Name: Protocolo clínico de produzir tecido adiposo-derivado do estroma Vascular fração para a regeneração da cartilagem potenciais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Aprenda a produzir fração vascular estromal derivada de tecido adiposo para regeneração de cartilagem em pacientes com osteoartrite de joelho. Este protocolo minimamente invasivo melhora a função articular.

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O autor reconhece que o apoio da equipe do Mipro clínica médica e o desenho de figura por Mariana/David Lee. Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação do Bio & programa de desenvolvimento de tecnologia médica da NRF financiada pelo MSIT (número NRF-2017M3A9E4078014); e o nacional Research Foundation da Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da ciência e TIC (números NRF-2017R1A2B4002315 e NRF-2016R1C1B2010308).

A aprovação e o consentimento para relatar após relatos de casos dispensadas pelo Comité do Conselho de revisão institucional Myongji University (MJUIRB). Além disso, este protocolo clínico foi em conformidade com as diretrizes da declaração de Helsinque e regulamento do KFDA. Para os procedimentos, consentimento informado foram obtido de pacientes.
1. lipoaspiração
Nota: Execute com técnica estéril.
<ol><li>Use os seguintes critérios de inclusão: (1) provas de MRI da fase 3 OA; (2) masculino ou feminino; (3) mais de 18 anos de idade; (4) suficiente tecido adiposo de (100-110 g) para lipoaspiração; (5) falta de vontade de prosseguir com a intervenção cirúrgica; (6) a falha do tratamento conservador; e a dor incapacitante em curso (7).</li>
	<li>Use os seguintes critérios de exclusão: (1) doença inflamatória ou tecido conjuntivo ativa pensado para impactar a condição de dor (ou seja,lúpus, artrite reumatoide, fibromialgia); (2) ativo transtorno endócrino que possa afetar a condição de dor (ou seja,, hipotireoidismo, diabetes); (3) ativo distúrbio neurológico que possa afetar a condição de dor (ou seja,, neuropatia periférica, esclerose múltipla); (4) doença pulmonar ativa, que exigem o uso de medicação; e (5) sem histórico de injeções de esteroides conjuntas últimos 3 meses.</li>
	<li>Trazer o paciente para uma sala de cirurgia com uma capa de A de classe de risco biológico e coloque ele (ou ela) em posição supina.</li>
	<li>Limpe a área abdominal do paciente com 5% de betadine (povidone-iodo) e armar o paciente utilizando a técnica estéril, expondo a área limpa do abdômen para a lipoaspiração.</li>
	<li>Cerca de 5 cm infero-lateralmente a partir do umbigo, anestesiamos dois locais (um na esquerda e o outro no lado direito do umbigo) da incisão para fazer usando 2 mL de lidocaína a 2% sem epinefrina com uma agulha (25 gauge, 1½ polegadas) em uma seringa de 5 mL através da injeção de cada site a nível epidérmico.</li>
	<li>Anestesia o local da incisão para fazer usando 5 mL de solução tumescente (500 mL de normal salina, 40 mL de lidocaína a 2%, 20 mL de bupivacaína a 0,5%, 0,5 mL de epinefrina 1: 1000) em uma seringa de 10 mL com agulha (calibre 25, 1½ polegadas).</li>
	<li>Fazer 2 incisões de 0,5 cm aproximadamente 5 cm abaixo do umbigo lateralmente por beliscar a pele para aumentar a profundidade do nível subcutâneo.</li>
	<li>Usando lâmina n º 11, picar a pele levantada para penetrar ao nível subcutâneo, mas não para penetrar através da parede abdominal.</li>
	<li>Usando a cânula de calibre 16 cm 20, anestesia o nível subcutâneo da área conjunto inferior de abdômen, que é to-be-aspirada, com 700 a 800 mL da solução tumescente.</li>
	<li>Após acabamento infiltração do conjunto inferior abdômen com a solução tumescente, preparar um aparelho de lipoaspiração conectando-se uma cânula de 3,0 mm, ligada a um 60 mL (ou um 30ml) seringa para lipoaspiração manual ou uma cânula especialmente concebidos 3,0 mm conectado a um kit de centrífuga, uma seringa de sistema fechado, com a finalidade de manter a esterilidade, conectado a uma máquina de vácuo para a lipoaspiração assistida por vácuo.</li>
	<li>Execute a lipoaspiração para obter 100-110 g de tecido adiposo, excluindo a solução tumescente. Ao realizar a lipoaspiração, tecido adiposo será obtido junto com a solução tumescente, que deve ser separada e removida.</li>
	<li>Para separar a solução tumescente, primeiro pela gravidade, transfira o tecido adiposo no kit centrífuga a uma seringa de 60 mL e a seringa para baixo (ou seja, que a parte da seringa é na parte inferior). Por esperando 5-6 min, o tecido adiposo e o fluido tumescente serão separados. Remova o fluido na parte inferior da seringa pressionando a parte superior do êmbolo da seringa.</li>
	<li>Execute as etapas acima 1.9-1.11 até que tenha sido acumulado um total de 100-110 g de tecido adiposo (lipoaspirates) pelo joelho.</li>
</ol>2. preparação da mistura ASC/ECM com sistema fechado estéril
<ol><li>Após a separação da solução tumescente por gravidade e acumulando 50-55 g de lipoaspirates por cada kit de 60 mL centrífuga, um sistema fechado estéril, colocar os kits de 2 centrífuga em um balde de recipiente de centrífuga e girar a 1600 x g por 5 min, condensação a lipoaspirates e separando o fluido do tecido adiposo. Neste processo de mais condensa-se, o lipoaspirates pode produzir óleo gorduroso, em certos casos.</li>
	<li>Ser cauteloso para não agitar, remover a tampa de segurança e o plug na parte inferior do kit centrífuga.</li>
	<li>Remova o fluido de fundo pressionando lentamente para baixo na parte superior do êmbolo do kit centrífuga.</li>
	<li>Seringa de 60ml separado, dissolva 10mg de colagenase (5 mg de colagenase específico para o tecido conjuntivo24 ) e 5 mg de colagenase específico para tecido adiposo25com 50 mL de solução salina.</li>
	<li>Misturar aproximadamente 25-30 mL de lipoaspirate condensado com colagenase dissolvido (5 mg de colagenase específico para tecido conjuntivo) e 5 mg de colagenase específico para o tecido adiposo a uma proporção de 1:1 (v: v) conectando-se a seringa de 60 mL para um kit de centrífuga usando um conector especializado.</li>
	<li>Misture bem o lipoaspirate condensada e a colagenase, empurrando o conteúdo entre a seringa de 60 mL e os kits de centrífuga usando uma vara ou um traficante.</li>
	<li>Transfira a mistura da lipoaspirate e a colagenase volta para seringas de 60 mL.</li>
	<li>Conecte cada seringa de 60 mL contendo a mistura com um homogeneizador que contém lâminas.</li>
	<li>Conecte uma seringa de 60ml vazio à outra extremidade do homogenizador.</li>
	<li>Empurre a mistura na outra seringa de 60ml através do homogenizador para 4 -6 vezes, resultando em corte e picagem do lipoaspirate.</li>
	<li>Transferir o lipoaspirate homogeneizado e a mistura de colagenase volta para kits de centrífuga 60 mL através de um conector especializado</li>
	<li>Coloque os kits de centrífuga num recipiente para ser colocado em uma incubadora que tenha sido previamente aquecida a 37 ° C.</li>
	<li>Incube os kits de dois centrífuga com a mistura homogeneizada a 37 ° C por 40 min enquanto roda a 45 rpm.</li>
	<li>Após o 40 min de incubação, remova o recipiente da incubadora de forma estéril. Em seguida, remover os kits de centrífuga e colocá-los em uma máquina centrífuga.</li>
	<li>Centrifugar as misturas a 800 x g por 5 min separar o SVF derivadas de tecido adiposo.</li>
	<li>Após a centrifugação, remover o sobrenadante (que inclui a colagenase e digerido o tecido adiposo) de cada kits de centrífuga, removendo a tampa da seringa na parte superior do êmbolo e colocando uma seringa de 30 mL no êmbolo abertura através do bloqueio de seringa conexão.</li>
	<li>Lentamente, pressione para baixo a parte do barril da seringa de 30 mL para o sobrenadante encher a seringa de 30 mL.</li>
	<li>Pressione para baixo o barril de seringa de 30 mL até os último 3-4 mL de fundo do kit centrífuga, deixando apenas o último 3-4 mL de SVF derivadas de tecido adiposo. O sobrenadante será Descartado.</li>
	<li>Remova a seringa de 30 mL da parte superior do êmbolo e encha a seringa com dextrose 5% em solução de Ringer lactato (D5LR).</li>
	<li>Anexando-se a seringa de 30 mL, cheia de D5LR na parte superior do atuador de abertura, preencher os kits de centrífuga, contendo 3-4 mL de SVF derivadas de tecido adiposo, com D5LR até 55 mL.</li>
	<li>Remova a seringa de 30 mL, cap o êmbolo e centrifugue os kits de centrifugar novamente a 300 x g durante 4 min.</li>
	<li>Repita as etapas 2.17-2.21 para um total de 4 lavagens. A colagenase utilizada é xenogénica. Portanto, a maioria de colagenase é removido por 4 lavagens. No entanto, para aprovação da FDA, ajuste fino do protocolo pode ser necessário remover completamente os resíduos de colagenase em volume final, embora a quantidade atual de resíduos de colagenase pode ser insignificante o suficiente para os pacientes que não têm qualquer clínico efeitos colaterais.</li>
	<li>Após a centrifugaçãoth 4, a fim de obter o SVF final para a injeção, remova a tampa de segurança e o plug na abertura inferior do kit centrífuga, sem tremer ou transformar o kit de centrífuga.</li>
	<li>Anexe uma seringa de 20 mL para o fundo do kit centrífuga abertura usando um conector especialmente projetado.</li>
	<li>Puxe o êmbolo da seringa várias vezes e volta a agitar-se as células que se instalaram na parte inferior do kit centrífuga.</li>
	<li>Remover o volume total desejado o SVF contendo ASCs e ECM juntamente com outras células e tecidos (geralmente cerca de 3-4 mL de cada kit de centrífuga para injeções de articulação de joelho).</li>
</ol>3. PRP preparação com técnica estéril
<ol><li>Enquanto preparava o ASCs e ECM, desenhe com 2,5 mL de solução de anticoagulante citrato dextrose 30 mL de sangue autólogo.</li>
	<li>Transferi o sangue desenhado para os kits de centrífuga de 60 mL.</li>
	<li>Centrifugar o sangue extraído a 730 x g por 5 min e retire o sobrenadante para um novo kit de centrífuga de 60 mL. Centrifugue o sobrenadante a 1300 x g durante 4 min, resultando em 3-4 mL de PRP.</li>
	<li>Antes da injeção, adicionar 3% (p/v) de cloreto de cálcio na proporção de 10:2 (PRP: cloreto de cálcio, v: v) para a PRP para ativá-lo.</li>
	<li>Adicione 0,5% (p/v), como um andaime, HA para o PRP ativado com cloreto de cálcio. Estes ASCs com ECM, juntamente com o PRP, ativado pelo cloreto de cálcio, e HA defende a mistura ASC/ECM.</li>
</ol>4. ASC/ECM baseada na mistura de tratamento
<ol><li>Limpe o joelho do paciente com 5% de betadine e armá-lo de forma estéril.</li>
	<li>Palpe o anterior do joelho para o espaço articular entre os ossos da tíbia e fêmur.</li>
	<li>Anestesia o local da injeção superficialmente com lidocaína diluído (1 mL de lidocaína a 1% diluída com 4 mL de solução salina) da pele apenas fora da cápsula articular.</li>
	<li>Anestesia o interior da cápsula articular com ropivacaína diluída (ropivacaína a 0,75% 1ml diluída com 3 mL de solução salina).</li>
	<li>Misture 2 mL de HA para o 6-8 mL de SVF contido em uma seringa de 20 mL através do conector de seringa-para-seringa.</li>
	<li>Usando um conector de seringa-para-seringa, adicione 0,4 mL de cloreto de cálcio para o 3-4 mL de PRP que já foi preparado autólogo e estar pronto em uma seringa de 5 mL.</li>
	<li>Combine o 3,5-4,5 mL de cloreto de cálcio PRP em uma seringa de 5 mL com 8-10 mL de mistura SVF/HA em um 20ml seringa através de seringa para seringa conector.</li>
	<li>Imediatamente injete a mistura (cerca de 12-15 mL) lentamente a articulação tíbio-femoral anterior dos joelhos usando agulha de calibre 18 de 38 mm, com ou sem a orientação do ultra-som.</li>
	<li>Após a injeção, curativo no local da injeção com pressão dobrando a gaze de algodão 4 x 4 4 vezes e colocação de fitas sobre a gaze dobrada de 4 x 4.</li>
	<li>Instrua o paciente a permanecer ainda por 60 min permitir a fixação da célula.</li>
	<li>Instrua o paciente a limitar as atividades para o mínimo de 1 semana após a alta da clínica.</li>
	<li>Retornar à clínica para três injeções adicionais de PRP ativado por cloreto de cálcio durante 3 semanas.</li>
</ol>5. acompanhamento pós-tratamento de
<ol><li>Avalie o paciente na semana de 2, 4 e 16 (18 ou 22) para melhoria da dor em termos de escala analógica visual (VAS) e melhoria da função em termos de parâmetros de terapia física. Determine o índice de classificação funcional (FRI), VAS e amplitude de movimento (ROM) como descrito anteriormente,26,,27.</li>
	<li>Acompanhar o paciente por pós-tratamento MRI 3 meses após o tratamento.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Em 2001, Zuk et al. células-tronco isoladas de tecido adiposo por quebrar a matriz de colágeno com colagenase6. Depois, o grupo mostrou que essas células-tronco isoladas de tecido adiposo pode transformar em cartilagem e outros tecidos da mesoderme, na origem, provando que essas células-tronco eram mesenquimais na origem.
Da mesma forma, o procedimento apresentado neste artigo é um protocolo modificado para aplicar o método semelhante para pacientes humanos. A ...

Células-tronco mesenquimais (MSCs) são conhecidas por terem a capacidade de regenerar a cartilagem1,2,3,4,5,6. Elas podem ser facilmente obtidas de várias fontes: sangue do cordão umbilical, medula óssea e tecido adiposo, entre muitos outros. Entre essas fontes, o tecido adiposo é a única fonte onde um número suficiente de MSCs pode ser obtido sem qualquer expansão da cultura para regenerar a cartilagem em ambientes clínicos7,8. Autólogo de medula óssea do estroma vascular fração (SVF) pode ser facilmente obtida também. No entanto, o número de células-tronco contida na medula expandida não-cultura é muito baixa7,8. Sangue do cordão umbilical pode conter um número suficiente de MSCs. No entanto, o sangue do cordão umbilical não é uma fonte prontamente disponível de SVF autólogo.
Numerosos métodos de processamento de tecido adiposo para obter SVF estão disponíveis para aplicações clínicas. Entre estes, o método de obtenção MSCs de tecido adiposo usando colagenase, desenvolvida e confirmada pelo Zuk et al 5 , 6, é muito bem aceito. Este método de usar colagenase foi modificado para aplicações clínicas em Ortopedia. A fim de ser aplicada a situações clínicas, o sistema deve ser um sistema fechado para manter a esterilidade, mantendo a conveniência. Uma modificação particular apresentada neste artigo envolve homogeneização do lipoaspirates. Lipoaspirates tamanhos pequenos são digeridos relativamente mais rápido do que os maiores que estão resultando na repartição desigual de tecido adiposo. Além disso, estes lipoaspirates de tamanhos maiores pode produzir tecidos fibrosos que podem entupir as seringas e agulhas durante a execução conjunta de injeções9,10. Para evitar esses problemas, o lipoaspirates pode ser homogeneizado por corte e picagem a lipoaspirates antes da incubação com colagenase. O SVF derivadas de tecido adiposo resultante pode conter mais uniforme da matriz extracelular (ECM) em comparação com lipoaspirates que não são homogeneizadas11. O ECM quebrado contido o SVF pode funcionar como um andaime12.
Em 2009, foi autorizada pela Korean Food and Drug Administration (KFDA) quando processado dentro de uma instalação médica com processamento mínimo, por um médico13SVF autóloga derivadas de tecido adiposo. Depois, SVF autóloga derivadas de tecido adiposo tem sido utilizada como um agente potencial para melhorar as funções do joelho em pacientes de osteoartrite (OA) potencialmente regenerando tecido de cartilagem, como10,14,15 , 16 , 17 , 18 . 
Em 2011, Pak mostrou pela primeira vez que derivadas de tecido adiposo as células-tronco (ASCs) contidas no SVF derivadas de tecido adiposo podem melhorar as funções de joelho potencialmente regenerar o tecido da cartilagem, como em pacientes humanos de OA quando injetado com rico em plaquetas plasma (PRP) 14. Além disso, Pak et al relataram dados de segurança em 2013 envolvendo 91 pacientes. A taxa de eficácia média relatada nesses dados de segurança foi 67%15. Posteriormente, estudos adicionais por Pak et al mostraram joelho melhorou funções potencialmente devido a regeneração do tecido de cartilagem, como em pacientes com um menisco lacrimal e condromalacia patelas10,16,17 ,18. Com base em artigos relatados, é sabido que o número de células-tronco contida em 100 g de tecido adiposo processado pelo protocolo apresentado neste artigo pode variar de 1.000.000-40,000,000 dependendo características8, dos pacientes 19 , 20 , 21 , 22 , 23.
Aqui, apresentamos um protocolo clínico do joelho humano OA usando SVF autóloga derivadas de tecido adiposo com HA e PRP ativado com cloreto de cálcio. A primeira versão do presente protocolo clínico, envolvendo um sistema fechado, manual para manter a esterilidade, foi relatada em 201114. O protocolo idêntico foi otimizado, manutenção de esterilidade e foi relatado em 2013 e 201610,15. Aqui, o protocolo otimizado é apresentado. A visão esquemática do protocolo é apresentado na Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58363/58363fig1.jpg"> Figura 1: A visão esquemática do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58363/58363fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td><forte>Material</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% Betadine (iodopovidona)&nbsp;</td><td>Fornecedor:Firson Co., Ltd.</td><td></td><td></td>657400260</tr><tr><td>2% de lidocaína&nbsp;</td><td>Daehan Farmacêutica Co.</td><td></td><td></td>670603480</tr><tr><td>Solução tumescente&nbsp;</td><td>Fornecedor:Myungmoon Pharm. Co., Ltd.</td><td>N01BB01</td><td>A solução foi composta por 500 mL de soro fisiológico, 40 mL de lidocaína a 2%, 20 mL de marcaína a 0,5% e 0,5 mL de epinefrina 1:1000.</td></tr><tr><td>Liberase TL e TM grau de pesquisa&nbsp;</td><td>Roche Ciência Aplicada</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>D5LR</td><td>Dahan Pharm. Co., Ltd.</td><td>645101072</td><td>Dextrose 5% em solução de Ringer com lactato&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução anticoagulante citrato dextrose&nbsp;</td><td>Fenwal, Inc.</td><td>NDC:0942-0641</td><td>A solução foi composta por ácido cítrico a 0,8%, citrato de sódio a 0,22% e dextrose a 0,223%.</td></tr><tr><td>3% (p/v) de cloreto de cálcio&nbsp;</td><td>Fornecedor:Choongwae Pharmaceutical Co.</td><td></td><td></td>644902101</tr><tr><td>0,5% (p/v) HA (ácido hialurônico)</td> <td>Dongkwang pharm. Co., Ltd.</td><td></td><td></td>645902030</tr><tr><td>0,25% Ropivacaína</td><td>Huons Co., Ltd.</td><td>670600150</td><td></td></tr><tr><td><forte>Equipamento</forte></td>Cânula de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,0 mm&nbsp;</td><td>Fornecedor verificado - WOOJU Medical Instruments Co.</td><td></td><td></td>ML30200</tr><tr><td>Seringa Luer-Lock de 60 mL</td><td>BD (Becton Dickinson)&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>309653 Kit de Barril de Centrífuga</td><td>Fornecedor:CPL Co., Ltd.</td><td>30-0827044</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de tecidos que contém lâminas</td><td>CPL Co., Ltd.</td><td>30-0827045</td><td></td></tr><tr><td>Misturador rotativo da incubadora</td><td>Medikan Co., Ltd</td><td>MS02060092</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Hanil Scientific Inc.</td><td>CE1133</td><td></td></tr><tr><td>Ressonância Magnética</td><td>Philips Medical Systems Inc.</td><td>18068</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem de ultrassom</td><td>Samsung Medison co., Ltd</td><td>CT-LK-V10-ICM-09.05.2007</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo clínico de produzir tecido adiposo-derivado do estroma vascular fração para a regeneração da cartilagem potenciais

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

Osteoartrite (OA) é uma das mais comuns doenças debilitantes. Recentemente, várias tentativas foram feitas para melhorar as funções dos joelhos usando diferentes formas de células-tronco mesenquimais (MSCs). Na Coreia, concentrados de medula óssea e cordão hemoderivados células-tronco foram aprovadas pela Korean Food and Drug Administration (KFDA) para regeneração da cartilagem. Além disso, uma tecido adiposo-derivado do estroma vascular fração (SVF) foi autorizada pelo KFDA para injeções conjuntas em pacientes humanos. SVF autóloga derivadas de tecido adiposo contém matriz extracelular (ECM), além de células-tronco mesenquimais. ECM excreta várias citocinas que, juntamente com o ácido hialurónico (HA) e o plasma rico em plaquetas (PRP) ativado pelo cloreto de cálcio, podem ajudar o MSCs para regenerar a cartilagem e melhorar as funções do joelho. Neste artigo, apresentamos um protocolo para melhorar as funções do joelho Regenerando o tecido da cartilagem, como em pacientes humanos com OA. O resultado do protocolo foi primeiramente relatado em 2011, seguido por algumas publicações adicionais. O protocolo envolve lipoaspiração para obter lipoaspirates autólogo que são misturados com colagenase. Esta mistura de lipoaspirates-colagenase é então cortada e homogeneizada para remover grandes de tecido fibroso que pode entupir a agulha durante a injeção. Depois disso, a mistura é incubada para obter SVF derivadas de tecido adiposo. O resultante SVF derivadas de tecido adiposo, contendo tecido adiposo-derivado MSCs e restos de ECM, é injetado em joelhos de pacientes, combinados com HA e cloreto de cálcio ativado PRP. Incluem-se três casos de pacientes que foram tratados com nosso protocolo, resultando em melhora da amplitude de movimento, juntamente com provas de MRI de cartilagem hialina, como tecido, inchaço e dor no joelho.

Três pacientes (uma mulher de 87 anos, com estágio 3 OA, um homem de 68 anos, com estágio 3 OA, e uma mulher de 60 anos com estágio 3 OA) sem qualquer passado significativo histórico médico apresentado à clínica com dor persistente no joelho e desejado para o potencial tratamento de SVF autólogo derivadas de tecido adiposo. Todos os três pacientes tinham seu joelho examinado por um cirurgião ortopédico e ofereceram-se para ter a substituição total do joelho (TKR) e estavam relutantes em f...

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir uma tecido adiposo-derivado do estroma vascular fração e sua aplicação para melhorar as funções de joelho Regenerando o tecido da cartilagem, como em pacientes humanos com osteoartrite.

Protocolo clínico de produzir tecido adiposo-derivado do estroma Vascular fração para a regeneração da cartilagem potenciais

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the ...

A osteoartrite é um dos transtornos debilitantes mais comuns entre a população idosa. Atualmente, não há cura definitiva para as causas subjacentes da osteoartrite. Este protocolo clínico descreve um procedimento inovador para um tratamento promissor, minimamente invasivo e alternativo da osteoartrite do joelho humano, regenerando cartilagem como tecido.A osteoartrite é um dos transtornos debilitantes mais comuns entre a população idosa. Atualmente, não há cura definitiva para as causas sublinhadoras da osteoartrite. Este protocolo clínico é um procedimento inovador para um tratamento promissor, minimamente invasivo e alternativo da osteoartrite do joelho humano, regenerando tecido semelhante à cartilagem.Leve o paciente para uma sala de cirurgia com um capuz classe A de risco biológico, e coloque-o em uma posição supina. Limpe a área abdominal do paciente com 5% de iodo betadina-povidina e drape o paciente usando a técnica estéril, expondo a área limpa do abdômen para lipoaspiração. Aproximadamente cinco centímetros infero-lateralmente do umbigo, anestesiam dois locais, um à esquerda e outro no lado direito do umbigo da incisão a ser feita.Usando dois mililitros de 2% de lidocaína sem epinefrina com uma agulha de 1,5 polegada de calibre 25 em uma seringa de cinco mililitros injetando cada local no nível epidérmico. Anestesiar o local da incisão a ser feita usando cinco mililitros de solução tumescente e seringa de 10 mililitros e a agulha de 25 bitola de 1,5 polegada. Faça duas incisões de 0,5 centímetros aproximadamente cinco centímetros abaixo do umbigo lateralmente, beliscando a pele para elevar a profundidade do nível subcutâneo.Usando uma lâmina número 11, ajude a pele elevada a penetrar até o nível subcutâneo, mas não penetrar através da parede abdominal. Usando cânula de 20 centímetros de 60 metros, anestesia o nível subcutâneo de toda a área inferior do abdômen que deve ser lipoaspirado com 700 a 800 mililitros da solução tumescente. Após terminar a infiltração de todo o abdômen inferior com solução tumescente, prepare um aparelho de lipoaspiração conectando uma cânula de 3,0 milímetros conectada a uma seringa de 60 mililitros ou 30 mililitros para lipoaspiração manual ou especialmente projetada canânula de 3,0 milímetros conectada a um kit de centrífuga.Uma seringa de sistema fechada desenvolvida por nós mesmos e aprovada pela FDA CDRH com o propósito de manter a esterilidade conectada a uma máquina de vácuo para lipoaspiração assistida a vácuo. Realizar lipoaspiração para obter 100 a 110 gramas de tecido adiposo excluindo solução tumescente. Ao realizar a lipoaspiração, o tecido adiposo será obtido juntamente com a solução tumescente, mas deve ser separado e removido.Para separar a solução tumescente primeiro pela gravidade, o tecido adiposo no kit centrífuga pode ser transferido para uma seringa de 60 mililitros e colocar a seringa para baixo. Por exemplo, a parte de abertura da seringa está na parte inferior. Esperando de cinco a seis minutos, o tecido adiposo e a solução tumescente serão separados.Remova o fluido na parte inferior da seringa pressionando a parte superior do êmbolo da seringa. Realize as etapas acima de nove a 11 até que o total de 100 gramas a 110 gramas de tecido adiposo aspirado por joelho tenha sido acumulado. Depois de separar a solução tumescente por gravidade e acumular 50 gramas a 55 gramas de lipídio aspirado por cada 60 mililitros centrífugas kit estéril sistema fechado, coloque os dois kits de centrífugas em um balde de recipiente de centrífugas e gire a 1600 G por cinco minutos, condensando o aspirado lipídico e separando fluido do tecido adiposo.Esse processo condensa ainda mais o aspirado lipída e pode produzir óleo gorduroso em certos casos. Com cuidado para não tremer, remova a tampa de segurança e o plugue na parte inferior do kit centrífuga. Remova o fluido inferior empurrando lentamente para baixo em cima do êmbolo do kit centrífuga.Em seringa de 60 mililitros separados, dissolva 10 miligramas de colagenase, cinco miligramas de colagenase específicos para tecido conjuntivo e cinco miligramas de colagenase específicos para tecido adiposo com 50 mililitros de soro fisiológico normal. Misture aproximadamente 25 a 30 mililitros de lipídico condensado aspirado com colagem dissolvida, cinco miligramas de colagenase específicos para tecido conjuntivo, e cinco miligramas de colagenase específico para tecido adiposo em uma proporção de um a um, volume a volume, conectando a seringa de 60 mililitros a um kit de centrífugas usando um conector especializado. Misture completamente para condensar o aspirado de preparação e colagem, empurrando o conteúdo entre a seringa de 60 mililitros e o kit centrífuga usando uma haste ou um empurrador.Transfira a mistura do lipídio aspirado e a colagem de volta para a seringa de 60 mililitros. Conecte cada seringa de 60 mililitros contendo a mistura com o homogeneizador de tecido que contém lâminas. Conecte uma seringa vazia de 60 mililitros à outra extremidade do homogeneizador.Empurre a mistura para a outra seringa de 60 mililitros através do homogeneizador por quatro a seis vezes, resultando em corte e picar o aspirado lipídudo. Transfira o aspirado lipídico homogeneizado e a mistura de colágeno de volta para o kit de centrífuga de 60 mililitros através de um conector especializado. Coloque os kits de centrífugas em um recipiente a ser colocado em uma incubadora que foi pré-aquecido a 37 graus Celsius.Incubar os dois kits de centrífugas com a mistura homogeneizada a 37 graus Celsius por 40 minutos enquanto gira a 45 rpm. Após 40 minutos de incubação, remova o recipiente da incubadora de forma estéril. Em seguida, remova os kits de centrífugas e coloque-os em uma máquina centrífuga.Centrifugar as misturas a 800 G durante cinco minutos para separar o SVF derivado do tecido adiposo. Após a centrífuga, o supernante, que inclui colagenase e tecido adiposo digerido, é removido de cada kit de centrífuga, removendo a tampa da seringa em cima do êmbolo e colocando uma seringa de 30 mililitros no êmbolo abrindo através de uma conexão de trava de seringa. Pressione lentamente a parte do barril da seringa de 30 mililitros para que o supernatante encha a seringa de 30 mililitros.Pressione o barril de seringa de 30 mililitros até os últimos três a quatro mililitros do fundo do kit centrífuga, deixando apenas os últimos três a quatro mililitros de SVF derivado de tecido adiposo. O supernante é descartado. Remova a seringa de 30 mililitros da parte superior do êmbolo e encha a seringa com solução de anéis lactados de 5%dextrose, também conhecida como D5LR.Ao anexar a seringa de 30 mililitros preenchida com D5LR na parte superior da abertura do êmbolo, encha os kits de centrífugas contendo três a quatro mililitros de SVF derivado de tecido adiposo com D5LR até 55 mililitros. Em seguida, remova a seringa de 30 mililitros, tampe a abertura do êmbolo e centrifugar os kits de centrífugas novamente a 300 G por cerca de quatro minutos. Repita as etapas número 17 ao número 21 para um total de quatro lavagens.Após a quarta centrífuga, a fim de obter o SVF final para injeção, remova a tampa de segurança e o plugue na abertura inferior do kit centrífuga sem balançar ou girar o kit centrífuga. Conecte uma seringa de 20 mililitros à abertura inferior do kit centrífuga usando um conector especialmente projetado. Puxe o êmbolo da seringa de 20 mililitros várias vezes para frente e para trás para agitar as células que se estabeleceram na parte inferior do kit de centrífuga.Remova o volume total desejado do SVF contendo TANTO ASTs quanto ECM, juntamente com outras células e tecidos. Normalmente cerca de três a quatro mililitros de cada kit de centrífuga para injeções articulares do joelho. Fizemos 30 mililitros de sangue autólogo junto com 2,5 mililitros de solução de dextrose citrato anticoagulante.Então o sangue extraído foi transferido para os kits de barril de centrífugas de 60 mililitros. Foi então centrifuada em 730 gravidade por cinco minutos. E o supernante foi removido e colocado em um novo kit de barril de centrífugas de 60 mililitros.O supernasce foi centrifuado em 1350 gravidade por quatro minutos, obtendo 4,4 mililitros de PRP. Limpe o joelho do paciente com 5% de betadina e drape-o de forma estéril. Palpa o anterior do joelho para o espaço articular entre ossos tibiais e femorais.Anestesiar o local de injeção superficialmente com lidocaína diluída, um mililitro de 1%lidocaína diluída com quatro mililitros de soro fisiológico normal, da pele para fora da cápsula articular. Em seguida, anestesiar o interior da cápsula articular com ropivacaína diluída, um mililitro 0,75% ropivacaína diluída com três mililitros de soro fisiológico normal. Misture dois mililitros de HA ao seis a oito mililitros de SVF contidos em uma seringa de 20 mililitros através de uma seringa para conector de seringa.Usando uma seringa para conector de seringa, adicione 0,4 mililitros de cloreto de cálcio aos três a quatro mililitros de PRP autólogo que já foi preparado e estar pronto em uma seringa de cinco mililitros. Combine 3,5 a 4,5 mililitros prp cloreto de cálcio em uma seringa de cinco mililitros com oito a 10 mililitros de mistura HA-SVF em uma seringa de 20 mililitros através de uma seringa para conector de seringa. Injete imediatamente a mistura, cerca de 12 a 15 mililitros, lentamente na articulação tibial-femoral anterior do joelho, usando agulha de calibre 38 milímetros com ou sem a orientação de ultrassom.Após a injeção, enfaixe o local da injeção com pressão dobrando a gaze de algodão 4x4 quatro vezes e colocando fitas sobre a gaze 4x4 dobrada. Instrua o paciente a ficar parado por 60 minutos para permitir a fixação celular. Instrua o paciente a limitar as atividades pelo mínimo de uma semana após a alta da clínica.Retorne à clínica para três injeções adicionais de PRP ativados por cloreto de cálcio ao longo de três semanas. O paciente com estágio três de OA recebeu o tratamento conforme descrito na seção de protocolo. Após a segunda semana da injeção de mistura ASV-ECM, a dor do paciente e a ROM melhoraram.Na 16ª semana, a dor do paciente e a ROM melhoraram significativamente mais de 70% A ressonância magnética pós-tratamento, feita após a 16ª semana, mostrou o aumento da espessura do tecido semelhante à cartilagem no lado medial do joelho. Outro paciente com estágio três de OA recebeu o tratamento conforme descrito na seção de protocolo. Após a segunda semana da injeção de mistura ASV-ECM, a dor do paciente e a ROM melhoraram.Na 18ª semana, a dor e a ROM melhoraram significativamente para 80% A ressonância magnética repetida tomada após a 18ª semana mostrou um aumento na altura do tecido semelhante à cartilagem no lado medial anterior do joelho. O terceiro paciente com estágio três OA recebeu o tratamento conforme descrito na seção de protocolo. Após a segunda semana de injeção de mistura ASV-ECM, a dor do paciente e a ROM melhoraram em aproximadamente 50% Na 22ª semana, a dor e a ROM melhoraram significativamente mais de 80% A ressonância magnética repetida tomada após a 22ª semana mostrou um aumento na altura do tecido semelhante à cartilagem no lado medial do joelho.Atualmente não há terapia curativa disponível para o tratamento de OA. No entanto, a injeção percutânea de terapia de células-tronco com ASCs e ECM homogeneizado juntamente com HA e PRP análogo ativado com cloreto de cálcio pode fornecer uma alternativa à terapia de tratamento atual do tratamento do joelho OA.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este protocolo descreve o isolamento de derivadas de tecido adiposo a partir de células do estroma lipoaspirado e a criação de um defeito de 4 milímetros de tamanho crítico calvária em avaliar a regeneração óssea.

Reparação de um modelo de defeito crítico porte calvária Usando derivadas de tecido adiposo células do estroma colhidas lipoaspirado

Em 2001, pesquisadores da UCLA descreveu o isolamento de uma população de células-tronco adultas, chamadas células-tronco derivadas de tecido adiposo ou ASC, a partir de tecido adiposo. Este artigo descreve o isolamento de ASC de lipoaspirates usando, um protocolo de digestão enzimática manual utilizando colagenase.

Isolamento manual de células-tronco adiposo-derivadas de Lipoaspirates Humanos

A heterogeneidade transcricional dentro das células estromais derivadas do tecido adiposo humano pode ser definida no nível de célula única usando marcadores de superfície celular e genes osteogênicos.  Descrevemos um protocolo que utiliza citometria de fluxo para o isolamento de subpopulações celulares com potencial osteogênico aumentado, que pode ser usado para melhorar a reconstrução esquelética craniofacial.

Isolamento e Enriquecimento da Human adiposo-derivadas células estromais para Osteogenesis Aprimorado

O objetivo deste estudo é relatar um protocolo para o tratamento artroscópico das lesões osteocondrais do tálus usando microfractured e células-tronco adiposo-derivado purificadas.

Microfractured autólogo e purificado tecido adiposo para gestão artroscópica das lesões osteocondrais do tálus

Aqui, apresentamos um protocolo para obter a fração vascular do estroma do tecido adiposo através de uma série de processos mecânicos, que incluem emulsificação e múltiplas centrifugações.

Micronização mecânica de Lipoaspirates para terapia regenerativa

O presente protocolo descreve uma metodologia aprimorada para o isolamento de ADSC, resultando em um tremendo rendimento celular com ganho de tempo em comparação com a literatura. Este estudo também fornece um método simples para a obtenção de um número relativamente grande de células viáveis após a crioppreservação a longo prazo.

Técnica para obtenção de células-tronco mesenquimais a partir da caracterização do tecido adiposo e da fração vascular estromal em criopreservação a longo prazo

A fração vascular estromal isolada mecanicamente (SVF) em combinação com um hidrogel de fibrina oferece um transportador fácil e eficiente para células estromais derivadas de tecido adiposo viáveis para várias indicações, incluindo engenharia de tecidos e/ou fins de cicatrização de feridas. Aqui, apresentamos a preparação de uma construção mecânica de SVF (mSVF)-hidrogel de fibrina para pesquisa translacional e aplicação clínica.

A combinação de fração vascular estromal isolada mecanicamente e hidrogel de fibrina: um protocolo de processamento

Aqui, apresentamos um protocolo que pode transformar o tecido adiposo autólogo em várias substâncias componentes adiposas com diferentes propriedades e funções físico-químicas.

Fracionamento inovador de tecido adiposo para transformar gordura em componentes especializados

Carcinoma associado fibroblastos (FAC) rico em miofibroblastos presentes no estroma tumoral, desempenhar um papel importante na condução de progressão do tumor. Nós desenvolvemos um modelo coimplantation xengraft tumor para gerar FAC experimentalmente a partir de fibroblastos humanos mamária. O protocolo descreve como estabelecer miofibroblastos CAF que adquirem uma capacidade de promover tumourigenesis.

Geração Experimental de Carcinoma Associado fibroblastos (FAC) de Fibroblastos Humanos mamária

Microdissecção a laser é uma técnica que permite a recuperação de células selecionadas a partir de pequenas quantidades de parênquima. Aqui descrevemos um protocolo de aquisição ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos para serem utilizados para estudos de transcriptomic. Nosso protocolo melhora a autofluorescência intrínseca das células beta humanas, facilitando assim a sua coleção.

Protocolo melhorado para microdissecção a laser de ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos

Aprenda a produzir fração vascular estromal derivada de tecido adiposo para regeneração de cartilagem em pacientes com osteoartrite de joelho. Este protocolo minimamente invasivo melhora a função articular.

Protocolo clínico de produzir tecido adiposo-derivado do estroma Vascular fração para a regeneração da cartilagem potenciais

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