Kimyasal amputasyon ve yeniden oluşturulmasını Planarian Schmidtea mediterranea yutak

Bu amputasyon prosedürünün genel amacı, diğer organlara zarar vermeden farenksi planaryalardan seçici ve tamamen çıkarmaktır. Bu yöntem, rejenerasyon alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Kök hücrelerin eksik organları nasıl tanıdığı ve yenilenmelerini nasıl başlattığı gibi.

Bu tekniğin en büyük avantajı çok hassas olması ve işlem sırasında diğer organların zarar görmemesidir. Bu yöntem için ilk olarak planaryaları sodyum azid ile uyuştururken aklıma geldi. Sodyum azide maruz kalmanın farenksin dışarı çıkmasına neden olduğunu fark ettim.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü amputasyon, hayvanların uygun şekilde seçilmesinin yanı sıra hayvan hareketi ve morfolojisinin dikkatli bir şekilde gözlemlenmesini gerektirir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi Divya Shiroor olacak. Prosedüre başlamadan önce, beş ila yedi gün önce temiz bir petri kabına beslenen solucanları seçmek için plastik bir transfer pipeti kullanın.

Her bir planaryanın çanak boyunca sürünürken en az 6 milimetre uzunluğunda olduğunu doğrulamak için petri kabının altına düz bir cetvel yerleştirin. Daha sonra seçilen 20 adede kadar solucanı 35 milimetrelik petri kabına aktarın ve tabaktaki tüm düzlemsel suyu çıkarmak için bir transfer pipeti kullanın. Çanağı stereo mikroskop altına yerleştirin ve büyütmeyi birden fazla hayvanın görülebileceği şekilde ayarlayın.

Yemeğe beş mililitre taze hazırlanmış 100 milimolar sodyum azid çözeltisi ekleyin. Farenksin ekstrüzyonunu gözlemlemek için tabağı üç ila dört dakika hareket ettirmeden hayvanları izleyin. Tabaktaki hayvanların en az yarısı bir farenks tamamen uzadığında, solucanları tabağın etrafına birkaç kez aspire etmek ve zorla dağıtmak için plastik bir transfer pipeti kullanın.

Herhangi bir farenks tamamen uzatılmışsa, bu güçlü pipetleme onların ayrılmasına neden olacaktır. Alternatif olarak, planaryayı menisküse doğru yukarı kaldırırken farenksi kavramak için bir çift ince forseps kullanın. Hayvan yükseltildikçe, yüzey gerilimi farenksin ayrılmasına neden olacaktır.

Farenksi hareket ettirirken, hayvanların kazara yaralanmasına neden olmamaya dikkat edin. Planaryalar çok yumuşak gövdelidir ve özellikle sodyum azid içindeyken kolayca zarar görebilir. Yaklaşık 15 ampute hayvanı taze düzlemsel su içeren yeni bir tabağa taşımak için bir transfer pipeti kullanın ve solucanları üç kez taze düzlemsel su ile durulayın.

Sodyum azidi tamamen yıkadığınızdan emin olun. Kimyasalın izleri bile hayvanların parçalanmasına neden olabilir. Daha sonra solucanları yedi gün boyunca 20 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.

Amputasyondan sonraki gün, solucanın sırt tarafında koyu bir nokta olup olmadığını belirlemek için solucanları tekrar mikroskop altına yerleştirin. Solucanları beslemek için, uygun hacimde karaciğer macununu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve hava kabarcıklarını gidermek için tüpü kısa bir süre santrifüjleyin. Macun peletinin hacmini tahmin ettikten sonra, hacminin beşte birine kadar düzlemsel su ekleyin.

Tüpteki toplam hacme bağlı olarak, yüzde iki kırmızı gıda boyası ekleyin. Boya macun boyunca eşit olarak dağılana kadar gıda numunesini iyice karıştırın ve tüpü tekrar kısaca santrifüjleyin. Kesilmiş hayvanları yeni bir petri kabına aktarın ve yaklaşık bir saat karanlıkta bırakın.

Kuluçka işleminin sonunda, bir P200 pipet ucunun ucundan yaklaşık yarım santimetre kesin ve 25 mikrolitre kırmızı karaciğer macununu tabağa aktarmak için değiştirilmiş ucu kullanın. Hayvanların 30 dakika beslenmesine izin verin. Ardından, kırmızı görünen hayvanların sayısını puanlamak için solucanları beyaz bir arka plan üzerine yerleştirin.

Sodyum azid solüsyonunda yaklaşık 6 dakika sonra farenksin beyaz ucu görülebilir. Birkaç dakika sonra hayvanlar aktif olarak kasılır ve farenksi vücutlarından zorla çıkarırlar. Yaklaşık 11 dakikalık azid maruziyetinden sonra, hayvanlar rahatlar ve bu noktada farenksin karakteristik çan şekli açıkça görülebilir hale gelir.

Artık amputasyon için hazırdır. Bu büyük pigmentsiz doku kütlesinin çıkarılması, ampute hayvanların sırt tarafında koyu renkli bir lekenin ortaya çıkmasına neden olur. Farenks rejenerasyonunu daha hassas bir şekilde izlemek için, hayvanlar gece boyunca floresan konjuge streptavidin ile boyanabilir.

Gıda boyası ile karaciğer macunu birleştirilerek yemek yiyen hayvanlar, yemek yemeyen hayvanlardan ayırt edilebilir. Kırmızı hayvanların sayısı daha sonra fonksiyonel bir farenks ile hayvanların yüzdesini değerlendirmek için ölçülebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik 20 veya 30 dakika içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü denerken, amputasyonun ne zaman başlaması gerektiğini belirlemek için düzlemsel hareketi dikkatlice gözlemlemeyi unutmayın. Seçici amputasyonlar, kök hücrelerin rejenerasyonu gerçekleştirmek için uygun soy kararlarını nasıl başlattığı gibi soruların ele alınmasına yardımcı olabilir. Bu video, sodyum azid kullanılarak farenksin seçici olarak çıkarılmasının nasıl yapılacağının iyi bir şekilde anlaşılmasını sağlamalıdır.

Sodyum azid ile çalışmak son derece tehlikeli olabilir. Deneyden sonra her zaman eldivenlerle tutmayı, atıkları uygun şekilde atmayı ve çalışma alanınızı temizlemeyi unutmayın.