De MUB₄₀ Peptide voor gebruik bij de opsporing van ontsteking neutrofiele-gemedieerde gebeurtenissen

MUB40 is een nieuwe neutrofiele marker, die zich bindt aan lactoferrine en maakt een specifieke detectie in de menselijke en alle zoogdier weefsel monster tot nu toe getest. Het labelen van neutrofielen met MUB40 is eenvoudig, snel en specifiek. Het wordt nu veel gebruikt in ons lab en de implicatie van deze techniek strekt zich uit tot de diagnose van ontstekingsziekten.

Om te beginnen, oplossingen een, twee en drie volgens het tekstprotocol, en plaats ze in een anoxische kast 's nachts. Vervolgens centrifugeren de buizen van verzameld bloed op 650 g gedurende 20 minuten om de cellen te scheiden van de plasma-fractie. Zonder het gescheiden bloed te verstoren, breng je de buizen over naar de anoxische kast en breng je de plasmafracties over op een conische buis van 50 milliliter.

Verwijder hierna de buis van plasma uit de anoxische kast en vercentrifuge het gedurende 20 minuten op 2900 g. Zorg ervoor dat de pelleted bloedplaatjes niet verstoren, breng de buis naar de anoxische kast en pipette de bloedplaatjes slecht plasma in een verse 50 milliliter buis. Met behulp van de bloedafname buizen, combineren de rode bloedcellen in een conische 50 milliliter buis.

Voeg vervolgens 0,9% natriumchlorideoplossing toe tot het totale volume 44 milliliter bereikt en voeg zes milliliter van 6% dextran toe. Keer de buis 10 tot 20 keer om het bloed en het dextranmengsel voorzichtig te mengen en laat de buis minstens 30 minuten sedimenteren. Terwijl de buis sedimenten, bereiden een Percoll gradiënt door het toevoegen van 4,2 milliliter Percoll oplossing tot 5,8 milliliter plasma, en omkeren de buis te mengen.

Verzamel vervolgens de neutrofiele met de bovenste fractie van de dextran, waarbij u ervoor zorgt dat ze geen rode bloedcellen pipette. Draai de schroefdop aan, haal de dextranbuis uit de anoxische kast en vercentrifuge de buis gedurende 10 minuten op 300 g. Zorg ervoor dat de gepelde cellen niet worden verstoord, plaats de buis terug in de anoxische kast.

Verwijder vervolgens de vloeistof door te pipetten. Voorzichtig resuspend de pellet in een milliliter plasma. Voeg langzaam de geresuspendeerde cellen toe aan de toppen van de Percoll-oplossing.

Verwijder de Percoll-oplossingsbuis voorzichtig uit de anoxische kast en vercentrifugeren 20 minuten lang met 800 g om PBMCs van neutrofielen te scheiden. Bereid vervolgens 14 milliliter wasbufferoplossing volgens het tekstprotocol. Plaats vervolgens de Percoll buis in de anoxische kast.

Gebruik een pipet om de Percoll en PBMCs te verwijderen en de neutrofiele bevattende pellet opnieuw op te plaatsen in één milliliter wasbufferoplossing. Voeg vervolgens 200 microliter magnetische kralen toe aan de geresuspendeerde cellen. Meng en ontcubeer de cellen en kralen gedurende ten minste 15 minuten.

Was hierna twee maal een scheidingskolom, met twee milliliter wasbuffer. Terwijl u een nieuwe, 15 milliliter conische buis onder de kolom, langzaam pipette de neutrophil rode bloedcel mengsel door de kolom. De doorstroom van de kolom moet troebel zijn en zijn rode kleur verliezen, wat de totale scheiding van neutrofielen van de resterende rode bloedcellen bevestigt.

Voeg twee milliliter wasbuffer toe aan de bovenkant van de kolom en verzamel de doorstroom in dezelfde buis. Tegen het einde van deze wasbeurt moet de doorstroming duidelijk zijn. Meng voorzichtig de opvangbuis om ervoor te zorgen dat de neutrofielen gelijkmatig worden verdeeld.

Vervolgens verzamelde 10 microliter van de flow-through van celtelling. Verwijder hierna de neutrofiele buis uit de anoxische kast en vercentrifuge de buis gedurende 20 minuten op 300 g. Plaats de gesedimenteerde neutrofielen terug in de anoxische kast en verwijder de wasbuffer via pipetting.

Dan, resuspend de pellet in plasma. Voeg een microliter RI-MUB40-Cy5 toe aan een milliliter RPMI-1640 medium, zonder fenolrood, en meng via pipetting. Voeg vervolgens een microliter FMLP-oplossing en pipet toe om te mengen.

Breng het mengsel naar een glazen bodem microscopie schotel. Voeg vervolgens een passend volume gezuiverde cellen toe aan de schotel. Tot slot, plaats het gerecht in een omgekeerde fluorescerende microscoop en start beeldverwerving.

In dit protocol werd MUB40 gebruikt op levende cellen om neutrofiele afscheiding te detecteren bij simulatie met FMLP. De dynamiek van de afgifte van korrelgehalte, met inbegrip van lactoferrine, kan worden gevisualiseerd na verloop van tijd, hier in magenta. MUB40 kan bovendien worden gebruikt op vaste neutrofielen.

Hier, fagocytiserende fluorescerende kralen in een getimede serie. De inhoud van Neutrophil granulaat is hier in het blauw gelabeld. De neutrofielen toonden weinig tot geen cel vlekken op vroege punten en geleidelijk, RI-MUB40 etikettering toegenomen na verloop van tijd, zowel op het plasmamembraan en kraal oppervlak.

MUB40 kan ook worden gebruikt op vaste ontstekingsweefsels om neutrofielen specifiek te detecteren, zoals blijkt uit de tekstcijfers. We beschrijven hier de neutrofiele zuiveringsprocedure, routinematig toegepast in ons lab. Elke andere methode is geschikt, MUB40-Cy5 etikettering zal nog steeds werken.

Neutrophil kan specifiek worden gelabeld met MUB40 na zuivering, of direct in ontstoken weefsel van patiënten of dierlijke modellen. Verschillende MUB40 derivaten zijn ontworpen om het gebruik ervan te verbreden. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van ontsteking, om neutrofiele rekrutering en activering bij ontstekingsziekten te onderzoeken.