Induktion der medikamenteninduzierten Autoimmunhepatitis bei BALB/c-Mäusen zur Untersuchung ihrer pathogenen Mechanismen

Lebererkrankungen und Leberzirrhose sind die sechsthäufigste Todesursache bei Erwachsenen zwischen 25 und 64 Jahren. Idiosynkratische DILI, manchmal auch als medikamenteninduzierte, autoimmune oder immunvermittelte Hepatitis bezeichnet, ist die dritthäufigste Ursache für akutes Leberversagen in den Vereinigten Staaten und der häufigste medikamenteninduzierte Hyposensibilisierungsprozess in der Leber. Dieser Prozess tritt bei etwa 9 bis 12 % der Patienten mit Autoimmunhepatitis auf, und diese Form der Hepatitis ist der häufigste Grund, warum ein Medikament vom kommerziellen Markt genommen wird.

Die überwältigende Mehrheit der Patienten mit medikamenteninduzierter Hepatitis sind Frauen. Dieses Protokoll beschreibt kritische Merkmale, die bei Patienten beobachtet werden, wie Hepatitis, Autoantikörper und Geschlechtsunterschiede. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Reproduzierbarkeit in einem In-vivo-Mausmodell, die den Wissenschaftlern die Möglichkeit gibt, die Entwicklung der Krankheit und ihre Folgen zu beobachten.

Mit Hilfe dieses Protokolls entdeckten wir ein gemeinsames Epitop bei Anästhesie- und Virushepatitis, das bei Patienten mit Anästhesiehepatitis ein dominantes Epitop ist und bei Patienten mit Virushepatitis signifikant mit Fibrose assoziiert ist. Wir glauben, dass diese Informationen verwendet werden können, um spezifische diagnostische Tests für medikamenteninduzierte oder virale Hepatitis oder damit verbundene Fibrose zu entwickeln, die hoffentlich Personen mit einem Risiko für die Entwicklung dieser Krankheit oder ihrer Folgen vorhersagen können. Die schriftlichen Techniken können überwältigend sein, da wir immer mehrere Kontrollen und Abwägungen verwenden, um die Reproduzierbarkeit unserer Ergebnisse zu gewährleisten.

Wenn Sie das erste Mal das Experiment durchführen, nehmen Sie sich genügend Zeit. Nach dem ersten Durchlauf geht es ziemlich schnell. Nach der Euthanasie der BALB/c-Maus wird der intraabdominale Inhalt mit einer mikrochirurgischen Schere durch einen Mittellinienschnitt freigelegt und ein kleiner Schnitt in der unteren Hohlvene gemacht, um das Blut zu entfernen.

Legen Sie dann einen 24-Gauge-Angiokatheter in die Pfortader. Halten Sie das PBS in einem Wasserbad bei vier Grad Celsius und verwenden Sie eine Schlauchpumpe, um die Leber mit 40 Millilitern PBS mit einer Geschwindigkeit von 10 Millilitern pro Minute zu überschwemmen. Lösen Sie die Leber vorsichtig mit einer Mikroschere aus dem Bauch und wiegen Sie die Leber auf einem tarierten Waagschiffchen.

Schneide die Leber in kleine 10 bis 15 Millimeter große Stücke. Geben Sie die Leberproben sowie den Homogenisierungspuffer, der viermal so schwer ist wie eine Mausleber, in ein 15-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen und ergänzen Sie es mit vollständigen Proteasehemmer-Cocktailtabletten, wie es im Manuskript heißt. Verwenden Sie einen allgemeinen Laborgewebehomogenisator bei mittlerer Geschwindigkeit, um die Proben auf Eis glatt zu homogenisieren.

Zentrifugieren Sie die Leberhomogenate bei 1.500 mal G für 10 Minuten und gießen Sie dann das überstehende zytosolische S100 ab. Nach erneuter Zentrifugation bei 100.000 x G frieren Sie das überstehende zytosolische S100 in Trockeneis ein und frieren das Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius ein. Um mit der Trifluoracetylierung zu beginnen, tauen Sie den S100 bei Raumtemperatur auf. Dann werden in einem Erlenmeyerkolben 20 Milligramm Maus-S100 bis 10 Milliliter mit entionisiertem Wasser verdünnt.

Stellen Sie mit dem pH-Messgerät den pH-Wert mit 1-normalem Kaliumhydroxid auf 10 ein. Geben Sie in einem Abzug 4,7 Millimol S-ETFA in die Lösung. Halten Sie den pH-Wert zwischen 9,9 und 10,0, indem Sie etwa eine Stunde lang 1-normales Kaliumhydroxid in Tröpfchenform verabreichen.

Notieren Sie das Gesamtvolumen von Kaliumhydroxid für jede Reaktion. Übertragen Sie die Lösungen in separate Dialysekassetten. Legen Sie die Kassetten in vier Liter entionisiertes Wasser, um 72 Stunden lang mit drei Wechseln pro Tag zu dialysieren.

Nach der Dialyse ist das endgültige Volumen des trifluoracetylierten S100 aufzuzeichnen und dann in markierte Röhrchen zu aliquotieren. Die Röhrchen in Trockeneis einfrieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Wenn die Proteinkonzentration gemäß dem Manuskript bestimmt ist und größer als ein Milligramm pro Milliliter ist, wird ein Milligramm jedes nativen und TFA-veränderten Proteins zu einem Milliliter deionisiertem Wasser in separaten Kugelröhrchen hinzugefügt.

Bereiten Sie eine Platzpatrone im Geschossrohr mit einem Milliliter entionisiertem Wasser vor. Geben Sie in eine 96-Well-Platte jeweils 50 Mikroliter des blinden, nativen und veränderten Proteins in doppelter Ausführung. Geben Sie dann 50 Mikroliter 4%ige Natriumbicarbonatlösung, gefolgt von 50 Mikrolitern 0,1%2, 4, 6-Trinitrobenzolsulfonsäure in jede Vertiefung.

Inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang bei 40 Grad Celsius. Nach der Inkubation geben Sie 50 Mikroliter 10 % SDS in jede Vertiefung, gefolgt von 25 Mikrolitern 1-normaler Salzsäure. Nach der Immunisierung und Anästhesierung der Maus legen Sie die intraabdominale Höhle mit einer mikrochirurgischen Schere frei.

Identifiziere die Milz. Schneiden Sie die Milz am Stiel ab und legen Sie sie in eine Petrischale mit PBS mit 2% fötalem Kälberserum. Um die Zellen zu lösen, klemmt man die Milz zwischen zwei Milchglas-Objektträger und reibt sie aneinander.

Verwenden Sie eine elektronische Pipette, um die Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen aus Polypropylen zu übertragen. Zum Waschen geben Sie PBS mit 2 % FCS in das Röhrchen, um ein Volumen von 50 Millilitern zu erreichen, und zentrifugieren Sie mit einer gekühlten Tischzentrifuge bei 335 mal G. Gießen Sie den Überstand ab und wiederholen Sie den Waschschritt.

Geben Sie einen Milliliter ACK-Lysingpuffer in das Röhrchen, um es eine Minute lang zu waschen, um rote Blutkörperchen zu entfernen. Wiederholen Sie dann den FCS-ergänzten PBS-Waschschritt. Nachdem Sie die Zellen 30 Minuten lang mit CFSE markiert haben, fügen Sie 10 Mikrogramm pro Milliliter Cytochrom-P450 2E1, JHDN5 oder trifluoracetyliertes Ovalbumin hinzu, um die markierten Zellen 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius im Inkubator zu stimulieren.

Nach der Inkubation färben Sie die Zellen mit CD4, das mit Allophycocyanin markiert ist, im Verhältnis 1:100 für 30 Minuten auf Eis. Nach der Laparotomie der immunisierten Maus, wie im Manuskript beschrieben, wird die Pfortader mit einer 25-Gauge-Nadel kanüliert und dann die untere Hohlvene unterhalb der Nierenvenen durchtrennt. In einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad perfundieren Sie jede Leber mit 40 Millilitern PBS bei einer Durchflussrate von 10 Millilitern pro Minute.

Schneiden Sie nach der Perfusion mit einer mikrochirurgischen Schere die Leber am Leberstiel, entfernen Sie die Gallenblase und schneiden Sie dann die Leber am Hilum. Verwenden Sie auf einem 300-Mesh-Edelstahlsieb einen sterilen 20-Milliliter-Spritzenstößel und kaltes PBS, um die Leber zu zerkleinern. Mit dem Sieb filtrieren Sie die resultierende Zellsuspension in vorsterilisierte 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Bringen Sie jede Suspension mit kaltem PBS auf 50 Milliliter und waschen Sie die Suspension dann 10 Minuten lang durch Zentrifugation bei 370 mal G. Entsorgen Sie den Überstand und mischen Sie dann die Pellets durch Behandlung in neue 50-Milliliter-Röhrchen. Suspendieren Sie die kombinierten Pellets in 45 Millilitern 35% Percoll in PBS und 100 internationalen Einheiten pro Milliliter Heparin. Drehen Sie dann jedes Röhrchen 10 Minuten lang bei 20 Grad Celsius mit dem 500-fachen G.

Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern PBS und fügen Sie dann jedem Pellet einen Milliliter ACK-Lysingpuffer hinzu und lagern Sie es 10 Minuten lang auf Eis. Nach erneutem Waschen mit PBS durch Zentrifugation bei 370 mal G verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie dann die Zellen mit FCS-ergänztem PBS durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 370 mal G. Verwenden Sie ein elektronisches Hämozytometer, um die Zellen zu zählen. In diesem Experiment wurden die CD4+T-Zell-Immunantworten mittels Durchflusszytometrie bestimmt.

Repräsentative Proliferationsdaten wurden an Tag 14 mittels CFSE als Reaktion auf den Trifluoracetylmetaboliten Cytochrom-P450 2E1 und das Cytochrom-P450 2E1-Epitop JHDN5 gewonnen. Als Kontrollen wurden Vertiefungen ohne Antigen verwendet. Im Vergleich zur Kontrolle entwickelten BALB/c-Mäuse eine Proliferation als Reaktion auf trifluoracetyliertes Ovalbumin und Cytochrom-P450 2E1, aber nicht auf JHDN5.

Drei Wochen nach der TFA-Emulgation in der vollständigen Freund-adjuvanten Immunisierung entwickelten weibliche BALB/c-Mäuse im Vergleich zu männlichen BALB/c-Mäusen eine stärker medikamenteninduzierte Autoimmunhepatitis. Auch die histologische Analyse des Lebergewebes zeigt bei weiblichen Mäusen eine schwerere Hepatitis-Entzündung als bei männlichen Mäusen. Die Anzahl der hepatischen CD4+CD8+NK+- und NKT+-Zellen war bei Frauen signifikant höher als bei Männern.

Obwohl es keine Unterschiede in den B-Zellen zwischen diesen Mäusen gab Denken Sie daran, dass diese Formulierung trotz eines langen Tages lange hält. Dieses Verfahren kann auch durchgeführt werden, um das Epitop zu trifluoracetylieren. Dieses Verfahren ermöglichte es den Forschern, den zeitlichen Verlauf der Entwicklung von Lebererkrankungen zu analysieren und das Potenzial für neue Entdeckungen von Proteinen und Signalwegen zu erhöhen.

S-Ethyltrifluorthioacetat ist giftig und sollte in einem Abzug gehandhabt werden. Darüber hinaus werden gute Laborpraktiken und -techniken dringend empfohlen.