Name: 在 Vivo 三维双光子显微镜中,利用玻璃微移器研究本地 ATP 喷射的血管反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: 探索利用玻璃微移器进行局部ATP喷射并结合三维双光子显微镜成像，研究脑毛细血管血管反应的新方法。该技术可精确测量毛细血管直径变化，模拟局部突触活动，为神经血管相互作用和胶质细胞功能研究提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由伦德贝克基金会、诺和诺德基金会、丹麦独立研究理事会 | 医学科学以及北欧银行基金会授予健康老龄化研究中心的资助支持。

所有涉及动物的实验程序均经丹麦国家伦理委员会批准，符合欧洲理事会《实验和其他科学用途脊椎动物保护公约》所制定的指南，并遵循ARRIVE指南。&#160;本实验为终末性操作，小鼠在麻醉恢复前将被实施安乐死。
1. 术前准备
<ol>
	<li>使用70%乙醇清洁手术台及周围所有区域。手术前彻底清洁并干燥手术器械。</li>
	<li>通过腹腔注射将氯胺酮和赛拉嗪（60 mg/kg + 10 mg/kg）溶于无菌水（pH 7.4）中，对NG2DsRed小鼠（Tg(Cspg4-DsRed.T1)1Akik/J；雌雄不限；4-8月龄）进行麻醉。每25分钟追加一次氯胺酮（30 mg/kg），直至手术结束。定期检查尾巴和脚趾夹捏反射，以确认麻醉深度。</li>
	<li>在小鼠背部四个不同位置皮下注射生理盐水，总注射体积为1 mL，以防止实验过程中脱水。为防止眼睛干燥，涂抹眼用润滑剂。使用直肠温度探头和加热垫将体温维持在37 °C。</li>
</ol>
2. 手术步骤
<ol>
	<li>气管切开术
	<ol>
		<li>将小鼠仰卧位固定。在预定切口下方皮下注射0.04 mL 0.5%利多卡因，等待2分钟。在胸骨（胸骨柄）上方做一条10 mm长的切口。分离下颌下腺和胸骨甲状肌，暴露气管。</li>
		<li>用剪刀在两个气管环之间行气管造口。将一根长度为16.2 mm、直径为1 mm的小金属管插入气管。将该管连接至机械通气机和二氧化碳监测仪，以监测呼气末CO2（图1A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>导管插入
	<ol>
		<li>在预定切口下方皮下注射0.5%利多卡因（0.04 mL），等待2分钟。</li>
		<li>使用尖头镊子轻柔分离动脉与静脉。用微血管夹阻断上游血流。使用10-0尼龙缝线结扎两根血管，以限制下游血流。</li>
		<li>使用显微解剖剪刀在动脉和静脉上各做一小切口。将塑料导管分别插入两根血管中。通过收紧缝线（根据血管大小选用8-0或10-0尼龙缝线）固定导管，注意避免压迫导管腔。移除微血管夹并缝合皮肤。</li>
		<li>通过动脉导管监测血压。在每次实验前后，使用血气分析仪检测动脉血样本（50 μL）中的血气水平（正常值：pO2，90–120 mmHg；pCO2，35–40 mmHg；pH，7.25–7.45）。通过静脉导管输注荧光素和麻醉剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开颅术
	<ol>
		<li>剃除小鼠两耳之间头部的毛发。在预定切口下方皮下注射0.04 mL 0.5%利多卡因，等待2分钟。</li>
		<li>用10%氯化铁溶液擦拭颅骨，以去除骨膜。用生理盐水彻底冲洗颅骨。使用氰基丙烯酸酯胶水及活化剂将金属头杆粘附于颅骨上（图1A）。 
		注：金属头杆长75 mm，宽13.5 mm，中央有一个直径为5 mm的圆孔。</li>
		<li>在冠状缝后0.5 mm、右侧3 mm处的右侧感觉桶状皮层区域，钻一个直径为4 mm的颅骨窗。使用尖头血管扩张器去除硬脑膜。</li>
		<li>用溶解于人工脑脊液（aCSF；pH = 7.4）并冷却至35 °C的0.75%琼脂糖凝胶覆盖暴露的皮层。将盖玻片以10–15°角覆盖在颅骨窗80–90%的区域，使其相对于金属头杆倾斜，以便插入和放置玻璃微移液管（图1B）。</li>
		<li>为减少脑搏动，使用氰基丙烯酸酯胶水及活化剂将盖玻片的两个角粘附于金属头杆上。施加活化剂时需小心，避免接触暴露的脑组织。之后用生理盐水彻底冲洗已粘附的盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行胡须垫刺激探针的插入。将一组定制的双极电极（长度8 mm，厚度0.25 mm）经皮插入小鼠左侧面部，以刺激对侧（即右侧）三叉神经的眶下支。将阴极置于眶下孔附近，阳极插入咀嚼肌中7。使用电刺激器以1.5 mA强度、1 ms脉宽、2 Hz频率进行20 s成串刺激。</li>
	<li>手术完成后，经股静脉推注0.05 mL异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-葡聚糖，4% w/v，分子量[MW] 50,000）以标记血浆。停止使用氯胺酮，并将麻醉方式转为持续静脉输注α-氯醛糖（17% w/v，终浓度）与FITC-葡聚糖（2% w/v，终浓度）的混合液，输注速率为0.02 mL/10 g/h。等待约半小时，使新的麻醉状态稳定。 
	注：FITC-葡聚糖和α-氯醛糖均溶解于0.9%生理盐水中。</li>
</ol>
3. 首次双光子成像实验
<ol>
	<li>将小鼠转移至商用双光子显微镜的载物台上（材料表）。在红荧光蛋白（RFP，图1C）和绿荧光蛋白（GFP，图1C）的落射荧光照明模式下，使用5倍物镜拍摄暴露的大脑皮层图像。将RFP图像作为下一操作步骤中玻璃微移液管插入的“定位图”。 
	注意：GFP“定位图”用于区分静脉/微静脉与动脉/微动脉。</li>
	<li>使用双光子显微镜和25倍、数值孔径（NA）为1.0的水浸物镜（带压电马达），进行双光子成像。激发波长设定为900 nm。在皮层中搜索并追踪每一条穿支动脉，找到其水平分支（1级毛细血管）。</li>
	<li>在静息状态及胡须垫刺激期间，对穿支动脉及其1级毛细血管进行成像。详细的成像参数见第5节。</li>
	<li>在RFP“定位图”上标记胡须垫刺激期间血管扩张幅度&#62;5%的1级毛细血管位置（图1C）。血管扩张幅度&#60;5%的位置被视为位于胡须桶状皮层区域之外。 
	注意：若实验中使用野生型小鼠而非NG2DsRed小鼠，则应使用GFP图像作为“定位图”。</li>
</ol>
4. 玻璃微电极的插入
<ol>
	<li>使用拉针仪（材料表）制备用于吹注的玻璃微量移液管。玻璃微量移液管的电阻为 3–3.5 MΩ，锥形长度为 4.5–5 mm。向移液管中加入含有 1 mM ATP 和 10 µM Alexa 594 的混合液，以便在落射荧光灯和双光子显微镜下观察移液管尖端。</li>
	<li>将玻璃微量移液管安装到膜片钳电极夹持器上，并连接至空气泵。将泵的维持压力设置为 0 psi。</li>
	<li>使用红色落射荧光照明，通过 5 倍物镜对准移液管尖端。将玻璃移液管置于琼脂糖上方的 aCSF 中。调节空气泵的维持压力至 0.2 psi。可在 aCSF 中观察到少量红色云状物从移液管尖端喷出，以防止插入过程中堵塞。</li>
	<li>在 RFP“图谱”中标记的位置中选择一个作为目标位点。将移液管尖端移动至盖玻片边缘的水平面，距离约 30 µm，并在 x-y 平面上大致指向目标位置。</li>
	<li>在 z 轴方向小心地将移液管尖端插入盖玻片下方。然后开始将玻璃移液管向目标位置推进，直至距脑表面约 500 µm 处。频繁切换对焦位置，观察盖玻片边缘、移液管尖端和脑表面，确保移液管移动路径有足够的空间。</li>
	<li>切换至 25 倍物镜。重新居中移液管尖端，并继续向 RFP“图谱”上的目标位置推进，保持移液管尖端位于琼脂糖层内。</li>
	<li>当移液管尖端距脑表面约 100 µm 时，切换成像模式至双光子显微镜。聚焦于待吹注的目标位置，记录其 x、y 坐标（x0, y0）以及其在表面下的深度（z0）。按下式计算脑表面插入点的坐标（xi, yi）： 
	xi = x0 + z0 / tan θ 
	yi = y0 
	其中 θ 为移液管夹持器与水平面之间的夹角。</li>
	<li>将移液管尖端定位至脑表面坐标（xi, yi）处，轻柔缓慢地插入移液管，直至到达（x0, y0, z0）。若插入路径上有血管阻碍，应撤回移液管并重新计算其他插入坐标和路径；或轻微旋转载物台（如 图 1A 所示）。</li>
	<li>将泵的维持压力设为 0 psi，喷射压力设为 10–15 psi。在双光子成像过程中，在目标位置吹注 ATP，持续时间为 200–400 ms。根据每根移液管的特性及实验过程中的情况，按讨论部分所述调整吹注压力和持续时间。</li>
</ol>
5. 双光子超分辨率成像
<ol>
	<li>使用双光子显微镜配合25倍、1.0数值孔径（NA）的水浸物镜及压电马达进行实验。将激发波长设定为900 nm。通过滤光收集发射光信号：从DsRed（周细胞）/四甲基罗丹明异硫氰酸酯标记的葡聚糖（TRITC-dextran）染色的血浆中收集红光，从FITC-dextran（血浆）/GCaMP6（GFP，星形胶质细胞钙信号）中收集绿光。</li>
	<li>在感兴趣区域生成包含穿支小动脉的高分辨率z轴层扫图像st 二阶毛细管nd 按毛细血管及可能邻近的荧光细胞（如周细胞、星形胶质细胞）进行排序。通过尽可能包含血管的三维结构来确定高分辨率三维成像的x*y*z体积。每个图像堆栈的总高度可能在30–50 μm之间，而x-y平面大致覆盖60 µm × 40 µm的区域。</li>
	<li>将成像软件中的图像堆栈设置为包含8-10个层面，层面间距为4-5 µm。压电马达物镜在z轴的每一层停止以采集每个层面的图像。采样速率为每秒1个堆栈，x-y平面的像素分辨率为0.2-0.3 µm。图2A一次记录通常包括10组吹气前图像堆栈和150组吹气后图像堆栈。</li>
</ol>
6. 数据处理
<ol>
	<li>使用定制的分析软件处理数据。通过最大强度投影将每个图像堆栈展平为单个图像（图2B）。在目标血管垂直方向上绘制一个宽度为3 µm的矩形兴趣区域（ROI）（图2C）。</li>
	<li>为尽量减少红细胞阴影及皮层轻微振动带来的干扰，将矩形ROI沿其方向投影并取平均值，生成一条代表该血管段平均轮廓的线。对每幅最大强度投影图像均执行此操作。</li>
	<li>将所得轮廓线以二维图像形式绘制，其中x轴按时间顺序排列各最大强度图像（图2D，上图）。采用主动轮廓算法（Chan-Vese分割法）识别血管边缘8,9（以红色曲线标示；图2D，上图）。</li>
	<li>将血管直径随时间的变化过程计算为血管两侧边缘之间的距离差（即图2D下图中上下两条红色曲线之间的垂直距离）。将直径变化相对于吹气前的基线直径进行归一化处理，并绘制直径变化随时间变化的曲线。对每个ROI均执行此操作（图2E）。</li>
	<li>血管反应幅度定义为吹气后达到的最高或最低峰值幅度。反应潜伏期定义为达到半最大幅度所需的时间（图2G）。通过沿血管路径放置节点的方式手动追踪骨架化的血管结构（图2F），并测量各ROI与穿支动脉之间的地理距离。通过将距离除以潜伏期之差来计算CVR传播速度。</li>
</ol>
7. 病毒载体注射
<ol>
	<li>为了同时研究星形胶质细胞的钙反应，按照标准的立体定位病毒载体注射程序10，将0.6 µL病毒载体（pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f，Addgene）注射到NG2DsRed小鼠的体感皮层中。</li>
	<li>三周后，小鼠体感皮层中的星形胶质细胞表达基因编码的钙指示剂GCaMP6f。按照前述的小鼠手术程序和双光子成像方法进行操作。为区分星形胶质细胞与血管腔，使用TRITC-葡聚糖而非FITC-葡聚糖将血管腔染成红色。</li>
</ol>

<ol><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Function+of+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and Function of the Blood-Brain Barrier.</a> Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).</li>
<li>Hall, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+Pericytes+Regulate+Cerebral+Blood+Flow+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease.</a> Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation-Induced+Increases+in+Cerebral+Blood+Flow+and+Local+Capillary+Vasoconstriction+Depend+on+Conducted+Vascular+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Two-Photon+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Mathiesen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Dependent+Increases+in+Local+Oxygen+Consumption+Correlate+with+Postsynaptic+Currents+in+the+Mouse+Cerebellum+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).</li>
<li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Patch-Clamp+Recordings+and+Single-Cell+Electroporation+of+Unlabeled+Neurons+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo.</a> Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).</li>
<li>Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+and+Uncoupling+of+Activity-Dependent+Increases+of+Neuronal+Activity+and+Blood+Flow+in+Rat+Somatosensory+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex.</a> The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).</li>
<li>Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Local+Chan-Vese+Model+for+Image+Segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Pattern+Recognition%22%5BJournal%5D)">An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation.</a> Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).</li>
<li>Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+Contours+without+Edges+for+Vector-Valued+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Communication+and+Image+Representation%22%5BJournal%5D)">Active Contours without Edges for Vector-Valued Images.</a> Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+Gene+Delivery+in+the+Rodent+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain.</a> Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li>
<li>Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Role+for+the+Vascular+Endothelium+in+Functional+Neurovascular+Coupling+in+the+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787(2014).</li>
<li>Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Stimulus-Evoked+Astrocyte+Ca2%2B+Elevations+and+Hemodynamic+Responses+in+Mouse+Somatosensory+Cortex+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).</li>
<li>Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+Circuit+Activity+Evokes+Rapid+Astrocyte+Calcium+Signals+on+a+Similar+Timescale+to+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons.</a> Neuron. 98 (4), 726(2018).</li>
<li>Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+Confocally-Aligned+Planar+Excitation+%28Scape%29+Microscopy+for+High+Speed+Volumetric+Imaging+of+Behaving+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms.</a> Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

血管研究的一个挑战是精确测量血管直径。本文所述方法采用电动压电物镜，通过双光子显微镜进行快速、重复的高分辨率层析成像。首先，该方法可在不丢失焦点的情况下对穿支小动脉、1st级和2nd级毛细血管进行重复观察，从而在活体中发现了毛细血管内缓慢传导的血管反应。其次，结合病毒载体注射技术，该方法使我们能够在三维空间中研究星形胶质细胞的钙反应，这对于血流调节研究至关重要。
该方法并非没有局限性。首先，在进行三维成像前需定义一个狭窄的矩形视野，以实现高时间分辨率，但这通常会将成像范围限制在前三级毛细血管。其次，双光子显微镜的激光必须完全对准；若激光未对准，会导致每一帧图像的中心偏移，从而错误地增大血管直径的测量值。第三，三维成像的采样速率仅能捕捉较慢的脑血管反应（CVRs）以及星形胶质细胞中缓慢的钙信号变化；每堆栈1-2 Hz的速度仍不足以研究快速的脑血管反应11或星形胶质细胞中的快速钙信号12,1...

大脑具有很高的能量消耗速率。人体消耗的氧气中有约20%、葡萄糖中有约25%用于维持大脑功能，而大脑仅占人体总质量的2%。维持正常的大脑功能需要通过复杂的血管网络提供充足且高效的氧气和营养供应。局部脑活动与脑血流量（CBF）之间存在强烈的耦合关系，这种耦合依赖于神经元、星形胶质细胞、周细胞、平滑肌细胞（SMCs）和内皮细胞（ECs）的功能特性1。最近，从穿支小动脉分支出的前几级毛细血管被发现是一个“热点”区域2，能够主动调节毛细血管血流。在小鼠体感皮层中，无论是胡须刺激还是通过玻璃微移液管局部喷射三磷酸腺苷（ATP），该“热点”区域均被发现存在一种缓慢传导的血管反应（CVR）3。
尽管双光子激光扫描荧光显微镜的活体成像技术已广泛用于研究大脑皮层中的神经血管反应，但大多数研究仅测量血管直径，并在二维（2D）x-y平面内探讨其调控机制。然而存在以下挑战：首先，脑血管及其包裹的星形胶质细胞、周细胞和平滑肌细胞（SMCs）在三维（3D）空间中形成分支结构，因此在三维层面研究它们之间的相互作用至关重要。其次，即使微小的焦平面漂移也会影响血管直径和细胞荧光信号的精确测量。最后，脑血管反应（CVRs）在三维空间中发生迅速且范围广泛，因此三维体积扫描是检测CVRs并揭示其机制的最佳方法。我们在双光子显微镜中集成了压电马达物镜，用于活体研究小鼠体感皮层，通过对获取图像进行最大强度投影，实现血管直径的精确测量。
玻璃微量移液管常用于体内脑部研究，例如批量加载有机染料4、记录脑电图（EEGs）5以及进行膜片钳技术6。然而，仍存在一些局限性。通常情况下，玻璃微量移液管的尖端位置放置不够精确，或未能用于局部干预。本文中，我们优化了微量移液管插入及局部喷射的操作流程。
此外，三维双光子显微镜与基因编码的荧光指示剂相结合，为在三维尺度上研究神经血管耦合提供了前所未有的机会。在本研究中，我们利用这一技术优势，将携带星形胶质细胞特异性基因编码钙指示剂的病毒载体注射到小鼠体感皮层中。通过结合不同的荧光标记物，同时对星形胶质细胞以及血管直径进行成像。
总体而言，我们提出了一种通过玻璃微移液管局部喷射（喷 puff）与快速双光子超分辨率成像相结合的优化方法，可精确测量毛细血管直径的变化。此外，该方法还提供了一种新颖的工具，能够同时研究星形胶质细胞中钙离子（Ca2+）反应的三维分布以及血管直径的响应。

<table><tbody><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma&amp;ndash;Aldrich</td><td>A6138</td><td>用于暴露的大脑皮层表面以提供保护</td></tr><tr><td>Alexa 594</td><td>Life Technologies</td><td>A-10438</td><td>使喷注化合物呈现红色荧光</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>血管扩张剂和血管收缩剂，用于喷注实验</td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶水及活化剂</td><td>Loctite</td><td>Adhesives and SF7452</td><td>用于粘合金属片与盖玻片</td></tr><tr><td>眼用润滑剂</td><td>Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark</td><td></td><td>保持小鼠眼睛湿润</td></tr><tr><td>FITC-葡聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD500S</td><td>血清染料，呈绿色荧光</td></tr><tr><td>NG2DsRed 小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>8241</td><td>此类转基因小鼠在小鼠 NG2 (Cspg4) 启动子控制下表达一种红色荧光蛋白变体（DsRed）</td></tr><tr><td>pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f</td><td>Addgene</td><td>52924-AAV5</td><td>携带基因编码钙指示剂的星形胶质细胞特异性病毒载体</td></tr><tr><td>TRITC-葡聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52194</td><td>血清染料，呈红色荧光</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器清单&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>气泵</td><td>WPI</td><td>PV830</td><td>为微管喷注提供气压</td></tr><tr><td>血气分析仪</td><td>Radiometer</td><td>ABL 700</td><td>测量血液气体水平&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>血压监测仪</td><td>World Precision Instruments</td><td>BP-1</td><td>监测动脉血压</td></tr><tr><td>体温控制器</td><td>CWE</td><td>Model TC-1000</td><td>维持小鼠体温在生理范围内</td></tr><tr><td>微分压二氧化碳监测仪（Capnograph）</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Type 340</td><td>监测小鼠呼气末 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 浓度</td></tr><tr><td>电刺激器</td><td>A.M.P.I.</td><td>ISO-flex</td><td>用于刺激胡须垫</td></tr><tr><td>机械呼吸机</td><td>Harvard Apparatus</td><td>D-79232</td><td>在生理范围内对小鼠进行机械通气</td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>双光子显微镜</td><td>Femtonics Ltd</td><td>Femto3D-RC</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;手术器械清单&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖镊&amp;nbsp;</td><td>Lawton</td><td>09-0007</td><td></td></tr><tr><td>角度平衡镊</td><td>S&amp;T AG</td><td>00595 FRAS-18 RM-8</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪</td><td>Lawton</td><td>05-1450</td><td></td></tr><tr><td>微血管夹</td><td>S&amp;T AG</td><td>462</td><td></td></tr><tr><td>小鼠血管导管</td><td>Verutech</td><td>100828</td><td></td></tr></tbody></table>

利用玻璃微移液管局部喷射atp，通过活体三维双光子显微镜研究传导性血管反应

In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

维持正常的大脑功能需要复杂血管网络提供充足且高效的氧气和营养供应。然而，脑血流（CBF）的调控机制尚未被完全阐明，尤其是在毛细血管水平。双光子显微镜是一种强大的工具，被广泛用于研究脑血流及其调控。目前，该领域受到以下三方面体内双光子显微成像研究缺乏的限制：（1）三维空间中的脑血流反应；（2）传导性血管反应；（3）血管网络内的局部干预。本文中，我们描述了一种利用双光子显微镜在体内研究由玻璃微移液管局部喷射ATP所引发的传导性血管反应的三维方法。&#160;该方法采用快速、重复的高维堆栈双光子成像，通过对获取图像进行最大强度投影，实现血管直径的精确测量。此外，我们还证明该方法也可用于研究三维星形胶质细胞的钙反应。我们同时讨论了玻璃微移液管插入以及双光子高维堆栈成像的优势与局限性。

手术完成后，将小鼠转移至双光子显微镜下（图1A）。将一根含有1 mM ATP的玻璃微移液管插入目标位置的目标血管附近（图1B）。
我们进行了超分辨率成像，同时给予1 mM ATP的喷 puff图2A, 补充视频 1）。每个图像堆栈通过最大强度投影（maximal intensity projection）被压缩为单幅图像图2B). 将矩形感兴趣区域（ROI）垂直置于血管上，以测量ATP喷 puff 后血管直径的变化图2C）。使用Chan-Vese分割法测量血管直径（<strong cla...

我们介绍了一种优化的局部喷射方法，该方法结合玻璃微移液管和快速双光子超堆栈成像技术，可精确测量毛细血管直径的变化，并在三维空间中研究其调控机制。

利用玻璃微移液管局部喷射ATP，通过活体三维双光子显微镜研究传导性血管反应

维持正常的大脑功能需要通过复杂的血管网络为脑组织提供充足且高效的氧气和营养供应。然而，……

本方案旨在研究通过局部喷射ATP引发的脑毛细血管中缓慢传导的血管反应。该技术的优势在于可通过局部移液管喷射模拟局部突触活动，并利用三维双光子显微镜使细小血管始终保持在焦平面内。该方法还可用于在三维条件下研究静息状态及刺激下的脑神经瘤和胶质细胞活动。演示该实验操作的将是Michael L

in-vivo-three-dimensional-two-photon-microscopy-to-study-conducted

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

在 Vivo 三维双光子显微镜中,利用玻璃微移器研究本地 ATP 喷射的血管反应

为了理解新皮层中微环路的网络动态，必须同时记录大量神经元的活动。在体双光子钙成像技术是目前唯一能够以单细胞分辨率记录密集神经元群体活动的方法。...

活体小鼠第2/3层双光子钙成像

采用活体显微技术追踪软脑膜微循环中血流动力学和炎症事件的时间与空间变化。...

使用封闭式颅窗对小鼠脑微循环进行活体显微成像

微离子电渗法是指在微移液管内外电势差的作用下，离子从微移液管中移动的过程。生物活性分子由此以与电流成正比的方式递送。我们通过乙酰胆碱微离子电渗法结合微操作技术，来研究微循环中内皮依赖性血管舒张作用。...

微离子电渗与显微操作用于活体微循环荧光成像

本文介绍了一种分析肿瘤微血管的方法 体内...

体内 肿瘤血管生成的荧光共聚焦视频显微成像

血管细胞功能依赖于细胞内信使的活性。本文描述了一种 离体 一种双光子成像方法，可用于检测离体主动脉中单个内皮细胞和血管平滑肌细胞在生理及药理刺激下细胞内钙离子和一氧化氮水平的变化。...

离体大鼠主动脉内皮细胞和平滑肌细胞中细胞内Ca2+调控与一氧化氮生成的双光子成像

将原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在微流控网络装置中培养至融合状态。展示了内皮细胞连接和F-肌动蛋白的分布，并在单细胞水平实时定量了对三磷酸腺苷（ATP）刺激响应的细胞内钙离子浓度变化和一氧化氮生成情况。...

发育与表征 体外 微血管网络及内皮细胞[Ca2+]i 和一氧化氮的产生

本方案描述了利用多光子显微镜对多细胞相互作用进行长时间实时延时成像的方法。 体内...

延长时程活体成像技术用于实时观察肿瘤微环境中多细胞动态变化

本方案描述了表达细胞特异性荧光标记的转基因小鼠的活体成像。活体成像提供了一种非侵入性方法，可通过植入式窗口对活体动物进行高分辨率观察，从而实现对生物学过程的显微可视化。该方法特别适用于研究纵向动态过程。...

利用转基因荧光小鼠和改良型背部皮肤折叠窗腔进行肿瘤相关血管的活体显微成像

小胶质细胞是大脑中的常驻免疫细胞，能够迅速响应其环境变化并发生形态学改变。本方案描述了如何利用双光子显微镜研究小鼠急性脑切片中小胶质细胞突起向血清素或三磷酸腺苷（ATP）的趋化反应。...

双光子成像技术观察急性脑切片中小胶质细胞突起对ATP或5-羟色胺的趋化反应

白细胞和血小板的募集是动脉生成过程中侧支动脉有效生长所必需的关键组成部分。多光子显微镜是一种能够以高时空分辨率追踪细胞动态的高效工具。 体内...

多光子活体成像监测小鼠后肢模型中动脉生成过程中的白细胞募集

本方案详细描述了一种优化的慢性颅窗结合微血管栓塞小鼠模型的逐步操作方法，适用于 体内 使用荧光聚苯乙烯微球进行双光子显微成像。...

用于微血管栓塞的小鼠模型 体内 使用荧光聚苯乙烯微球的双光子显微镜技术

探索利用玻璃微移器进行局部ATP喷射并结合三维双光子显微镜成像，研究脑毛细血管血管反应的新方法。该技术可精确测量毛细血管直径变化，模拟局部突触活动，为神经血管相互作用和胶质细胞功能研究提供重要工具。

利用玻璃微移液管局部喷射ATP，通过活体三维双光子显微镜研究传导性血管反应

探索更多视频