Антимикробные пептиды, производится путем селективного давления включения неканонических аминокислот

Общая цель данной методологии заключается во включении неканонических аминокислот в рибосомально синтезируемые антимикробные пептиды. Получают новые денатуративные пептиды, проверяют их на наличие ncAA и проверяют на антимикробную активность с помощью агаровых диффузионных анализов. Этот метод может помочь ответить на некоторые ключевые вопросы в области противомикробных препаратов или бактерий, такие как роль определенных пептидных позиций в механизме действия или в развитии резистентности.

Следуя тем же принципам, различные виды вирусов, такие как меньшее количество пептидов или могут быть получены, и обнаруживаемость может быть проверена против патогенов, таких как MRSA. Новые для природы пептиды могут быть получены для разработки противомикробных агентов для борьбы с патогенами и преодоления дефицита противомикробных препаратов. Основное преимущество этой методики заключается в том, что разнообразие неканонических аминокислот можно тестировать параллельно, не требуя изменений на генетическом уровне.

Следовательно, относительно легко производить несколько модифицированных пептидов параллельно. Чтобы начать эту процедуру, приготовьте 25 миллилитров среды LB, содержащей антибиотики и один процент глюкозы, в 100-миллилитровую колбу Эрленмейера. Привите его с помощью колонии свежетрансформированных бактериальных клеток или клеток из замороженного клеточного фонда.

Инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 200 оборотах в минуту. На следующий день добавьте 10 миллилитров ночной культуры на один литр стерильной свежей среды. Смешайте и разделите культуру на две культуры по 500 миллилитров каждая в двухлитровой колбе Эрленмейера и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 200 об/мин в течение двух часов Через два часа измерьте внешний диаметр 600, используя стерильную среду в качестве заготовки.

Продолжайте инкубацию и измеряйте OD через равные промежутки времени, пока OD 600 не станет равным 0,5. Затем вытащите обе бактериальные культуры и центрифугируйте при температуре 4 градуса Цельсия и 4 500 x g в течение 15 минут. Затем слейте и выбросьте надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте клеточную гранулу в ведро центрифуги, помещенное на лед с 20 миллилитрами NMM19, содержащим антибиотики, и одним процентом глюкозы. Переложите клеточную суспензию в пробирку объемом 50 миллилитров и центрифугируйте при температуре 4 градуса Цельсия и 4 500 х г в течение 10 минут. Далее суспендируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах той же свежей среды на лед.

Перелейте клеточную суспензию в 500 миллилитров свежей среды и инкубируйте при температуре 30 градусов Цельсия и 200 об/мин в течение одного часа. Через час разделите культуру на две равные части в отдельных колбах, по одной на каждую ncAA или контроль соответственно. К каждой культуре добавляем исходный запас ncAA до конечной концентрации одного миллимольяра, а в контрольную величину дикого типа добавляем запас L-пролина на один миллимоляр.

Затем индуцируйте экспрессию генов-мишеней с помощью одного миллимолярного IPTG. Инкубируйте культуры в течение ночи при температуре 28 градусов Цельсия и 200 оборотах в минуту. На следующий день измерьте OD и возьмите по одному миллилитру каждой культуры для анализа активности.

Соберите оставшиеся клетки каждой культуры, многократно центрифугируя их при четырех градусах Цельсия и 5000 x g в течение 20 минут. Каждый раз извлекайте и выбрасывайте надосадочную жидкость до тех пор, пока не будут собраны все клетки. Храните гранулы клеток при температуре минус 80 градусов Цельсия до очистки пептида.

Для приготовления ГМ17-агаровых планшетов сначала приготовьте пятимиллилитровую ночную культуру индикаторного штамма из замороженного глицеринового запаса в бульоне М17 с одним процентом глюкозы и пятью микрограммами на миллилитр хлорамфеникола в 25-миллилитровой колбе Эрленмейера. Выдерживайте при температуре 30 градусов Цельсия, не встряхивая. На следующий день измерьте внешний диаметр с помощью среды GM17 в качестве заготовки Добавьте пять миллилитров свежей среды в новую колбу.

Прививают до наружного диаметра 600, равного 0,1, и продолжают инкубацию. Через два часа измеряйте наружный диаметр через равные промежутки времени, пока значение не достигнет 0,4–0,6. Затем поместите и держите предкультуру на льду.

Сделайте 1,5-процентный агар, взвесив 4,5 грамма агара в стеклянной бутылке. Добавьте 300 миллилитров дважды дистиллированной воды, затем перемешайте и автоклав. Приготовьте два бульона М17 в 300 миллилитрах двойной дистиллированной воды и автоклав.

Добавьте один миллилитр предварительной культуры Lactococcus lactis к 25 миллилитрам двух бульона М17, содержащего 10 микрограммов на миллилитр хлорамфеникола и два процента глюкозы. Затем добавьте 25 миллилитров теплой смеси расплавленного агара и вылейте раствор в большую чашку Петри. Сохраняя стерильные условия, просушите тарелку в течение 10 – 15 минут.

Затем простерилизуйте концы стеклянной пипетки Пастера с помощью пламени После того, как пипетка остынет, используйте ее широкий конец для создания отверстий в затвердевшем агаре. Пометьте дно чашки Петри для каждого образца рядом с соответствующим положением отверстия. Для анализа активности берут 1 миллилитр образцов культур производства E.coli и центрифугируют их в течение трех минут при 7000 х г Аспирируют оставшуюся среду и ресуспендируют клеточную гранулу в 500 микролитрах буфера фосфата натрия путем пипетирования.

Затем произведите ультразвуковую обработку образца на льду, погрузив наконечник ультразвукового зонда в клеточную суспензию. Начните ультразвуковую обработку. Затем центрифугируйте лизат клеток в течение 10 минут при давлении 13 000 x g до гранул клеточного мусора.

Перенесите надосадочную жидкость в новую реакционную пробирку на льду. Разбавить и нормализовать надосадочную жидкость до одного миллилитра наружного диаметра 600, равного 0,6, относительно плотности собранных клеток, с натриевым фосфатным буфером и перемешать. Чтобы проверить антимикробную активность, добавьте 40 микролитров нормализованного образца в назначенное отверстие индикаторного агара.

Подождите, пока все образцы распыляются в агар. Инкубируйте тарелку на ночь при температуре 30 градусов Цельсия. На следующий день сделайте снимки агаровой плиты с помощью планшетного сканера или цифровой камеры.

Размер ореола ингибирования роста можно измерить вручную или с помощью программного обеспечения. Для флуоресцентной микроскопии приготовьте 10 миллимолярный раствор нильского красного в ДМСО. Для анализа активности в культуре индикаторный штамм до OD 600 равен единице.

Центрифугируйте один миллилитр культуры в течение трех минут при четырех градусах Цельсия и 5000 х г. После этого выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте образец в одном миллилитре PBS. Затем центрифугируйте образец и снова суспензируйте.

Впоследствии добавьте один микролитр раствора нильского красного бульона и аккуратно перемешайте. Для получения микроскопического изображения добавьте 30 микролитров клеточного препарата на предметное стекло при воздействии 520 нанометров. Установите время съемки на 0,2 секунды, кинетическую серию на 0,1 Гц и длину серии на 200 изображений.

Затем добавьте от 0,3 до 1,5 микролитров клеточного лизата или очищенных образцов пептида. Контролируйте и записывайте флуоресцентное излучение на длине волны, равной или превышающей 560 нанометров. Храните последовательности изображений в виде файлов avi и анализируйте изображения с помощью ImageJ.

На рисунке показано ингибирование роста штамма бактериального индикатора рекомбинантными антимикробными пептидами, содержащими аналоги пролина. В рамках диффузионного анализа агарового сварного шва вокруг положений образца становятся видимыми ореолы торможения. В этом видео показана покадровая флуоресцентная микроскопия индикаторного штамма без добавления антимикробных пептидов.

Со временем бактериальные клетки откладываются на предметном стекле, так как был добавлен только буфер, внешний вид клеток не меняется в течение 20 минут наблюдения. Этот таймлапс флуоресцентной микроскопии показывает воздействие антимикробного пептида на клетки индикаторного штамма. Со временем бактериальные клетки выглядят агрегированными и размытыми после воздействия варианта низина, содержащего неканоническую аминокислоту 4R гидроксипролин, как выделено стрелкой.

Отмеченный кружками световой материал диффундирует из клеток в буфер, что указывает на то, что фрагменты мембраны были мобилизованы. На этом рисунке показаны эффекты после инкубации индикаторного штамма в настоящее время на низин дикого типа или варианты, содержащие неканонические аминокислоты. После воздействия антимикробного пептида клетки бактерии агрегируются, как показано кружками.

Указывая на клеточные лизаты, вокруг клеток становится видимым световой материал, как показано стрелками. Большое количество искаженных и агрегированных клеток присутствует уже через 20 минут инкубации в отличие от отрицательного контроля. После освоения этой техники ее можно выполнить за четыре дня.

Это включает в себя производство модифицированных пептидов ncAA и тестирование активности с использованием агаровых диффузионных анализов сварных швов и флуоресцентной микроскопии. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости использовать свежие бактериальные культуры и подходящие питательные среды и обращаться с ними осторожно. Для тестирования активности всегда включайте соответствующие положительные и отрицательные контрольные данные.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы очистки пептидов с помощью аффинной хроматографии и/или ВЭЖХ. Масс-спектрометрия является обязательной для доказательства включения неканонической аминокислоты. После своего развития этот метод проложил путь для исследователей к изучению новых антимикробных пептидов, других антибактериальных или микробных хозяев, которые могут быть использованы для производства различных пептидов и для тестирования антимикробной активности.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как включать неканонические аминокислоты в антимикробные пептиды.