Name: Manutenção de culturas biológicas e medição de expressão gênica em Aphis nerii: um sistema Non-modelo de interações inseto-planta (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Aprenda a manter culturas de Aphis nerii e realizar análise genética para estudar interações inseto-planta. Este protocolo de baixo custo permite pesquisar mecanismos moleculares e ecologia de afídeos.

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Gostaríamos de agradecer a Michelle Moon (Vanderbilt University) para obter assistência com a fotografia. Universidade de Vanderbilt fornecido suporte para PA e SSLB é suportada pela DGE-1445197.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Há muito tempo foi reconhecido que o aposemático a. nerii pode fornecer insights sobre os padrões e mecanismos de resistência às defesas vegetais e sequestro particularmente química18,37. Um número de recursos genômicos surgiram recentemente para a. nerii10, oferecendo novas oportunidades para estudos de genômicas funcionais e ecológicas que usam a. nerii como um modelo. Nós esboçamos protocolos básicos em cultur...

Pulgões são insetos pequenos, hemimetabólicos que colonizam em famílias de diversas plantas em todo o mundo. Eles são distintos para vários recursos, mais notavelmente seus ciclos de vida complexos envolvendo partenogênese cíclica e polyphenisms discreta e sua simbiose nutricional obrigatórios com endossimbiontes bacterianos ou levedura que fornecem nutrientes faltando sua dieta da seiva de planta1. Enquanto a maioria dos pulgões são especialistas em planta de acolhimento, algumas espécies generalistas são pragas de cultura importante, infligindo danos económicos consideráveis nas culturas ou diretamente ou por meio dos agentes patogénicos e vírus eles vetor2. A publicação do primeiro genoma de pulgão em 2010, o pulgão ervilha pisum piolho3, marcado um marco importante no estudo da biologia de afídio porque forneceu os recursos genômicos para abordar questões sobre do inseto adaptações para os herbívoros estilos de vida, incluindo aqueles que possam levar a um melhor controle de estratégias4. Desde aquela época, recursos adicionais de genômicos acumularam-se com a publicação de um genoma anotado para o pulgão de soja glycines Aphis5e recursos do genoma inteiro publicamente disponíveis para outro afídio-três espécies (Myzus Cerasi (cereja preta afídio), Myzus persicae (pulgão da batata-pêssego), Rhopalosiphum padi (pulgão Azereiro-aveia)6. Valioso de novo transcriptomic recursos estão disponíveis, bem como para um número de outras espécies de pulgão (e.g.,Aphis gossypii (pulgão do algodão)7, Sitobion avenae (afídio grão)8, Cinara pinitabulaeformis (afídio pinho)9, Aphis nerii (pulgão da serralha-oleandro)10).
Pulgões também fizeram contribuições duradouras para nossa compreensão de interações inseto-planta e a ecologia da vida em plantas11. Uma área onde os pulgões fizeram contribuições particularmente importantes é em nossa compreensão da ecologia química nas interações planta do anfitrião. Expressa diversas adaptações de insetos herbívoros para superar as defesas da planta e alguns até mesmo cooptam defesas vegetais para seu próprio beneficiam12,13,14. Por exemplo, o pulgão da serralha-Oleandro, Aphis nerii, é um brilhante amarelo, invasivo pulgão encontrado em regiões temperadas e tropicais do mundo que coloniza em plantas da família serralha (Apocynaceae). Plantas da família Apocynaceae evoluíram diversas defesas químicas, incluindo látex leitoso e glicosídeos cardíacos, conhecidos como cardenolides, que ligam o transportador de cátion Na, K-ATPase e eficaz dissuasiva para generalista herbívoros15, 16. especialistas milkweed expressam vários modos de resistência ao cardenolides, e alguns seletivamente ou passivamente se acumulam ou modificar cardenolides em seus tecidos, como um meio de impedir a predação ou para outros benefícios de17. A. nerii é pensado para sequestrar cardenolides desta forma, embora os mecanismos e benefícios funcionais permanecem pouco claras10,18.
Tendo em conta os recursos genômicos em mãos, a. nerii fornece um excelente modelo experimental para o estudo dos mecanismos moleculares e genéticos envolvidos nas interações quimio-ecológicas entre plantas hospedeiras tóxicos e seu especialista herbívoros. É interessante notar que, enquanto alguns dos primeiros estudos de a. nerii focada em sequestro de cardenolides19, desde aquela época, estudos da . nerii forneceram introspecções em um amplo conjunto de questões evolutivas e ecológicas, incluindo a estrutura genética de insetos invasiva20 e a interação entre ascendente e descendente de regulamento sobre o herbívoro densidade21. A. nerii , portanto, é um bom candidato como modelo experimental para um especialmente amplo conjunto de estudos das interações inseto-planta. Crítico para o sucesso de qualquer estudo com a. nerii é a cultura cuidadosa de afídio populações, que inclui a cultura de plantas de que dependem os pulgões, assim como uma geração eficiente de dados de alta qualidade - omic. Nosso objetivo é orientar o leitor através de ambos. Descritos abaixo são os métodos para a geração e a manutenção das culturas vegetais e pulgão na estufa e laboratório, DNA e RNA extrações, análise de microssatélites, de novo transcriptome montagem e anotação, transcriptoma análise da expressão diferencial e qPCR verificação de diferencialmente expressos genes. Enquanto esses métodos são escritos pela . nerii, os métodos de cultivo, extração e análise gerais podem estender a uma variedade de espécies de pulgão.

<table><tbody><tr><td>Sun Gro Fafard Germinação Mix</td><td>Hummert International</td><td>10-0952-2</td><td></td></tr><tr><td>Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix</td><td>Hummert International</td><td>10-0951-2</td><td></td></tr><tr><td>2" x 4" Pote Padrão Redondo</td><td>Anderson Pots</td><td>1503</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA Polimerase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EP0701</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td>15596026</tr><tr><td>SuperScript&reg; III Kit de síntese de primeira fita</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4367659</td><td></td></tr></tbody></table>

manutenção de culturas biológicas e medição de expressão gênica em aphis nerii: um sistema non-modelo de interações inseto-planta

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Pulgões são excelentes modelos experimentais para uma variedade de questões biológicas, desde a evolução da simbiose e o desenvolvimento de polyphenisms a questões em torno as interações do inseto com suas plantas hospedeiras. Genômica recursos estão disponíveis para várias espécies de afídeos, e com os avanços no próxima geração de sequenciamento, transcriptomic estudos estão sendo estendidos para os organismos que não possuem genomas não-modelo. Além disso, culturas de pulgão podem ser coletadas do campo e criadas em laboratório para uso em experimentos de organismos e moleculares para colmatar o fosso entre os estudos ecológicos e genéticos. Por último, muitos pulgões podem ser mantidos no laboratório em suas plantas hospedeiras preferenciais perpétuos, parthenogenic ciclos de vida, permitindo comparações de genótipos assexuadamente. Aphis nerii, o pulgão da serralha-Oleandro, fornece um modelo deste tipo para estudar interações insetos com plantas tóxicas, usando as experiências dos e moleculares. Métodos para a geração e manutenção das culturas vegetais e pulgão na estufa e laboratório, extrações de DNA e RNA, análise de microssatélites, novo de transcriptoma montagem e anotação, transcriptoma expressão diferencial análise e verificação de qPCR de genes diferencialmente expressos são descritos e discutidos aqui.

Plantar culturas: Sementes levará cerca de duas a quatro semanas, dependendo da época, para que cresça o suficiente para ser re-envasadas (Figura 1A). Re-potted mudas levará outro duas a quatro semanas para crescer a um tamanho ideal para culturas de pulgão (Figura 1B).
Culturas de afídio: Adultos a...

O pulgão Aphis nerii coloniza altamente defendido das plantas pertencente à família (Apocyanaceae) e oferece inúmeras oportunidades para estudar interações inseto-planta. Aqui, apresentamos uma série de protocolos para a manutenção da planta e pulgão, culturas e a geração e análise molecular e - omic dados pela . nerii.

Manutenção de culturas biológicas e medição de expressão gênica em Aphis nerii: um sistema Non-modelo de interações inseto-planta

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...

Este método descreve as etapas gerais para a cultura de pulgões e as etapas para a análise genética de pulgões. Esses métodos podem ser aplicados para responder a questões-chave na evolução e ecologia dos pulgões e nos mecanismos moleculares subjacentes à biologia dos pulgões. A principal vantagem dessa técnica é que ela geralmente pode ser aplicada à maioria das espécies de pulgões e realizada a um custo relativamente baixo.Comece enchendo uma bandeja de mudas padrão com solo de mistura de germinação, tomando cuidado para que o solo atinja o topo dos poços. Quando todos os poços estiverem cheios, faça um buraco de três centímetros de profundidade no solo de cada poço e coloque uma semente em cada buraco. Regue as células até que o solo que cobre as sementes esteja saturado e coloque a bandeja em uma estufa com rega diária a dias alternados, para manter um nível moderado de umidade do solo.Quando as mudas crescerem, seu primeiro conjunto de folhas cheias encha vasos redondos de dez centímetros com terra para vasos, até cerca de cinco centímetros abaixo de suas bordas. Crie um todo no solo profundo o suficiente para alcançar o fundo do vaso e retire delicadamente as mudas maduras co

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Genética

Quantitativas PCR em tempo real (qRT-PCR) é uma ferramenta eficaz para diagnosticar os níveis de mRNA nos tecidos do inseto e estágios diferentes de desenvolvimento. Neste relatório, nós mostramos o uso de qRT-PCR para verificar os níveis de mRNA em diferentes tecidos e estágios de desenvolvimento larval das espécies de insetos invasivos, esmeralda broca cinzas.

Análise de Expressão Gênica em Emerald Borer Ash ( Agrilus planipennis) Usando Quantitativa em Tempo Real-PCR

Fonte: Rufián, J. S., et al. Análise de célula única da expressão dos genes de Pseudomonas syringae no tecido vegetal. J. Vis. Exp. (2022).Este vídeo demonstra um método para analisar a expressão gênica em bactérias patogênicas extraídas de plantas no nível de célula única, usando um fator de transcrição marcado fluorescente. A imagem confocal revela heterogeneidade na expressão gênica da virulência, destacando a diversidade funcional dentro de uma população bacteriana clonal.

Análise de Expressão Gênica de Células Únicas a partir de Patógenos Extraídos de Plantas

Este vídeo demonstra um método para estabelecer um modelo de infecção por Mycobacterium bovis nas larvas da mariposa-da-cera, Galleria mellonella. Uma cepa bioluminescente de Mycobacterium bovis BCG é injetada na hemolinfa da larva para estabelecer a infecção, e a bioluminescência é medida em intervalos predefinidos para estudar o progresso da infecção.

Uma técnica para estabelecer um modelo de infecção bacteriana em larvas de insetos

A quantificação do crescimento de patógenos é uma ferramenta poderosa para caracterizar várias respostas imunes de Arabidopsis thaliana (doravante: Arabidopsis). O método descrito aqui apresenta um ensaio otimizado de infiltração de seringa para quantificar a Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 crescimento em folhas adultas de Arabidopsis.

Bacteriana Folha Infiltração Ensaio para Belas Caracterização das respostas de defesa da planta usando o<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Patossistema

Um protocolo de imunocoloração de montagem total em embriões de pulgões é apresentado, no qual são abordadas as condições críticas para diminuir a coloração de fundo e aumentar a permeabilidade do tecido. Essas condições são desenvolvidas especificamente para a detecção eficaz da expressão de proteínas nos tecidos embrionários de pulgões.

Identificação de condições críticas para Immunostaining no Pea Aphid Embriões: Aumento Tissue permeabilidade e diminuir a coloração de fundo

Aqui, apresentamos os protocolos de criação de um besouro intermediário de germes, Dermestes maculatus (D. maculatus) no laboratório. Também compartilhamos protocolos de RNAi embrionário e parental e métodos para análise de fenótipos embrionárias para estudar a função de genes nesta espécie.

Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle, Dermestes maculatus

Este protocolo descreve um método simples para análise de sinais de cálcio em plantas geradas pela alimentação hemipteran insetos, como pulgões. Arabidopsis thaliana transformada com o biosensor de cálcio GFP GCaMP3 permitem a imagem em tempo real na vivo da dinâmica de cálcio com alta resolução temporal e espacial.

Gravação em tempo real na Vivo de Arabidopsis sinais de cálcio durante a alimentação de insetos usando um biossensor fluorescente

Este protocolo descreve um método para registrar a atividade elétrica descendente do sistema nervoso central Drosophila melanogaster para permitir que o custo-eficiente e conveniente de teste de agentes farmacológicos, mutações genéticas das proteínas neurais, e/ou o papel das vias fisiológicas inexploradas.

Eletrofisiológica gravação da atividade do sistema nervoso Central de terceiro ínstar Drosophila Melanogaster

O método apresentado cria tecido vegetal danificado herbívoro natural através da aplicação de larvas de Manduca sexta a folhas destacadas de batata. O tecido vegetal é analisado para a expressão de seis homólogos do fator de transcrição envolvidos em respostas adiantadas ao herbivory do inseto.

Ensaios foliares destacados para simplificar estudos de expressão gênica em batata durante a infestação por mastigação de insetos Manduca sexta

Aqui, caracterizamos as respostas de estresse proteotóxico celular no nematoide C. elegans medindo a ativação de repórteres transcritores fluorescentes e atribuindo sensibilidade ao estresse fisiológico.

Medições de Respostas de Estresse Fisiológico em C. Elegans

Este artigo descreve métodos básicos para padronizar fatores importantes como densidade, disponibilidade de ração, fonte de hidratação e controles ambientais para a criação a longo prazo de culturas laboratoriais do grilo comestível, Gryllus bimaculatus.

Mantendo culturas laboratoriais de Gryllus bimaculatus, um modelo ortopéde versátil para agricultura de insetos e fisiologia de invertebrados

Aprenda a manter culturas de Aphis nerii e realizar análise genética para estudar interações inseto-planta. Este protocolo de baixo custo permite pesquisar mecanismos moleculares e ecologia de afídeos.

Manutenção de culturas biológicas e medição de expressão gênica em Aphis nerii: um sistema Non-modelo de interações inseto-planta (Vídeo) | JoVE Journal

Manutenção de culturas biológicas e medição de expressão gênica em Aphis nerii: um sistema Non-modelo de interações inseto-planta

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