gp) dat efflux moleculen die worden ingevoerd door het endotheel terug in het vaartuig lumen1,2,3. De BBB zorgt echter voor het vervoer van essentiële moleculen zoals voedingsstoffen (ijzer, glucose, aminozuren) door specifieke vervoerders uitgedrukt op de EG plasma membranen1,2,3. De EG-laag is zeer gepolariseerd met betrekking tot de verdeling van de verschillende vervoerders tussen de luminal (bloed-gerichte) en abluminal (hersenen gerichte membranen) te voorzien in de specifieke en vectoriële vervoer functie4,5 . Terwijl de BBB beschermend met betrekking tot strak regulering van de CNS-omgeving is, is het een grote uitdaging voor CNS drug levering in ziekten zoals Parkinson met een functionele BBB. Zelfs in neurologische ziekten met BBB dysfunctie, kan niet er worden aangenomen dat de hersenen drug levering wordt verhoogd naarmate de barrière disfunctie kan ook schade aan de doelen van de specifieke vervoerder bijvoorbeeld zoals de ziekte van Alzheimer (AD). In AD, verschillende bèta amyloid vervoerders zoals LRP1, woede, P-gp bekend is dat ze dysregulated en daarom richten deze vervoerders zou zinloos6,7,8. De BBB is geschaad in verschillende neurologische aandoeningen zoals beroerte, AD, meningitis, MS, en in de hersenen tumoren9,10,11. Herstel van de barrièrefunctie is een cruciaal onderdeel van de therapeutische strategie, en dus haar beoordeling is van cruciaal belang.
In dit werk, hebben wij beschreven een objectieve en kwantitatieve protocol voor permeabiliteit assay in knaagdieren dat we met succes op verschillende muis lijnen beide transgene en experimentele ziekte modellen10,12,13 toegepast ,14. De methode is gebaseerd op een eenvoudige intraperitoneale injectie van fluorescerende traceurs gevolgd door perfusie van de muizen te verwijderen van de traceurs van de vasculaire compartiment. Hersenen en andere organen zijn verzamelde post perfusie en permeabiliteit beoordeeld door een doelstelling en absolute permeabiliteit index op basis van metingen van de fluorescentie van weefsel homogenates in een afleesapparaat. Alle ruwe fluorescentie waarden worden gecorrigeerd voor de achtergrond met behulp van weefsel homogenates of serum van sham dieren die niet elke tracer ontvangt. Ruime belangrijk zijn opgenomen voor serum volume, serum fluorescentie, en het gewicht van de weefsels, dus opbrengst permeabiliteit-index die is absoluut en vergelijkbare tussen experimenten en weefseltypes (HLA). Voor het gemak van vergelijking tussen groepen, kunnen de absolute permeabiliteit indexwaarden worden gemakkelijk omgezet naar ratio's zoals we eerder12had uitgevoerd. Gelijktijdig, kunnen opgeslagen hemi-hersenen en nieren worden gebruikt voor tracer visualisatie door fluorescentie microscopie10. De klassieke fluorescentie microscopie heel waardevol in het verkrijgen van regionale verschil in permeabiliteit zij omslachtig als gevolg van subjectieve selectie van weefselsecties en afbeeldingen voor een semi-kwantitatieve analyse kan zijn. De gedetailleerde stappen worden gepresenteerd in het protocol en notities worden toegevoegd waar nodig. Dit biedt de nodige informatie voor het succesvol uitvoeren van de permeabiliteit in vivo bepaling in muizen die kunnen worden geschaald naar andere kleine dieren. De bepaling kan worden toegepast op vele soorten traceurs waardoor de lading en de grootte op basis van permeabiliteit beoordeling door een combinatie van verklikstoffen met verschillende fluorescentie spectra.

<table><tbody><tr><td>Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD</td><td>Thermosfisher</td><td>D3308</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD</td><td>Thermosfisher</td><td>D3306</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine (Ketavet)</td><td>Zoetis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine (Rompun)</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.9% Saline</td><td>Fresenius Kabi Deutschland GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-tek O.C.T compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldhehyde solution</td><td>Sigma</td><td>252549-1L</td><td>prepareer een 4% oplossing</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin, fraction V</td><td>Roth</td><td>8076.3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>goat anti rat alexa 568</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11077</td><td></td></tr><tr><td>goat anti rat alexa 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Aqua polymount</td><td>Polyscience Inc</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>21-gauge butterfly needle</td><td>BD</td><td>387455</td><td></td></tr><tr><td>serum collection tube</td><td>Sarstedt</td><td>41.1500.005</td><td></td></tr><tr><td>2mL eppendorf tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.695.500</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech precision wipes tissue wipers</td><td>Kimberley-Clark Professional</td><td>05511</td><td></td></tr><tr><td>384-well black plate</td><td>Greiner</td><td>781086</td><td></td></tr><tr><td>slides superfrost plus</td><td>Thermoscientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PTFE pestle</td><td>Wheaton</td><td>358029</td><td></td></tr><tr><td>electric overhead stirrer</td><td>VWR</td><td>VWR VOS 14</td><td></td></tr><tr><td>plate reader</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Microm GmbH</td><td>HM 550</td><td></td></tr><tr><td>Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>peristaltic perfusion system</td><td>BVK Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr></tbody></table>

een in vivo bloed - hersenbarrière permeabiliteit assay in muizen met behulp van fluorescently label tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Bloed - hersenbarrière (BBB) is een gespecialiseerde barrière die de hersenen communicatie beschermt tegen toxinen en ziekteverwekkers in het verkeer en onderhoudt de homeostase van de hersenen. De belangrijkste sites van de barrière zijn endotheliale cellen van de haarvaten van de hersenen waarvan barrièrefunctie het gevolg is van strakke intercellulaire kruispunten en efflux vervoerders uitgedrukt op het plasma-membraan. Deze functie wordt geregeld door de pericytes en de astrocyten die samen de neurovasculaire eenheid (NVU vormen). Verschillende neurologische aandoeningen zoals beroerte, de ziekte van Alzheimer (AD), hersentumoren worden geassocieerd met een verminderde functie van de BBB. Beoordeling van de BBB-permeabiliteit is daarom cruciaal bij de beoordeling van de ernst van de neurologische ziekte en het succes van de behandelingsstrategieën werkzaam.
Wij presenteren hier een eenvoudige, maar robuuste permeabiliteit assay die met succes zijn toegepast op verschillende muis zowel, genetische en experimentele modellen. De methode is zeer kwantitatieve en objectieve in vergelijking met de analyse van de fluorescentie tracer door microscopie dat algemeen wordt toegepast. Bij deze methode worden muizen intraperitoneally ingespoten met een mengeling van waterige inerte fluorescerende traceurs gevolgd door anesthetizing van de muizen. Cardiale perfusie van de dieren wordt uitgevoerd vóór de oogst van de hersenen, nieren of andere organen. Organen worden gehomogeniseerd en gecentrifugeerd gevolgd door fluorescentie-meting van de bovendrijvende substantie. Bloed getrokken uit de cardiale punctie net voordat perfusie voor normalisatie doel tot de vasculaire compartiment serveert. De fluorescentie van weefsel is genormaliseerd naar de natte gewicht en serum fluorescentie te verkrijgen een kwantitatieve tracer permeabiliteit index. Voor extra bevestiging, kan de contralaterale hemi-hersenen bewaard voor immunohistochemistry voor tracer fluorescentie visualisatie doeleinden worden gebruikt.

We hebben onlangs aangetoond dat angiopoietin-2 (Ang-2) winst-van-functie (GOF) muizen hogere vasculaire permeabiliteit van de hersenen dan controle muizen in gezonde omstandigheden10 hebben. In lijn-geïnduceerde muizen was het ook laat zien dat de muizen GOF had grotere maten van het infarct en grotere doorlaatbaarheid dan de controle nestgenoten. Deze resultaten tonen een kritische rol van Ang-2 in permeabiliteit bij de BBB. Het protocol is daarom gebruikt de GOF...

Hier presenteren we een muis hersenen vasculaire permeabiliteit assay gebruik intraperitoneale injectie van fluorescerende traceurs gevolgd door perfusie die gelden voor dierlijke modellen van de bloed - hersenbarrière dysfunctie. Een hemi-hersenen wordt gebruikt voor het beoordelen van permeabiliteit kwantitatief en anderzijds voor tracer visualisatie/immunokleuring. De procedure duurt 5-6 h voor 10 muizen.

Een In Vivo bloed - hersenbarrière permeabiliteit Assay in muizen met behulp van Fluorescently label Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Het algemene doel van deze procedure is om de permeabiliteit van de hersenvaten bij muizen te beoordelen met behulp van fluorescerend gelabelde tracers om de bloed-hersenbarrièrefunctie te evalueren in diermodellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de bloed-hersenbarrière met betrekking tot neurovasculaire permeabiliteit bij ziekten en herstel na therapie. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het eenvoudig en kwantitatief is.Het biedt de mogelijkheid voor gelijktijdige beoordeling van permeabiliteit door fluorometrie, die kwantitatief is, en ook fluorescentiemicroscopie voor regionale verdedigingen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de diagnose en therapie van verschillende neurologische aandoeningen, waaronder hersentumoren, beroerte en de ziekte van Alzheimer, omdat deze ziekten geassocieerd zijn met levensbedreigende hersenoedeem en verbetering van de BBD-functie als een belangrijk therapeutisch doelwit. Een deel van de procedure zal worden gedemonstreerd door mevrouw Jadranka Macas, een wetenschappelijk technologiemedewerker bij het instituut.Injecteer muizen intraperitoneaal met 100 microl

an-vivo-blood-brain-barrier-permeability-assay-mice-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video describes a permeability assay to evaluate the permeability of in vitro blood-brain barrier using sodium fluorescein molecules.

Blood-Brain Barrier Mimic Permeability Assay: An In Vitro Assay to Assess the Permeability of BBB Mimic to Tracer Molecules

This video demonstrates a procedure for assessing blood-brain barrier disruption in an EAE mouse model. Fluorescent dyes of different sizes are injected retro-orbitally and circulate through the brain's blood vessels. The smaller dye leaks through gaps into the brain tissue, while the larger dye enters only if the disruption is severe, correlating with the extent of barrier damage.

Determining Blood-Brain Barrier Disruption Using Fluorescent Dyes in an EAE Mouse Model

Een<em&gt; In vivo</em&gt; Assay naar Blood Vessel Permeabiliteit Test

Het doel van deze studie was om de reproduceerbaarheid van een in vitro BBB model met een syngene ratten co-kweek van endotheelcellen en astrocyten valideren. De endotheelcellen monolaag gepresenteerd hoge TEER en lage LY permeabiliteit. Expressie van specifieke eiwitten TJ, functionele reacties op ontstekingen en functionaliteit van vervoerders en receptoren werden beoordeeld.

Oprichting van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van Rat bloed-hersenbarrière (BBB): een focus op BBB Ondoordringbaarheid en receptor-gemedieerd transport

Een methode om een in vitro model van de bloed-hersenbarrière te vestigen op basis van een co-cultuur van endotheelcellen van rattenhersenmicrovatsculair en astrocyten wordt beschreven en gevalideerd. Dit systeem bleek een geldige tool te zijn om het effect van nanoformulering op de trans-barrière penetratie van fluorescerende moleculen te bestuderen.

In Vitro Permeatie van FITC-geladen Ferritins Across een Rat bloed-hersenbarrière: een model om de Levering van Nanoformulated Molecules Studie

In deze studie presenteren wij een gemakkelijke en efficiënte procedure voor de beoordeling van de verstoring van de bloed - hersenbarrière neurodegeneratieve omstandigheden. Onze om doel te bereiken, we geïnfundeerd ultrahoog moleculair gewicht fluoresceïne isothiocyanaat geëtiketteerd (FITC)-albumine in muis jugular ader en de lekkage in de hersenen parenchym door fluorescentie microscopie geëvalueerd.

Beoordeling van de bloed - hersenbarrière permeabiliteit door intraveneuze infusie van FITC-geëtiketteerden albumine in een muismodel van neurodegeneratieve ziekte

Hier presenteren we protocollen om te onderzoeken op bijzondere waardeverminderingen van de neurovasculaire eenheid tijdens de experimentele autoimmune encefalomyelitis in vivo. Wij ingaan specifiek op het bepalen van de bloed - hersenbarrière permeabiliteit en gelatinase activiteit die betrokken zijn bij migratie van leukocyten in de glia-limitans.

Visualiseren van de waardevermindering van het endotheel en gliale belemmeringen van de neurovasculaire eenheid tijdens de experimentele Autoimmune encefalomyelitis In Vivo

Drug targeting aan tumoren van het centrale zenuwstelsel is een grote uitdaging. Hier beschrijven we een protocol om te produceren van een in vitro nabootsen van de bloed-hersen tumor-barrière lymfkliertest en/of menselijke cellen gebruiken en bespreken het belang ervan voor de voorspelbaarheid van het centrale zenuwstelsel tumor targeting in vivo.

Predicting In Vivo Payloads levering met behulp van een bloed-hersen Tumor-barrière in een schotel

In dit protocol werd de endotheelbarrièrefunctie van de submandibulaire klier (SMG) geëvalueerd door verschillende moleculair gewogen fluorescerende tracers in vivo in de hoekaders van proefdiermodellen te injecteren onder een laserscanmicroscoop met twee fotonen.

In vivo Vasculaire permeabiliteitsdetectie bij submandibulaire klier van muizen

In deze studie wordt fluoresceïne-isothiocyanaat-gelabeld (FITC) dextran toegediend aan muizen via orale maagsonde om de intestinale permeabiliteit zowel in vivo als in plasma- en fecale monsters te evalueren. Omdat de darmbarrièrefunctie in veel ziekteprocessen wordt beïnvloed, kan deze directe en kwantitatieve test in verschillende onderzoeksgebieden worden gebruikt.

Beoordeling van de integriteit van de darmbarrière bij muizen met fluoresceïne-isothiocyanaat-gelabeld dextran

Er is een methode ontwikkeld om kleurstofextravasatie als gevolg van afbraak van de bloed-hersenbarrière (BBB) te visualiseren door twee fluorescerende kleurstoffen op verschillende tijdstippen aan muizen toe te dienen. Het gebruik van glycerol als cryoprotectant vergemakkelijkte immunohistochemie op hetzelfde monster.

Evaluatie van de afbraak van de bloed-hersenbarrière in een muismodel van licht traumatisch hersenletsel

Leer een kwantitatieve bloed-hersenbarrière permeabiliteitsassay bij muizen met fluorescerende tracers. Deze methode combineert fluorometrie en microscopie voor onderzoek naar neurovasculaire dysfunctie.

Een In Vivo bloed - hersenbarrière permeabiliteit Assay in muizen met behulp van Fluorescently label Tracers

Meer video's verkennen