Ateş Ex Vivo sıçan beyin dilimleri kullanarak birincil olayları incelemek için alternatif bir yaklaşım

Bu işlemin genel amacı, aynı anatomik düzlemden elde edilen iki speküler hemiskıyı eş zamanlı olarak araştırmak ve bir tedaviyi takiben etkilerini tahmin etmektir. Bu yöntem, nörodejeneratif süreçlerde yer alan anahtar molekülleri etkileyen birincil olaylar gibi moleküler sinirbilim alanındaki önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, nörodejeneratif olayların altında yatan moleküler kaskadları sağlayabilmesi ve bu durumun gerçekleştirilebilmesidir.

Bu yöntem, nörodejenerasyonda meydana gelen birincil olaylar hakkında fikir verebilse de, farklı bozuklukların veya diğer organ ve doku özelliklerinin hayvan modellerini araştırmak için de uygulanabilir. İki farklı yapay beyin omurilik sıvısı hazırlayarak başlayın. Biri beyin dilimleme için, diğeri ise kuluçka adımı için kullanılır.

Dilimleme ACSF'yi hazırladıktan sonra, çözeltiyi karıştırın ve buz üzerinde tutun. Benzer şekilde, ACSF kaydını hazırlayın, ancak oda sıcaklığında tutun. Her iki çözeltiyi de oksijenlendirin.

Daha sonra, diseksiyon başlığında dekapitasyon ve beynin çıkarılması için aletleri hazırlayın. Ardından vibratom parametrelerini ayarlayın. Dilim kalınlığını gerektiği gibi ayarlayın.

Üç yüz mikron gibi. Frekansı yediye ve hızı altıya ayarlayın. Ardından vibratom odasını yerleştirin ve etrafını buzla sarın.

Beyin kesiti için, dilimleme ACSF'yi oksijenlendirmek için karbojen valfini açın. Dakikada yaklaşık iki mililitrelik minimum akış hızını seçin. Şimdi iki adet 15 mililitrelik tüpte, tus koşullarını hazırlayın.

Kontrol olarak 10 mililieter kayıt ACSF ile bir tüp yükleyin. Diğerini tedavi ile zenginleştirilmiş 10 mililitre kayıt ACSF ile yükleyin. Bu durumda, T30'un iki mikromoları.

Her iki tüpü de vorteksleyin ve ihtiyaç duyulana kadar buz üzerinde tutun. Cerrahi bir bıçakla kafatasının üzerindeki cildi kesin. Daha sonra makas kullanarak, kafatasını orta hat boyunca posteriordan koku ampullerinin üzerindeki kemiğe kadar kesin.

Ardından, beyne erişmek için forseps kullanarak kafatasının iki tarafını yanal olarak çekin. Beyne ventral olarak bir spatula yerleştirin. Yavaşça çıkarın ve buz gibi soğuk dilimleme ACSF'de yaklaşık beş dakika nemli tutun.

Soğuk ACSF'de dinlendikten sonra beyni bir filtre kağıdına aktarın. Ve beyinciği çıkardıktan sonra, beyni vibratom diskine dikey olarak yapıştırın. Daha sonra buz gibi soğuk dilimleme ACSF ile doldurulmuş kesit odasına aktarın.

Şimdi hazne çözeltisine oksijen akışını başlatın. Ardından kesme aralığını ayarlayın ve beyin kesitine devam edin. Standart yöntemleri kullanarak ilgilenilen bölgeyi içeren bölümleri toplayın.

Şimdi iki aynasal yarım dilim elde etmek için her bölümü orta çizgi boyunca küçük bir makasla dikkatlice bölün. Kontrol ve tedavi edilen durum için her bir hemislice çiftini kullanın. Bölündükten sonra hemiseksiyonları vibratom odasında beş ila on dakika dinlendirin.

Geri kalandan sonra, bir cam pipet kullanarak hemiseksiyonları oda sıcaklığında ACSF kaydı içeren köpüren bir kabın içine nazikçe aktarın. Ardından, devam etmeden önce hemiseksiyonların yaklaşık 30 dakika iyileşmesine izin verin. Kırılma sırasında, kontrol grubu için üç mililitre kayıt ACSF içeren üç cam şişe ve tedavi edilen grup için T30 ile zenginleştirilmiş üç mililitre ACSF içeren üç şişe yükleyin.

30 dakikalık dinlenmeden sonra, beş dakika içinde numuneyi banyolara aktarın. Önce ardışık yarım dilimleri bir fırça kullanarak kontrol solüsyonuna yükleyin. Daha sonra, farklı bir fırça kullanarak, kontralateral hemiseksiyonları tedavi çözeltisine aktarın.

Daha sonra, karbojenin numuneye verilmesi için şişeleri 21 gauge iğne içeren plastik tıpalarla kapatın. Beyin dokusunun herhangi bir hareketini önlemek için dakikada iki mililitre gibi minimum bir akış hızında oksijen verin ve bu da dokuda olası mekanik hasara neden olur. Bu, kurulumu tamamlar.

Şimdi beş saatlik bir kuluçka dönemine başlayın. İnkübasyondan sonra oksijen akışını durdurun ve şişelerin kapağını açın. Daha sonra, uygun fırçayı kullanarak yarım dilimleri buz üzerinde tutulan 250 mikrolitre lizis tamponu içeren 1,5 mililitrelik tüplere nazikçe aktarın.

Daha sonra ayrı havaneli kullanarak her dokuyu homojenize edin. Altı numunenin tümü için transfer ve homojenizasyon adımlarını 10 ila 15 dakika içinde tamamlayın. Şimdi homojenize edilmiş numuneleri yerçekiminin 1.000 katında dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin.

Sıkma işleminden sonra, süpernatanları yeni tüplere aktarın ve numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. Toksik bir peptit olan T30'un fesleğen ön beynine hemiseksiyon içeren uygulanmasının doku üzerinde üç bölgeye özgü etkisi olmuştur. Alfa yedi nikotinik reseptörün ekspresyonunu, Tau'nun fosforilasyonunu ve amiloid beta ekspresyonunu modüle etti.

Nikotinik reseptör, rostral tedavi edilen hemisekte önemli bir artış gösterirken, ara dilim iki koşul arasında herhangi bir değişiklik göstermedi. Arka bölümde, T30'a maruz kalan kısımda önemli bir azalma mevcuttu. Fosforile Tau seviyeleri anterior bölgede önemli ölçüde artmıştır.

yandan, fesleğen ön beynin diğer iki bölümü koşullar arasında önemli bir fark göstermez. Amiloid beta, rostral ve orta hemikesitlerde T30 maruziyetinden sonra önemli ölçüde artmıştır. Bununla birlikte, kodal slaytta, amiloid beta ekspresyonu üzerinde ölçülebilir bir etki yoktu.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa yedi saat içinde yapılabilir.