Induktion und Validierung der zellulären Seneszenz in primären humanen Zellen

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich des Alterns und der Krebserkrankung zu beantworten, z. B. wie gängige Techniken zur Induktion der zellulären Seneszenz durchgeführt werden und wie der Seneszenz-Phänotyp bewertet werden kann. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie einfach zu befolgen ist, hochgradig reproduzierbar ist, keine spezielle oder teure Ausrüstung erfordert und bei mindestens 50% der Zellbevölkerung zur Induktion der Seneszenz führt. Dieses Verfahren wird von Alejandra Hernandez-Segura, einer Doktorandin aus unserem Labor, demonstriert.

Zu Beginn säen Sie sieben mal 10 bis zum fünften lebensfähigen primären Fibroblasten mit einer niedrigen Populationsverdopplung oder PD in einem T75-Kolben aus, der 10 Milliliter D10 enthält. Inkubieren Sie die Zellen in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und 5% Sauerstoff über Nacht. 11 Mikroliter der 1.000-fachen Doxorubicin-Stammlösung in 11 Millilitern D10 auf eine Endkonzentration von 250 Nanomolar verdünnen.

Anschließend saugen Sie das Medium aus den Zellen ab und ersetzen es durch 10 Milliliter D10 plus Doxorubicin. Inkubieren Sie die Zellen in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und 5 % Sauerstoff für genau 24 Stunden. Aspirieren Sie dann das Medium und verwenden Sie 10 Milliliter D10, um die Zellen einmal vorsichtig zu waschen.

Inkubieren Sie die Zellen weitere sechs Tage lang in 10 Millilitern D10 und wechseln Sie das Medium regelmäßig, etwa alle drei Tage. Um eine Beta-Galactosidase-Färbung durchzuführen, säen Sie für jede Probe einmal 10 bis die vierten Zellen in mindestens eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, die 500 Mikroliter D10 enthält, so dass die Zellen spärlich sind. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und 5% Sauerstoff über Nacht.

Verwenden Sie am nächsten Tag 500 Mikroliter PBS, um die Zellen zweimal zu waschen. Fügen Sie dann 500 Mikroliter 2 % Formaldehyd plus 0,2 % Glutaraldehyd in PBS pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Zellen drei bis fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, um sie zu fixieren. Verwenden Sie dann 500 Mikroliter PBS, um die Zellen zweimal zu waschen.

Fügen Sie nach der Zubereitung einer frischen Färbelösung 500 Mikroliter pro Vertiefung hinzu und verwenden Sie Parafilm, um die Platte zu versiegeln, um eine Verdunstung zu vermeiden, die zur Bildung von Kristallen führen kann. Inkubieren Sie die Zellen im Dunkeln bei 37 Grad Celsius in einem Trockenbrutkasten ohne Kohlendioxid für 12 bis 16 Stunden. Verwenden Sie dann 500 Mikroliter PBS, um die Zellen zweimal zu waschen.

Überprüfen Sie die Zellen unter einem normalen Lichtmikroskop, um die Ergebnisse zu beurteilen, bei denen positive Zellen mit blauer paranukleärer Färbung erscheinen. Um die Visualisierung und Quantifizierung einzelner Zellen zu erleichtern, verwenden Sie DAPI als Gegenfärbung. Bestimmen Sie dann mit einem Fluoreszenzmikroskop den Prozentsatz positiver Zellen im Vergleich zur Gesamtzahl der Zellen, die mehrere Bilder derselben Probe aufnehmen, um mindestens 100 einzelne Zellen zu bewerten.

Legen Sie für jede Probe oder Bedingung ein Deckglas pro Vertiefung in eine 24-Well-Platte. Säen Sie eine mal 10 bis zur vierten Zellte mit 500 Mikrolitern D10 pro Vertiefung aus, so dass die Zellen spärlich sind. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und 5% Sauerstoff über Nacht.

Bereiten Sie genügend 20-mikromolare EdU-Lösung und D10 vor, so dass jede Probe 250 Mikroliter erhält. Entfernen Sie die Hälfte des Mediums aus jeder zu behandelnden Vertiefung und ersetzen Sie es durch EdU D10-Lösung. Die endgültige EdU-Konzentration beträgt 10 Mikromolare.

Inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und 5 % Sauerstoff für 18 bis 24 Stunden. Verwenden Sie die gleiche Inkubationszeit für Kontroll- und seneszente Zellen. Verwenden Sie nach der Inkubation 500 Mikroliter PBS, um die Zellen zweimal zu waschen.

Fügen Sie dann 500 Mikroliter 4%iges Formaldehyd in PBS hinzu und inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang, um sie zu fixieren. Nach der Fixierung werden 500 Mikroliter 100 millimolare Tris pH 7,6 zu den Proben gegeben und fünf Minuten lang inkubiert. Geben Sie anschließend 500 Mikroliter 0,1% Triton X-100 in PBS zu den Zellen und permeabilisieren Sie sie 10 Minuten lang.

Waschen Sie die Proben dann mit PBS dreimal. Bereiten Sie 50 Mikroliter Etikettenmischung für jedes Deckglas vor und fügen Sie die Komponenten in der folgenden Reihenfolge hinzu: 44,45 Mikroliter PBS, 0,5 Mikroliter Kupfer(II)sulfat, 0,05 Mikroliter Sulfo-cy3-azid und fünf Mikroliter Natriumascorbat. Pipettieren Sie 50 Mikroliter der Etikettenmischung auf ein Stück Parafilm.

Heben Sie dann mit einer Pinzette und einer Nadel das Deckglas an und legen Sie es mit der Zellseite nach unten auf die Etikettenmischung. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen vorhanden sind und dass die gesamte Oberfläche des Deckglases die Etikettenmischung berührt. Inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang im Dunkeln.

Legen Sie die Zellen zurück in die Vertiefungen der 24-Well-Platte und waschen Sie sie dreimal mit PBS. Verwenden Sie dann Eindeckmedium mit DAPI, um die Proben zu mounten und über Nacht trocknen zu lassen. Zu Beginn säen sieben mal 10 bis zum fünften lebensfähigen primären Fibroblasten mit einer geringen Populationsverdopplung oder.

Stellen Sie mindestens 100 Zellen pro Bedingung dar. Quantifizieren Sie abschließend den Prozentsatz der Zellen, die EdU integriert haben, indem Sie die folgende Formel verwenden. Durchführung von Gen- und Proteinexpressionsstudien gemäß dem Textprotokoll.

Hier sind repräsentative Bilder der SA-beta-Gal-Färbung in proliferierenden und seneszenten primären Fibroblasten zu sehen. Seneszente Zellen sehen in einem normalen Zellkörper vergrößert aus. Wie bereits erwähnt, kann es schwierig sein, einzelne Zellen zu unterscheiden.

Daher erleichtert die Co-Färbung mit DAPI die Visualisierung und Zellzählung. In diesem Experiment wurde Suflo-cy3-azid verwendet, um eine kupferkatalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition in der Population durchzuführen. Wenn die Kopplung des Azids an das Alkin stattgefunden hat, zeigen die Zellen unter einem cy3-Filter eine Fluoreszenz, die proliferierende von nicht proliferierenden Zellen unterscheidet.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in 36 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, beim Umgang mit Zellen außerhalb des Inkubators so schnell wie möglich zu sein, da Schwankungen in der Sauerstoffkonzentration die Ergebnisse beeinträchtigen können. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Zytokin-Array oder Western Blot durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Menge der sezernierten Proteine oder das Verständnis spezifischer Signalwege zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Alterns und der Krebsforschung, um zu erforschen, wie seneszente Zellen an physiologischen und pathologischen Zuständen bei Säugetieren beteiligt sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Seneszenz in Primärzellen reproduzierbar induzieren und wie Sie ihren Seneszenzstatus beurteilen können.