حركات للوفلر الأنسجة التالية عن طريق فوتوكونفيرسيون خلية في الجنين الزرد

الهدف العام من هذا الإجراء هو متابعة خلايا الشغاف أثناء تكوين القناة الأذينية البطينية وصمام القلب. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة الأسئلة الرئيسية في مجال نمو القلب ، مثل فهم كيفية تصرف خلايا الشغاف في أنواع مختلفة من الطفر. يعد تتبع الخلايا أثناء التنزين الشرياني الوريدي وتكوين الصمام أمرا صعبا بسبب سرعة ضربات القلب.

يجعل من الصعب متابعة الخلايا عبر الفحص المجهري التقليدي بفاصل زمني. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتجاوز بعض هذه الصعوبات. سيظهر الإجراء رينيه ، باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري.

بعد إنشاء قالب وفقا لبروتوكول النص ، قم بوضع الماصة حوالي 1.5 مل من 1٪ agarose المذاب في طبق تثبيت بلاستيكي مقاس 35 ملم. بعد ذلك ، ضع القالب البلاستيكي في الاغاروز السائل ، مع الحرص على تجنب حبس الهواء بين القالب والأغاروز. ضع الطبق على أربع درجات مئوية حتى يتماسك الاغاروز.

ثم قم بإزالة القالب البلاستيكي من الاغاروز. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من وسط التثبيت المعد مسبقا إلى طبق التثبيت ، واترك 15 إلى 30 دقيقة حتى ينتشر المحلول في الاغاروز. في غضون ذلك ، قم بإذابة كمية ملليلتر واحدة من نقطة انصهار منخفضة 0.7٪ ، أو LMP ، agarose عن طريق وضع الأنبوب في كتلة حرارية 70 درجة مئوية لمدة خمس دقائق تقريبا.

ماصة LMP agarose لأعلى ولأسفل لتبريدها قليلا. ثم أضف 25 ميكرولترا من ثمانية ملليغرام لكل مليلتر من التريكين و 40 ميكرولترا من محاليل BDM المولية إلى الأنبوب. امزج عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.

بعد ذلك ، انقل الأنبوب إلى كتلة حرارية 38 درجة مئوية للحفاظ على LMP agarose في حالته السائلة. انقل الأجنة إلى طبق منفصل يحتوي على ملليلترين من وسط التركيب. بعد ذلك ، عندما تتوقف القلوب عن النبض ، انقل الأجنة إلى طبق التثبيت واستخدم الملقط لترتيبها في الآبار بحيث تقع بزاوية 25 درجة ، وتشير ذيولها نحو الجزء الأعمق من البئر ، مع توجيه الصفار لأعلى.

عندما تكون الأجنة في مكانها تقريبا ، قم بإزالة الوسط ، وقم بتضمينها في ما يقرب من 200 ميكرولتر من 0.7٪ LMP agarose الذي يحتوي على tricaine و BDM. بعد ذلك ، أعد ضبط مواضع الجنين ، وقم بإمالتها إلى اليسار أو اليمين حسب الضرورة. اضغط لأسفل على جدران المربع ذي المسافة البادئة للسماح للأغاروز الزائد بالفيضان إلى المناطق الجانبية لطبق التثبيت.

انتظر حوالي خمس دقائق حتى يتماسك LMP agarose ، ثم أضف وسيط التثبيت إلى الطبق. الأجنة جاهزة الآن للتحويل الضوئي. لإجراء تحويل ضوئي ، على مجهر متحد البؤر المستقيم المجهز بمصادر ليزر 405 و 488 و 561 نانومتر ، استخدم الضوء الأبيض المنقول وعدسة موضوعية لتحديد موقع قلب الجنين.

باستخدام ليزر 561 نانومتر ، تحقق من وجود مضان Kaede الأحمر. بعد ذلك ، استخدم الليزر 488 نانومتر لتصور الشغاف. بعد ذلك ، في برنامج الحصول على المجهر ، أدخل وضع FRAP.

بعد ذلك ، حدد ما يقرب من 1٪ طاقة ليزر لكل من الليزر 488 و 561 نانومتر. أثناء التركيز على مستوى الاهتمام ، حدد منطقة الاهتمام أو عائد الاستثمار. بعد ذلك ، باستخدام ليزر الصمام الثنائي 405 نانومتر بقوة ليزر 25٪ ، قم بتحويل الخلايا ضوئيا ، والمسح الضوئي على عائد الاستثمار ثلاث مرات.

في حالة عدم كفاية تحويل Kaede ضوئيا في عائد الاستثمار ، قم بمسح الليزر 405 نانومتر فوق المنطقة ثلاث مرات مرة أخرى. ارجع إلى وضع TCS SP8 على البرنامج ، وباستخدام الليزر 561 و 488 نانومتر بالتتابع ، في الوضع ثنائي الاتجاه ، احصل على مكدس Z. بعد التحويل الضوئي ، استخدم ماصة زجاجية للضغط لأسفل قليلا فوق رأس الجنين لكسر LMP agarose.

ثم امتصاص الجنين برفق. لغسل الوسط المحتوي على BDM ، أخرج الجنين من الماصة الزجاجية إلى طبق بتري 85 ملم يحتوي على وسط جنين مع PTU. انقل الجنين إلى بئر في صفيحة من ستة آبار تحتوي على وسط جنين باستخدام PTU.

خلال هذه الخطوة ، تأكد من ملاحظة الجنين الذي يدخل إلى أي بئر ، لأن هذا ضروري لربط موضع الخلايا المحولة ضوئيا في مراحل النمو اللاحقة. الآن بعد أن تمت إزالة الأجنة من الوسط المحتوي على BDM ، يجب أن تبدأ قلوبهم في النبض مرة أخرى في غضون خمس دقائق تقريبا. أعد الأجنة إلى الظلام عند 28.5 درجة مئوية للسماح لها بالاستمرار في النمو بشكل طبيعي.

في المرحلة المرغوبة ، أوقف القلب وأعد تضمين الأجنة ، كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو ، مع الاختلاف المهم المتمثل في أنه يجب معالجة الأجنة باستخدام BDM في أطباق منفصلة ومميزة لتتبعها. بالنسبة للأجنة التي يصل حجمها إلى 62 حصانا ، احصل على أكوام Z من الشغاف باستخدام 561 و 488 نانومتر لإشارات الفلورسنت الحمراء والخضراء ، على التوالي. بالنسبة للأجنة التي يزيد حجمها عن 62 حصانا ، استخدم ليزر متعدد الفوتون مضبوطا على 940 نانومتر لتصوير Kaede الأخضر بدلا من الليزر 488 نانومتر.

بالنسبة للأجنة التي يقل وزنها عن 48 حصانا ، من الممكن إسقاط AVC ثلاثي الأبعاد على صورة ثنائية الأبعاد لتحليلها. أولا ، عتبة الصورة. بعد ذلك ، امسح النقاط التي تقع خارج القلب.

لإجراء التجزئة اليدوية، قم بتوجيه الصورة الموجودة على اليسار لمطابقة الصورة الموجودة على اليمين. قم بتقسيم جانب القلب الذي يمر عبره المتجه البرتقالي ، وأضف نقاطا في اتجاه المتجه الأزرق. بعد ذلك ، قم باستيفاء المقاطع العرضية ، وقم بإسقاط شدة اللون على السطح.

أخيرا ، اضبط اتجاه AVC ، وقم بعرضه على سطح ثنائي الأبعاد. يظهر هنا مثال على قلب جنيني بعد التحويل الضوئي مباشرة عند 48 حصان. تم تحويل Kaede السيتوبلازمي في العديد من خلايا الجانب العلوي من AVC من الأخضر إلى الأحمر.

في نفس الجنين عند 80 hpf ، من الواضح أن الخلايا المحولة ضوئيا قد تكاثرت وهاجرت إلى الجانب الداخلي للصمام الأذيني البطيني العلوي. يظهر هنا مثال على جنين 36 حصانا حيث تم تحويل EdCs في الأذين والبطين. ثم يتم إسقاط AVC إلى بعدين لتسهيل التصور والتحليل ويسمح للمرء بتحديد المسافة بين المنطقتين المحوتين ضوئيا.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم تقليل وقت توقف القلب إلى الحد الأدنى لتجنب التأثير على النمو الطبيعي. من خلال الممارسة ، يمكن إكمال تحويل الصور في غضون 30 دقيقة تقريبا بشرط أن يكون كل شيء جاهزا مسبقا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تتبع خلايا الشغاف بعد التحويل الضوئي في جنين الزرد الحي وتحليل مجموعات البيانات الخاصة بك.