Name: Diferenciación, mantenimiento y análisis de células del epitelio pigmentario de la retina humana: un modelo de enfermedad en un plato para las mutaciones BEST1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Aprende a diferenciar células del epitelio pigmentario de la retina a partir de células madre pluripotentes humanas con mutaciones BEST1. Este modelo en placa permite estudiar mecanismos moleculares de bestrofinopatías y explorar terapias de reemplazo celular.

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Este proyecto fue financiado por subvenciones de NIH EY025290 y GM127652 de la Universidad de Rochester financiación de puesta en marcha.

1. diferenciación de hPSC para RPE
<ol><li>Mantener y paso hPSCs como describió anteriormente18. Nota: Todas las células (incluyendo hPSCs y hPSC RPEs) se cultivan en 37 ° C en 5% CO2 a lo largo de la duración de los protocolos de crecimiento y diferenciación.</li>
	<li>
Antes de la diferenciación, split hPSCs confluentes en placas de 6 pocillos prelacadas.
	<ol>
<li>Capa de placas, matriz de la membrana del sótano en hielo durante aproximadamente 1 hora de descongelar, suspender liquidized matriz en medio DMEM de 4 ° C en un 1:50 dilución, agregue la mezcla de capa de 800 μl a cada pozo e incubar durante al menos 1 h a 37 ° C.</li>
		<li>Cuando la capa está completa, aspirar la mezcla y añadir medio de 1,5 – 2 mL en los pocillos.</li>
		<li>Para levantar el hPSCs de las placas de cultivo antiguo, incubar las células con PBS más 0,5 mM EDTA durante 5 minutos a temperatura ambiente, aspirar la solución y resuspender las células en pequeños grupos con medio de cultivo.</li>
		<li>Células de semilla en confluencia de ~ 20% en las nuevas placas. Nota: Tienda matriz de la membrana del sótano en alícuotas de μl 100 a-20 ° C y utilizar una alícuota para recubrir una placa de 6 pozos. El tiempo de recubrimiento puede prolongarse hasta 4 h a 37 ° C, o durante la noche a temperatura ambiente. Es importante suspender y semillas hPSCs como pequeños grupos de 3 a 5 células en lugar de las células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuando las células se cultivan en plena confluencia, sustituir el medio de cultivo con medio de diferenciación (4 mL/pocillo) (tabla 1, sin activina-A). La cultura durante 14 días, cambiando el medio (4 mL/pocillo) 3 x / semana. Nota: Se espera que las hPSC placa densidad dobles aproximadamente cada 24 h. muerte celular importante después del inicio del procedimiento de diferenciación. Agregados de células muertas y los desechos de los pozos se pueden ver a simple vista durante los cambios de medio.</li>
	<li>Del día 15 al día 28, suplemento medio de diferenciación con 100 ng/mL humanos activina-A (tabla 1, con humanos activina-A). Cambiar el medio (4 mL/pocillo) 3 x / semana.</li>
	<li>Deje de activina-A la suplementación a partir del día 29 (tabla 1, sin humanos activina-A). Continuar el cultivo celular en medio de la diferenciación para 8 – 10 semanas hasta que racimos hPSC-RPE pigmentadas (figura 1A-B). Nota: Grupos de células pigmentadas pueden verse como pequeños puntos oscuros en una placa de cultivo celular a simple vista (figura 1A-B, arriba). Células pigmentadas individuales con forma de guijarro de firma pueden verse al microscopio 20 X (figura 1A-B, parte inferior).</li>
</ol>2. aislamiento y cultivo de células RPE diferenciados
<ol><li>Retire el medio de diferenciación, lavar una vez con PBS, añadir 1 mL de tripsina 0,05% y 1 U/μl de colagenasa en cada pozo, incubar a 37 ° C durante 20-30 min Quite la tripsina/colagenasa y suavemente agregar 2 mL de medio RPE precalentado en cada pocillo de la placa de la pozo 6 (< C0 > tabla 2). Nota: Utilice un microscopio invertido para controlar la morfología de las células de RPE hPSC, que son poligonales antes del tratamiento de tripsina/colagenasa, y se convierten en la redondo después de la digestión suficiente.</li>
	<li>
Use un mechero de Bunsen al tirar vidrio Pipetas Pasteur.
	<ol>
<li>Con ambas manos, sujete una larga pipeta Pasteur (9 pulgadas) en ambos extremos por lo que es horizontal y sobre la hornilla de Bunsen 2/3 la longitud de la parte fina de la pipeta.</li>
		<li>Una vez que el vidrio se convierte en suave de la llama, rápidamente separe los dos extremos, tal que un micro punta de raspador-como se forma en el nuevo extremo de la pipeta (figura 2).</li>
		<li>Repita varias veces para crear múltiples "raspadores de la célula". Rocíe las pipetas tiradas con etanol al 70% para la esterilización y secar en la campana de la cultura de célula.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bajo un microscopio, utiliza una micro "raspador de célula" suavemente disociar grupos pigmentadas hPSC-RPE de la placa.
	<ol>
<li>Golpee ligeramente (no rascar) directamente en las células pigmentadas, que flotan para arriba en el medio de cultivo una vez que disocian de la parte inferior del pozo.</li>
		<li>Inmediatamente utilice una micropipeta de 20 μl suavemente las células disociadas hPSC-RPE de succión y transferirlas a una placa de 6 pozos prelacada con RPE media24.</li>
		<li>Recoger ~ 5 x 103 células (confluencia de ~ 10% como se observa al microscopio 20 X) en cada uno previamente revestido de una placa de 12 pozos, repitiendo los pasos 2.3.1–2.3.2 varias veces, según sea necesario. Llevar el volumen final de medio a 2 mL. Nota: Para evitar disociado hPSC-RPE células de flotación, no movimiento de las placas durante el proceso de disociación que las células disociadas están flotando en el medio pero siguen siendo localmente concentradas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Células en cultivo recién aislado hPSC-RPE (P0) en las placas de 12 pozos en medio de la RPE durante otras 6-8 semanas para que puedan formar una monocapa pigmentada (figura 1).</li>
	<li>Cambiar el medio 3 x / semana. Cuando se cambia el medio, deja aproximadamente 1/3 volumen del medio vieja en cada pozo y añadir 2/3 volumen de medio fresco, precalentado de RPE. En esta fase, usar 2 mL de medio RPE para cada pocillo de una placa de 12 pozos (por lo tanto, intercambio de 1,3 mL de medio cada vez). Nota: La monocapa de células de P0 hPSC-RPE puede formar cúpulas, sugiriendo que las células activamente son transporte de fluidos y son ancladas por uniones estrechas25. Por lo tanto, formación del domo es un indicador de estado maduro de RPE.</li>
</ol>3. RPE destino validación por Immunoblotting
<ol><li>Hacer la célula hPSC-RPE lisado con tampón de extracción de la proteína mamífera con inhibidor de la proteinasa cóctel. Incubar el lisado celular en hielo durante 30 minutos antes de la centrifugación a 13.000 x g durante 15 min a 4 ° C para eliminar restos celulares sin disolver. Medir la concentración de proteína total de lisado.</li>
	<li>Desnaturalizar 40 μg de proteína total en Tampón Laemmli SDS a 75 ° C por 10 minutos separan la proteína muestras en gel de SDS-PAGE de Tris glicina 10% a una tensión constante de 90 V por 15 min y luego 150 V hasta que la frente llegue a tinte la parte inferior del gel.</li>
	<li>La transferencia de las proteínas en una membrana de nitrocelulosa en solución tampón de Tris glicina previamente enfriado suplementado con 10% de metanol a 100 V durante 1 hora.</li>
	<li>Bloquear la membrana en solución salina tamponada con Tris con 0,1% detergente no iónico (TBST) y leche en polvo sin grasa 5% durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar la membrana con anticuerpos primarios diluidos en la solución amortiguadora de bloqueo a 4 ° C durante la noche. Diluir los anticuerpos dirigidos a proteínas del marcador específico de RPE como sigue: RPE65, 1:1, 000; CRALBP, 1:1, 000; BEST1, 1:1, 000. Diluir el anticuerpo contra β-actina en 1: 10,000 para detectar β-actina como control de carga.</li>
	<li>Lavar la membrana con TBST 3 veces, con 5 minutos para cada lavado.</li>
	<li>Incubar la membrana con fluoróforo cabra conjugado anti-ratón IgG anticuerpo secundario diluido 1: 10,000 en solución amortiguadora de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar la membrana con TBST 4 veces, con 10 minutos para cada lavado.</li>
	<li>Detectar las proteínas mediante un sistema (figura 3) la proyección de imagen de infrarrojos.</li>
</ol>4. comprobación de localización subcelular BEST1 immunostaining
<ol><li>Lavar una vez las células RPE hPSC con 2 mL de PBS y se fijan en 2 mL de paraformaldehído al 4% durante 45 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar dos veces con 2 mL de PBS e incubar las células en 2 mL de PBS con 0.1% no iónico surfactant y el 2% burro suero de 45 min bloquear los sitios de Unión inespecífica.</li>
	<li>Incubar las células con el anticuerpo BEST1 (dilución 1: 200) por 2 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar las células con 2 mL de PBS 3 veces. Incubar con fluoróforo conjugada secundaria IgG (1:1, 000) por 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar con 2 mL de PBS 3 veces para retirar el anticuerpo secundario independiente.</li>
	<li>Observar células por microscopía confocal (figura 4).</li>
</ol>5. grabación Ca2 +-dependiente corriente de Cl– en hPSC-RPE por celulares Patch Clamp
<ol><li>24 – 72 h antes de la abrazadera del remiendo, dividir completamente confluente (en una placa de 12 pozos) de células maduras de hPSC-RPE de0 P (en forma de guijarro y pigmentado). Aspire el medio, lave una vez con PBS y agregar 1 mL de tripsina 0,05% plus 1 colagenasa U/μL en el pozo. Nota: Precaliente la tripsina/colagenasa a 37 ° C antes de usar.</li>
	<li>Incubar a 37 ° C durante 8 minutos. Nota: Después de este paso, las células de RPE hPSC siguen siendo adherente y conectado.</li>
	<li>Utilizar una micropipeta de 1 mL para lavar suavemente las células de la placa y transferencia de las células en la mezcla de digestión a un tubo cónico de 15 mL. Lavar el pozo con 1 mL de tripsina/colagenasa precalentado para recoger las células residuales y combinarlos en el tubo cónico de 15 mL. Nota: Las células de RPE hPSC todavía están en grupos grandes en este punto. No trate de romper los grumos de células mediante pipeteo vigoroso. Algunos grupos pueden adherirse a la pared interna de la punta de 1 mL.</li>
	<li>Incubar el tubo cónico en un baño seco de 37 ° C durante 8 minutos.</li>
	<li>Utilice una micropipeta de 1 mL para suavemente la pipeta hacia arriba y abajo 10 a 15 veces la mezcla de digestión. Nota: Grupos de células se convierten en mucho más pequeños pero aún visible. Evitar pipetear vigoroso.</li>
	<li>Repita los dos pasos anteriores. Nota: La mayoría de las células debe ser unicelular suspensión después de su uso. Todavía puede haber algunos macizos de células pequeñas, que son aceptables. Opcional: Incubar el tubo cónico a 37 ° C por un adicional 5 min seguido mediante pipeteo suave. El tiempo total en la tripsina/colagenasa a 37 ° C no debe exceder 30 min (8 + 8 + 8 + 5 = 29).</li>
	<li>Añadir 5 mL de medio RPE precalentado al tubo cónico de 15 mL que contiene las células digeridas. Girar a 200 x g durante 5 minutos recoger las células. Las células Resuspenda y semillas en platos de 35 mm prelacado en confluencia de 10 – 20% (por ejemplo, un 100% confluentes en una placa de 12 pozos a cinco platos de 35 mm para 10% confluencia). Nota: En todo momento, evitar pipeteo vigoroso, que puede causar la muerte celular importante representada por restos de células oscuras aparente en el sobrenadante tras la centrifugación. Bien separados unicelular siembra es esencial para la grabación de abrazadera del remiendo.</li>
	<li>Realizar el parche de células completas de la abrazadera como se describió anteriormente18,26,27,28,29,30,31. Adquirir los rastros actuales de una familia de potenciales de paso (-100 a + 100 mV de un potencial de explotación de 0 mV) (figura 5). Nota: Las recetas de soluciones internas y externas se describen en la tabla 3 y tabla 4, respectivamente.</li>
</ol>

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<li>Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preassociated+apocalmodulin+mediates+Ca2%2B-dependent+sensitization+of+activation+and+inactivation+of+TMEM16A%2F16B+Ca2%2B-gated+Cl-+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).</li>
<li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+selectivity+in+bestrophin+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and selectivity in bestrophin ion channels.</a> Science. 346 (6207), 355-359 (2014).</li>
<li>Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+RGK+GTPases+differentially+use+alpha1-+and+auxiliary+beta-binding-dependent+mechanisms+to+inhibit+CaV1.2%2FCaV2.2+channels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels.</a> PLoS One. 7 (5), e37079(2012).</li>
<li>Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+molecules+for+inducibly+inactivating+CaV+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels.</a> Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).</li>
<li>Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rem%2C+a+member+of+the+RGK+GTPases%2C+inhibits+recombinant+CaV1.2+channels+using+multiple+mechanisms+that+require+distinct+conformations+of+the+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase.</a> J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).</li>
<li>Gong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Human+Protein-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+toward+a+Retinal+Pigment+Epithelial+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate.</a> PLoS One. 10 (11), e0143272(2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+activates+bestrophin+ion+channels+through+direct+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction.</a> Nat Commun. 9 (1), 3126(2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El procedimiento más importante para el abordaje de la enfermedad en plato es distinguir hPSCs con una mutación enfermedad-que causan que el linaje de la célula correcta, que es el RPE para BEST1. Así, después de cada experimento de diferenciación, las células RPE hPSC resultante deben ser cuidadosamente validadas para su estado maduro morfologías específicas de RPE y proteínas marcadores16,17,18. Para minimizar el arte...

Se ha documentado que al menos cinco enfermedades degenerativas retinianas son causadas por mutaciones genéticas en el BEST1 gene1,2,3,4,5,6 , 7 , 8, con el número de mutaciones divulgadas ya sobre 200 y aún creciente. Estos BEST1-enfermedades asociadas, también conocido como bestrophinopathies, causan la pérdida progresiva de la visión e incluso ceguera, y actualmente no existen efectivos tratamientos. El producto de la proteína de BEST1, a saber, BESTROPHIN1 (BEST1), es un Ca2 +-activado canal de Cl– (CaCC) específicamente expresado en el epitelio retiniano del pigmento (RPE) de los ojos5,6, 8,9. Lo importante es un fenotipo clínico de BEST1-enfermedades asociadas es la disminución en la respuesta visual a los estímulos de luz, llamado light peak (LP) medido en el electrooculograma10,11; LP se cree para ser mediado por un CaCC en RPE12,13,14. Para comprender mejor los mecanismos patológicos de las mutaciones BEST1 y procurar terapias potenciales, resulta esencial para estudiar los canales del mutante BEST1 endógeno expresados en células humanas de la RPE.
Sin embargo, obteniendo RPE células directamente de pacientes vivo es altamente impráctico. Aunque nativas células RPE pueden ser cosechadas de las biopsias de cadáveres humanos y de fetos, la difícil accesibilidad a estas fuentes limita significativamente la investigación científica. Por lo tanto, es crítico contar con fuentes alternativas de RPE que no sean los ojos humanos. Esta llamada ha sido contestada por los avances recientes en técnicas de células madre, células RPE funcionales ahora pueden ser distinguidas de células de vástago de pluripotent humanas (hPSCs), incluyendo las células madre embrionarias (hESCs) e inducida de pluripotent células (hiPSCs), este último ser generadas por la reprogramación de fibroblastos de piel primaria de donantes16,17,18. Lo importante es la auto renovación y pluripotencia de hPSCs aseguran una fuente confiable para generar RPEs, mientras que la especificidad de paciente de hiPSCs y potencial modificación genómica de hESCs (p. ej., por CRISPR) ofrecen un modelo de enfermedad en plato versátil para mutaciones de BEST1 deseadas.
hPSC-RPE tiene varias ventajas sobre los ratones modelos RPE: 1) ratones knockout de BEST1 no muestran ninguna anormalidad retiniana19, levantando la posibilidad de diverso requisito genético de BEST1 en RPE entre ratones y humanos; 2) sólo el 3% de células humanas de RPE son binucleado, en contraste con 35% en ratones20; 3) hiPSC-RPE potencializa el trasplante autólogo en clínica tratamiento de retina trastornos21. Sin embargo, los modelos animales están siendo indispensables para el estudio de patología y fisiología RPE en un sistema vivo y no puede ser pasado por alto el potencial oncogénico de hiPSC.
El procedimiento aquí describe un hPSC moderado simple y útil en el protocolo de diferenciación de RPE que puede utilizarse para fines de investigación y clínicos. Este protocolo utiliza nicotinamida (vitamina B3) para aumentar la diferenciación de hPSCs al tejido neural, que además se induce a diferenciarse en RPE por tratamiento con activina-A. Tratamiento de nicotinamida ha demostrado aumentar el número de células pigmentadas (un signo de diferenciación en RPE), posiblemente por atenuar la actividad apoptótica de diferenciar células22. Las células de RPE hPSC resultante muestran los mismos marcadores claves, guijarro morfología y funcionalidad celular como nativo humano RPE células22. Así, en un entorno de investigación, las células de RPE hPSC resultantes son adecuadas para posteriores análisis funcionales incluyendo immunoblotting, inmunotinción y abrazadera del remiendo de celulares, para que también se proporcionan procedimientos experimentales detallados. Clínicamente, las células RPE derivadas de células madre han demostrado gran potencial para el tratamiento de trasplante de la degeneración macular en estudios en animales y ensayos humanos23.

<table><tbody><tr><td>Knock-Out (KO) DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>KO reemplazo del suero</td><td>ThermoFisher</td><td>10829028</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>ThermoFisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>ThermoFisher</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Activina humana-A</td><td>PeproTech</td><td>120-14</td><td></td></tr><tr><td>MEM (una modificación)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>N1 suplemento</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6530</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina-penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1146</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7156</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0386</td><td></td></tr><tr><td>Triyodo-tironina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR-1 medio</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>VWR</td><td>45000-664</td><td></td></tr><tr><td>M-PER reactivo de extracción de proteínas de mamíferos</td><td>Pierce</td><td>78501</td><td></td></tr><tr><td>cóctel de inhibidores de proteinasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo RPE65</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-355</td><td></td></tr><tr><td>CRALBP</td><td>Abcam</td><td>ab15051</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo BEST1</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB300-164</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo beta actina</td><td>ThermoFisher</td><td>MA5-15739</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 conjugado burro anti-ratón IgG</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>cabra anti-ratón IgG</td><td>ThermoFisher</td><td>SA5-35521</td><td></td></tr> cabra <tr><td>anti-conejo IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68071</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>HEKA EPC10 amplificador de abrazadera de parche</td><td>Warner Instruments</td><td>895000</td><td></td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>Warner Instruments</td><td>895040</td><td></td></tr></tbody></table>

diferenciación, mantenimiento y análisis de células del epitelio pigmentario de la retina humana: un modelo de enfermedad en un plato para las mutaciones best1

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Aunque más de 200 mutaciones genéticas en el gene humano de BEST1 han identificado y ligado a enfermedades degenerativas de la retina, los mecanismos patológicos siendo esquivos debido principalmente a la falta de un modelo de buen en vivo para el estudio de BEST1 y sus mutaciones en condiciones fisiológicas. BEST1 codifica un canal iónico, es decir, BESTROPHIN1 (BEST1), que funciona en epitelio retiniano del pigmento (RPE); sin embargo, la accesibilidad muy limitada a las células RPE humanas nativas representa un reto para la investigación científica. Este protocolo describe cómo generar humanos RPEs BEST1 mutaciones enfermedad-que causan del cojinete por la diferenciación inducida de células de vástago pluripotent humanas (hPSCs). Como hPSCs es auto renovables, este enfoque permite a los investigadores a tener una fuente constante de hPSC-RPEs para distintos análisis experimentales, como el immunoblotting, inmunofluorescencia y abrazadera del remiendo y así proporciona un modelo de enfermedad en un plato muy de gran alcance para BEST1-condiciones retinales asociadas. En particular, esta estrategia puede aplicarse para estudiar la fisiología de la RPE (patho) y otros genes de interés nativamente en RPE.

El paso más difícil es el aislamiento manual, que tiene como objetivo conseguir una elevada pureza de una población de hPSC-RPE diferenciada P0 . Después de un aislamiento exitoso, &gt; células del 90% de la población de0 P va creciendo y madurando para mostrar morfologías RPE de firma (figura 1). La existencia de una porción menor de RPE no o inmaduras células RPE en la población de0 P es casi inevitable, pero no interferirá ...

Aquí presentamos un protocolo para diferenciar células del pigmento retiniano epitelio (RPE) de las células de vástago pluripotent humana teniendo mutaciones derivados del paciente. Las líneas celulares mutantes pueden utilizarse para el análisis funcionales como immunoblotting, inmunofluorescencia, abrazadera del remiendo. Este enfoque de la enfermedad en plato evita la dificultad de obtención de células de EPR humanas nativas.

Diferenciación, mantenimiento y análisis de células del epitelio pigmentario de la retina humana: un modelo de enfermedad en un plato para las mutaciones BEST1

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades de la retina relacionadas con los canales iónicos sobre los mecanismos moleculares de las mutaciones de BEST1 y la patología de las bestrofinopatías. La principal ventaja de esta técnica es que evita la dificultad de obtener directamente células EPR de humanos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de las bestrofinopatías, incluida la enfermedad de Best, ya que las células EPR se pueden utilizar tanto con fines de investigación como para terapias de reemplazo celular.Cuando el cultivo de hPSC alcance la confluencia, reemplace el medio de cultivo con cuatro mililitros de medio de diferenciación por pocillo de una placa de seis pocillos. Después de dos semanas de cultivo, suplementar el medio de diferenciación con 100 nanogramos por mililitro de activina-A humana, cambiando el medio suplementado tres veces por semana durante otros 14 días. El día 29, cambie a un medio de diferenciación no suplementado durante otras ocho a 10 semanas hasta que aparezcan grupos de células RPE pigmentadas.Para aislar las células pigmentadas del EPR, primero sostenga las pipetas Pasteur de vidrio individuales de nueve pulgadas horizontalmente sobre la llama de un mechero Bunsen, aproximadamente dos tercios a lo largo de la parte delgada de la pipeta. Cuando el vidrio calentado se ablande, separe rápidamente los dos extremos para formar una punta similar a un microraspador en el nuevo extremo de la pipeta. Rocíe las pipetas extraídas con etanol al 70% y déjelas secar al aire en una campana de cultivo celular.Cuando las pipetas estén listas, lavar cada pocillo del cultivo de diferenciación con PBS y añadir un mililitro de tripsina al 0,05% suplementado con una unidad por microlitro de colagenasa a cada pocillo. Después de 20 a 30 minutos a 37 grados Celsius, detenga la digestión con dos mililitros de medio RPE de 37 grados Celsius por pocillo de una placa de seis pocillos y coloque la placa en una platina de microscopio. Con una pipeta extraída, golpee suavemente los grupos de EPR pigmentados.Tan pronto como las células se desprendan del fondo del pocillo, utilice una micropipeta de 20 microlitros para transferir las células disociadas a pocillos individuales de una nueva placa de cultivo celular que contenga medio EPR. Cuando se hayan añadido aproximadamente 5.000 células de EPR a cada pocillo de una placa de 12 pocillos, se debe elevar el volumen final a dos mililitros con medio de EPR fresco y cultivar las células de EPR-HPE-aisladas durante otras seis a ocho semanas hasta que se observe una monocapa de células EPR maduras pigmentadas y en forma de adoquín. De 24 a 72 horas antes de la pinza del parche, lave las células monocapa pigmentadas con dos mililitros de PBS, luego, después de eliminar el PBS, agregue un mililitro de tripsina al 0,05% más una unidad por microlitro de colagenasa a las células en cada pocillo de una placa de 12 pocillos durante un período de incubación de ocho minutos a 37 grados Celsius.Cuando las células comiencen a desprenderse, use una micropipeta de un mililitro para lavar suavemente las células del fondo del pocillo y agrupar la suspensión celular en un tubo cónico de 15 mililitros. Agregue un mililitro de solución de tripsina-colagenasa a 37 grados centígrados al pozo. Incube durante otros ocho minutos a 37 grados centígrados, luego lave las células restantes del fondo del pocillo y combine la suspensión celular en el mismo tubo cónico de 15 mililitros.Incube las células dentro de un baño seco a 37 grados centígrados durante ocho minutos, luego use una micropipeta de un mililitro para triturar suavemente las células de 10 a 15 veces. Después de incubar y triturar las células dos veces más, agregue cinco mililitros de medio RPE de 37 grados Celsius a la suspensión unicelular y granule las células por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en el volumen adecuado para la siembra en placas prerrevestidas con cubreobjetos de 10 a 20% de confluencia y realice la fijación de parches de celda completa de acuerdo con los protocolos estándar.Después de un aislamiento exitoso, más del 90% de las células en la población de pasaje cero deben madurar para mostrar la morfología celular RPE característica. Con el enfoque de enfermedad en placa basado en hPSC-RPE, cada mutación BEST1 específica del paciente se puede caracterizar de manera integral por su expresión de proteínas, tráfico de membrana y función de canal iónico para obtener información crítica para dilucidar los mecanismos patológicos del EPR. Hay que tener en cuenta que algunas mutaciones de BEST1 podrían afectar a su expresión proteica, por lo que también se deben comprobar otros marcadores de EPR bien establecidos.La diferenciación de las células madre pluripotentes humanas del EPR tarda de tres a seis meses, dependiendo de la línea de células madre pluripotentes humanas y del tipo de mutación, y el aislamiento de las células pluripotentes humanas diferenciadas puede completarse en dos horas si se realiza correctamente. Al intentar dividir las células para la pinza de parche, es importante recordar triturar las células muy suavemente para evitar la muerte celular excesiva. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el cultivo celular de EPR en 3D, para responder preguntas adicionales sobre cómo el transporte de iones en las membranas apical y basal de las células EPR se ve afectado por las mutaciones de BEST1.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las enfermedades degenerativas de la retina exploraran los fenotipos fisiológicos y los mecanismos patológicos de las células EPR derivadas de los pacientes. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo diferenciar las células madre pluripotentes en células del epitelio pigmentario de la retina y preparar las células del EPR para la pinza del parche de células completas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Ofrecemos un método reproducible para el cultivo de las monocapas confluentes de células fetales humanas del epitelio pigmentario de la retina (hfRPE) las células que presentan la morfología, la fisiología, la polaridad, y la proteína y los patrones de expresión génica del tejido nativo adulto. Este trabajo se ha extendido a un modelo animal de enfermedades de los ojos de varios.

Modelos experimentales para el estudio de la fisiología epiteliales del pigmento retiniano y fisiopatología

Las células de epitelio pigmentario de la retina (EPR) derivadas de células madre pueden utilizarse para múltiples aplicaciones, incluidas las terapias basadas en células para la degeneración de la retina, el modelado de enfermedades y los estudios de fármacos. Aquí presentamos un protocolo simple para derivar de manera reproducible EPR a partir de células madre.

Derivación eficiente de células de la retina epitelio pigmentario de Células Madre

Este protocolo describe cómo producir células epiteliales del pigmento retiniano (RPE) de células madre pluripotentes. El método utiliza una combinación de factores de crecimiento y moléculas pequeñas para dirigir la diferenciación de células madre en RPE inmaduro en catorce días y RPE madura y funcional después de tres meses.

Diferenciación rápida y dirigida de las células epiteliales del pigmento retiniano de humanos embrionarios o inducidas pluripotenciales células

El objetivo de este protocolo es demostrar que el cultivo del pigmento retiniano epitelial (RPE) células en membrana de Bruch humano enfermo o envejecido. Este método es adecuado para el estudio de comportamiento de células RPE en matriz extracelular comprometida.

Cultivo de células epiteliales del pigmento retiniano en un modelo Ex Vivo de la membrana de Bruch humano envejecido

Este protocolo, que fue reportado originalmente por Fernandez-Godino et al. en 20161,describe un método para aislar eficientemente y cultivo de células RPE del ratón, que forman una monocapa RPE funcional y polarizada dentro de una semana en las placas Transwell. El procedimiento dura aproximadamente 3 horas.

Disección eficiente y cultivo de células epiteliales de pigmento retiniano de ratón primario

El primate no humano (NHP) es un modelo ideal para estudiar la terapéutica celular de la retina humana debido a las similitudes anatómicas y genéticas. Este manuscrito describe un método para el trasplante submacular de células epiteliales pigmentarias de la retina en el ojo NHP y estrategias para prevenir las complicaciones intraoperatorias asociadas con la manipulación macular.

Trasplante de epitelio pigmentario retiniano en un modelo de primate no humano para enfermedades degenerativas de la retina

Este manuscrito describe un protocolo simplificado para el aislamiento de las células del epitelio pigmentado de la retina (EPR) de los ojos de ratón de una manera gradual. El protocolo incluye la enucleación y disección de los ojos del ratón, seguida del aislamiento, la siembra y el cultivo de células del EPR.

Aislamiento de células primarias del epitelio pigmentado de la retina del ratón

Este protocolo describe un método eficiente para diferenciar las hiPSC en grupos de campo ocular y generar organoides neurorretinianos utilizando condiciones de cultivo simplificadas que involucran sistemas de cultivo adherentes y en suspensión. Otros tipos de células oculares, como el EPR y el epitelio corneal, también se pueden aislar de campos oculares maduros en cultivos de retina.

Generación de organoides retinianos a partir de células madre pluripotentes sanas y específicas de la enfermedad retiniana inducida por humanos

Los modelos de ratón pueden ser herramientas útiles para investigar la biología del epitelio pigmentado de la retina (EPR). Se ha establecido que los ratones pueden desarrollar una serie de patologías del EPR. Aquí, describimos un protocolo de fenotipado para dilucidar y cuantificar patologías de EPR en ratones utilizando luz, electrones de transmisión y microscopía confocal.

Un protocolo para evaluar y cuantificar patologías del epitelio pigmentado retiniano en modelos murinos de degeneración macular relacionada con la edad

Aquí, presentamos protocolos de cultivo de células humanas para analizar los factores de iniciación de la traducción que se unen a la tapa 5' del ARNm durante las condiciones fisiológicas de oxígeno. Este método utiliza un análogo de tapa m7GTP ligado a agarosa y es adecuado para investigar los factores de unión a la tapa y sus socios que interactúan.

Análisis de proteínas Cap-unión en células humanas expuestas a condiciones de oxígeno fisiológicas

Aprende a diferenciar células del epitelio pigmentario de la retina a partir de células madre pluripotentes humanas con mutaciones BEST1. Este modelo en placa permite estudiar mecanismos moleculares de bestrofinopatías y explorar terapias de reemplazo celular.

Diferenciación, mantenimiento y análisis de células del epitelio pigmentario de la retina humana: un modelo de enfermedad en un plato para las mutaciones BEST1 (Video) | JoVE Journal

Diferenciación, mantenimiento y análisis de células del epitelio pigmentario de la retina humana: un modelo de enfermedad en un plato para las mutaciones BEST1

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