Name: Protocole de transfert de micro-ARN dans la moelle osseuse hématopoïétique cellules souches adultes pour activer la cellule génie combiné avec un ciblage magnétique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Découvrez une méthode de transfection non virale pour modifier les cellules souches hématopoïétiques CD133+ avec des microARN et des nanoparticules magnétiques. Cette approche permet d'améliorer les propriétés thérapeutiques des cellules et de suivre leur distribution par imagerie par résonance magnétique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par le ministère fédéral de l’éducation et recherche Allemagne (FKZ 0312138A et FKZ 316159), l’État Mecklembourg-Poméranie occidentale avec les fonds structurels européens (FSE/IVWM-B34-0030/10 et du FSE/IVBM-B35-0010/12) et le DFG (DA1296/2-1), le Fondation de cardiologie allemand (F/01/12), le BMBF (VIP + 00240) et la Fondation humide. En outre, F.H. et h sont pris en charge par le FORUN programme de Rostock University Medical Centre (889001).

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Ces dernières années, CD133+ SCs sont apparus comme une population de cellules prometteuses pour thérapies à base de SC, comme en témoignent plusieurs phases I, II et III des essais cliniques43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , <sup class=...

CD133+ SCs représentent une population de cellules souches et progénitrices hétérogène avec promettant potentiel pour la médecine régénérative. Leur différenciation hématopoïétique et endothéliales myogène potentiels1,2,3 permet le CD133+ cellules, par exemple, de contribuer au processus de néovascularisation par différenciation dans nouvellement formant des navires et l’activation de pro-angiogénique signalisation paracrine mécanismes4,5,6,7.
Malgré leur fort potentiel démontré dans plus de 30 essais cliniques approuvés (ClinicalTrails.gov), leur résultat thérapeutique est encore en discussion controversée4. En effet, une application clinique des SCs est entravée par la faible rétention dans l’organe d’intérêt et de la cellule initiale massif mort5,8,9. Supplémentaires d’ingénierie de CD133+ SCs avant transplantation pourrait aider à surmonter ces défis.
Une condition sine qua non pour une thérapie cellulaire efficace serait la réduction de la mort massive de cellules initiales afin d’améliorer la prise de greffe de cellules pertinentes thérapeutique10. Les études en cours ont démontré une perte immense cellule de 90 à 99 % dans fortement perfusés organes comme le cerveau et le coeur pendant les premières heures de 1 – 2, indépendamment du type de cellules transplantées ou application itinéraire11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC étiquetage utilisant des nanoparticules magnétiques (MNPs) permet une stratégie novatrice et non invasif pour cibler les cellules sur le site d’intérêt22,23,24,25,26 et permet simultanément de cellule de surveillance à l’aide de MRI27 et des particules magnétiques d’imagerie (MPI). Le plus efficace in vivo études appliquant cellule aimantée ciblant la rétention de la cellule utilisée après administration locale plutôt que de l’orientation de la cellule après injection intraveineuse23,24,28 . Par conséquent, notre groupe a conçu un système de livraison consistant de nanoparticules d’oxyde de fer superparamagnétique29. Avec cette technique, CD133+ SCs et les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) pourraient être efficacement ciblées, comme l’a montré in vitro tente30,31.
Un autre obstacle pour les thérapies de SC est l’environnement hostile inflammatoire des tissus touchés après la transplantation, qui contribue à la cellule initiale mort32. En plus de plusieurs études de préconditionnement, l’application des thérapeutiques pertinentes miRs était testé33; Il a été démontré avec succès qu’anti-apoptotique miRs inhibent l’apoptose in vitro et d’améliorent la prise de greffe cellulaire in vivo33. Ces petites molécules, composés de 20 à 25 nucléotides, jouent un rôle crucial en tant que modulateurs post-transcriptionnelle des ARN messagers (ARNm) et affectent donc cellules souches sort et le comportement34. En outre, l’introduction exogène de miRs éviter l’intégration stable indésirable dans le génome de hôte34.
Les tentatives actuelles pour la mise en place efficace des acides nucléiques (NAs) dans SCs primaires reposent principalement sur des virus recombinants8,35. Malgré l’efficacité de transfection haute, manipulation virus recombinant présente un obstacle majeur pour un chevet à traduction, par exemple, l’expression des gènes incontrôlable, pathogénicité, immunogénicité et mutagenèse insertionnelle35 ,,36. Par conséquent, les vecteurs non viraux tels que les constructions à base de polymères sont essentiels d’élaborer. Parmi ceux-ci, polyéthylènimine (PEI) représente un véhicule de livraison valide offrant des avantages pour miRs tels que de la condensation de NA à protéger d’une dégradation, assimilation, et intracellulaire par endosomale échapper37,38. En outre, des complexes de miR-PEI a démontré une biocompatibilité élevée dans les essais cliniques39. Par conséquent, notre système de livraison comprend une biotinylé ramifiés 25 kDa PEI lié à une streptavidine MNP-core30,31,40.
Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole complet décrivant (i) l’isolement manuelle des CD133+ SC de don de moelle osseuse humaine (BM) avec une caractérisation détaillée du produit SC et (ii) une stratégie de transfection efficace et doux d’une système de livraison magnétiquement non-virales base de polymères pour le génie génétique de CD133+ SCs à l’aide de miRs. CD133+ SCs sont isolées et magnétiquement enrichi de humaine ponction sternale de BM en utilisant une surface axée sur les anticorps magnétique-lancée de cellules (MACS) système de tri. Par la suite, la viabilité des cellules ainsi que la pureté de la cellule est analysée à l’aide de cytométrie en flux. Par la suite, miR/PEI/MNP complexes sont préparés et CD133+ SCs sont transfectées. 18 h après la transfection, l’efficacité de l’absorption et l’impact de la transfection sur SC marqueur expression et cellule de viabilité sont analysés. En outre, l’évaluation de la distribution intracellulaire des composés complexes transfection est effectuée illumination structurée microscopes (SIM) et de quatre couleurs d’étiquetage.

<table><tbody><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique avec bleu de méthylène</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7060</td><td>3</td></tr><tr><td> %anti-CD133/2-PE (clone : 293C3)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-853</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD34-FITC (clone : AC136)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-081-001</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45-APC-H7 (clone : 2D1)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>560178</tr><tr><td>colorant à la rhodamine ; Colorant Atto 565 conjugué à la biotine</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-71</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS LSRII Cytomètre en flux</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>CD133 particules de fer dextran superparamagnétiques liées aux anticorps ; CD133 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-049</td><td></td></tr><tr><td>collagénase B</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11088831001</td><td></td></tr><tr><td>chambre de comptage</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyanine 3 colorant précurseur marqué miR ; Cy3 Colorant pré-miR Contrôle négatif #1</td><td>Ambion</td><td>AM17120</td><td></td></tr><tr><td>Cyanine 5 colorant miR ; Colorant Cy5 Label IT Kit de marquage miARN</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 9650</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>10104159001</td><td>(100 U/mL)</td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 LSM 780 microscope confocal</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FcR Blocking Reagent, humain</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>kit de marquage de protéines vert vif ; Oregon Green 488 Kit d’étiquetage des protéines</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O10241</td><td></td></tr><tr><td>milieu de montage aqueux ; Fluoroshield</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>Tube de centrifugation à gradient de densité ; Leukosep Tube à centrifuger</td><td>Greiner Bio-One</td><td>89048-932</td><td></td></tr><tr><td>Porte-aimant MACS ; MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Filtre de pré-séparation MACS</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-041-407</td><td>30 &micro ; m</td></tr><tr><td>Colonne de séparation MACS (MS / LS)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-201 / 130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Aimant permanent MACS ; Séparateur MACS</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Filtre PVDF Millex-HV</td><td>Merck</td><td>SLHV013SL</td><td>0.45 &mu ; m</td></tr><tr><td>souris IgG 2b-PE</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-092-215</td><td></td></tr><tr><td>colorant réactif à l’amine ; Near-IR LIVE/DEAD Kit de coloration à cellules mortes fixable</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>milieu de séparation des lymphocytes humains ; Pancoll</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-60500</td><td>Densité : 1,077 g/mL</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-53500</td><td>sans Ca et Mg</td></tr><tr><td>PEI</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>408727 ramifié</td><td>; 25 kDa</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 U/mL, 100 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>de PFA</td><td>Merck Schuchardt OHG</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>précurseur non marqué miR ; Précurseur de miARN précurseur précurseur précurseur #1</td><td>Ambion</td><td>AM17110</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse des globules rouges</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Solution de décontamination de l’ARNase ; RNaseZap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>milieu lymphocytaire humain ; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyen</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-16500</td><td></td></tr><tr><td>supplément de cytokines humaines recombinantes ; StemSpan CC100</td><td>Stemcell Technologies</td><td>2690</td><td></td></tr><tr><td>milieu d’expansion cellulaire hématopoïétique sans sérum ; StemSpan H3000</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9800</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin MagneSphere Particules paramagnétiques</td><td>Promega Corporation</td><td>Z5481</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>T8154</td><td>0,4 %</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>0,5 M ; pH 8,0</td></tr><tr><td>ZEN2011 logiciel</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre NanoDrop 1000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonorex RK 100 SH bain-marie sonique</td><td>Bandelin electronic</td><td></td><td>Puissance nominale ultrasonique : 80 W ; Fréquence ultrasonique : 35 kHz</td></tr></tbody></table>

protocole de transfert de micro-arn dans la moelle osseuse hématopoïétique cellules souches adultes pour activer la cellule génie combiné avec un ciblage magnétique

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Tandis que CD133+ de cellules souches hématopoïétiques (SCs) ont fait leurs preuves à fournir à fort potentiel dans le domaine de la médecine régénérative, leur taux de rétention faible après une injection à l’endommagement des tissus ainsi que les taux de mortalité cellulaire massive observée conduire à très effet thérapeutique limité. Pour surmonter ces limitations, nous avons cherché à établir un protocole de base non viraux d’ingénierie cellulaire appropriée avant leur administration. La modification des CD133 humaine+ exprimant SCs à l’aide de microARN (miR) chargé polyplexes magnétique a été adressée en ce qui concerne l’efficacité d’absorption et de sécurité, mais aussi le potentiel de ciblage des cellules. S’appuyant sur notre protocole, nous pouvons atteindre les vitesses d’absorption miR haute de 80 à 90 %, tandis que le CD133+ propriétés de cellules souches ne sont pas affectées. En outre, ces cellules modifiées offrent l’option de ciblage magnétique. Nous décrivons ici une procédure sûre et très efficace pour la modification des CD133+ SCs. Nous espérons que cette approche visant à fournir une technologie standard pour l’optimisation des effets thérapeutiques des cellules souches ainsi que la surveillance du produit administré cellulaire par l’intermédiaire de l’imagerie par résonance magnétique (IRM).

Le protocole présenté décrit un isolement manuel et magnétique enrichissement humain CD133 dérivé de BM+ SCs avec une cellule indépendante virus ultérieures ingénierie de stratégie, comme une technologie non invasive pour la manipulation de cellules in vitro et en vivo outil de surveillance.
Cette technologie triple isolation permet une séparation des multinationales de la BM sternal prédigéré par ce...

Ce protocole illustre une procédure sûre et efficace pour modifier CD133+ des cellules souches hématopoïétiques. Présenté non-virale, magnétique polyplex approche fondée sur le peut fournir une base pour l’optimisation des effets thérapeutiques des cellules souches, aussi bien en ce qui concerne le suivi du produit cellule administré par imagerie par résonance magnétique.

Protocole de transfert de micro-ARN dans la moelle osseuse hématopoïétique cellules souches adultes pour activer la cellule génie combiné avec un ciblage magnétique

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Notre protocole peut répondre à des questions clés dans le domaine de la médecine régénérative, telles que si les cellules peuvent être améliorées pour leurs propriétés bénéfiques et si elles peuvent être ciblées sur le site d’intérêt. L’un des principaux avantages de notre protocole est le fait que les cellules peuvent être modifiées génétiquement de manière transitoire à l’aide de notre méthode de transfection non virale, conservant ainsi les propriétés des cellules. La méthode de Sauter peut fournir un aperçu de la modification des cellules souches hématopoïétiques qui peuvent être appliquées à d’autres types de cellules utilisées pour la transplantation, telles que les cellules souches mésenchymateuses.Pour commencer le protocole, préchauffez le milieu des lymphocytes humains à température ambiante et décongelez la collagénase B et la DNase. Prélevez la moelle osseuse dans un tube conique de 50 millilitres. Jetez tous les caillots existants.Prélever un échantillon de BM de 200 microlitres pour une analyse cytométrique en flux ultérieure. Conservez l’échantillon à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Ensuite, transférez dix millilitres de BM dans un nouveau

protocol-for-microrna-transfer-into-adult-bone-marrow-derived

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Combinatoires 5 protéines fluorescentes de marquage des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques permet in vivo suivi clonale par confocale et microscopie à deux photons, apportant des éclairages sur la moelle osseuse hématopoïétique architecture lors de la régénération. Cette méthode permet de cartographier de sort non-invasif des cellules HSPCs dérivés spectrale codés dans des tissus intacts pour de longues périodes de temps après la transplantation.

In vivo suivi clonale de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices Marqué par cinq protéines fluorescentes confocale et multiphotonique Microscopie

L’administration ciblée de cellules est utile dans diverses applications biomédicales.  L’objectif de ce protocole est d’utiliser des nanoparticules d’oxyde de fer superparamagnétiques (SPION) pour marquer les cellules et ainsi permettre des approches de ciblage cellulaire magnétique pour un haut degré de contrôle de l’administration et de la localisation des cellules.

Cellule étiquetage et le ciblage des nanoparticules d&#39;oxyde de fer Superparamagnetic

Chondrogenèse de cellules souches nécessite un réglage fin des conditions de culture. Nous présentons ici une approche magnétique pour les cellules de condensation, une étape essentielle pour initier chondrogenèse. De plus, nous montrons que la maturation dynamique dans un bioréacteur applique une stimulation mécanique aux constructions cellulaires et améliore la production de la matrice extracellulaire cartilagineuse.

L&#39;agrégation magnétique de cellules souches 3D et bioréacteurs Maturation pour Cartilage régénération

Ce manuscrit décrit l'efficacité, la livraison non virale de miR aux cellules endothéliales par un vecteur PEI / MNP et leur aimantation. Ainsi, en plus de la modification génétique, cette approche permet d'orientation magnétique des cellules et l'IRM détectabilité. La technique peut être utilisée pour améliorer les caractéristiques des produits thérapeutiques cellulaires.

préparation et<em&gt; In vitro</em&gt; Caractérisation des aimanté miR-modifié cellules endothéliales

Ce protocole décrit le génie génétique transitoire dentaire des cellules souches extraites du follicule dentaire humaine. La stratégie appliquée modification non viraux peut-être devenir une base pour l’amélioration des produits thérapeutiques des cellules souches.

Isolement, caractérisation et axée sur les micro-ARN de la Modification génétique des cellules souches humaines follicule dentaire

Les auteurs décrivent l’utilisation de greffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) pour évaluer le potentiel maligne de cellules hématopoïétiques génétiquement. TCSH est utile pour évaluer les diverses cellules hématopoïétiques malignes in vivo comme générant une grande cohorte de souris atteintes de leucémie ou de syndromes myélodysplasiques (SMD) afin d’évaluer de nouveaux traitements.

Utilisation de la greffe de cellules souches hématopoïétiques pour évaluer l’origine du Syndrome myélodysplasique

Le but du présent protocole est d’isoler les primates non-humains CD34+ des cellules de moelle apprêtée, gène-modification de ces cellules avec des vecteurs lentiviraux et de préparer un produit infusion dans l’hôte autologue. La longueur totale de protocole est d’environ 48 h.

Préparation et Modification de gène de Primate non-humaine souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices

Les protocoles décrits pour l'édition génomique très efficace des cellules hématopoïétiques et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) par le système CRISPR/Cas9 pour développer rapidement des systèmes de modèle de souris avec des modifications génétiques hématopoïétiques spécifiques au système.

Modification du génome de Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated pour l'étude des cellules hématopoïétiques dans les modèles de maladie

Le présent protocole décrit une procédure optimisée de culture de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) pour la greffe robuste de cellules génétiquement modifiées in vivo.

Édition génique CRISPR/Cas9 de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques pour des applications de thérapie génique

Ce protocole décrit la procédure d’édition du génome dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris à l’aide de complexes ribonucléoprotéiques Cas9-sgRNA assemblés in vitro et délivrés par électroporation.

Perturbation génique à haute efficacité dans les macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse à l’aide de complexes d’ARNsg Cas9-sgRNA électroporés

Ce protocole décrit l’injection intrafémorale de quelques cellules souches hématopoïétiques ou leucémiques, y compris des cellules génétiquement modifiées, dans des modèles murins de xénogreffes, ce qui permettra non seulement une transplantation rapide et sûre de cellules, mais aussi des analyses en série de la moelle osseuse.

Des injections intrafémorales simplifiées à l’aide de souris vivantes permettent une analyse continue de la moelle osseuse

Découvrez une méthode de transfection non virale pour modifier les cellules souches hématopoïétiques CD133+ avec des microARN et des nanoparticules magnétiques. Cette approche permet d'améliorer les propriétés thérapeutiques des cellules et de suivre leur distribution par imagerie par résonance magnétique.

Protocole de transfert de micro-ARN dans la moelle osseuse hématopoïétique cellules souches adultes pour activer la cellule génie combiné avec un ciblage magnétique (Vidéo) | JoVE Journal

Protocole de transfert de micro-ARN dans la moelle osseuse hématopoïétique cellules souches adultes pour activer la cellule génie combiné avec un ciblage magnétique

Explorer plus de vidéos