Een Orthothematisch endometriumkanker model met Retroperitoneale lymfadenopathie gemaakt van in vivo gepropageerd en gekweekte VX2 cellen

Dit VX2 endometrium kankermodel met retroperitoneale lymfekliermetastase kan worden gebruikt om technologie te bestuderen voor beeldgeleide chirurgie. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het betrouwbaar, eenvoudig is, en dat het consistente uitgezaaide verspreiding creëert, die het patroon van menselijke endometriumkanker nabootst. Over het algemeen is dit een eenvoudige techniek.

Echter, het beoefenen van de hechting voorafgaand aan een poging om het model te maken zal helpen om het proces gemakkelijker te maken. Visuele demonstratie van deze techniek is belangrijk, omdat het helpt om de chirurgische stappen die betrokken zijn bij modelinrichting aan te tonen. Het aantonen van de procedure met Harley Chan en ik zal Lili Ding zijn, een technicus van ons laboratorium.

Om in vitro-gepropageerde VX2-cellen voor te bereiden op injectie, begin met het opwarmen van bevroren flacons van VX2-cellen in een 37 graden Celsius-kraal of waterbad gedurende een minuut. Wanneer de cellen ontdooid zijn, trek de cel suspensies in een 15-milliliter buis met 10 milliliter cultuurmedium. Sediment de cellen door centrifugatie.

Resuspend de pellet in negen milliliter van medium. Breng de cellen over naar een grote kweekkolf voor incubatie bij 37 graden Celsius zonder te schudden, waardoor de cellen dagelijks worden gecontroleerd op samenvloeiing door lichtmicroscopie. Wanneer de cellen 80% samenvloeiing hebben bereikt, voeg drie milliliter van 0,2% trypsine toe aan de kolf en breng de cellen gedurende vijf minuten terug naar de celkweek incubator.

Wanneer de cellen zijn losgemaakt, breng de celsuspensie naar een conische buis om de cellen te verzamelen door middel van centrifugatie. Was de celpellet drie keer met negen milliliter verse PBS per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, resuspend de cellen in verse PBS voor het tellen alvorens te verdunnen tot een vier keer 10 tot de zeven VX2 cellen per milliliter van PBS concentratie in een nieuwe conische buis op ijs.

Om in vivo-gepropageerde VX2 cellen voor injectie voor te bereiden, ontdooi bevroren één voor één-centimeter VX2 tumorblokken en gebruik een scalpel om de weefselsteekproeven in een cultuurplaat te hakken. Breng de weefselfragmenten over naar een filter van 70 micrometer en voeg kleine aliquots toe van maximaal een milliliter van Hanks gebalanceerde zoutoplossing, of HBSS, om ervoor te zorgen dat alle cellen door de zeef worden doorgegeven. Tel vervolgens de cellen voordat u de celsuspensie verdunt tot één keer 10 tot de zeven VX2-cellen per milliliter HBSS-concentratie in een steriele buis op ijs.

Na het bevestigen van een gebrek aan reactie op stimulus, plaats het verdoofde vrouwelijke witte konijn van Nieuw Zeeland in de dorsale positie op de werkende lijst. Clip het haar over het bekken en de buik, en gebruik een drie stappen chirurgische huid prep om de blootgestelde huid schoon te maken. Het dragen van een chirurgische pet en gezichtsmasker, schrobben de handen met ontsmettingsmiddel voor het aantrekken van een steriele jurk en steriele chirurgische handschoenen.

Landmark de bovenkant van de schaambeen en draperen het chirurgische veld met laparotomie gordijnen, waardoor een vijf bij vijf centimeter gebied van de onderbuik blootgesteld. Gebruik vervolgens een nummer 11 scalpelblad om een incisie van 2,5 centimeter een centimeter craniaal te maken naar de symphysis-pubis door middel van huid en onderhuids weefsel. Snij de rectus fascia en ontleden de rectusspieren lateraal om het onderliggende buikvlies bloot te leggen.

Bevestig dat de onderoppervlak vrij is van darm- of andere buikorganen. Voer scherp het buikvlies in om de urineblaas te identificeren en veeg een gehandschoende vinger superieur, posteriorly, en lateraal over de top van de blaas om de baarmoederhoorns te lokaliseren. Haal de baarmoederhoorns door de buikincisie om op de buikwand te rusten.

Gebruik een 3-0 gevlochten absorbeerbare hechting om een enkele hechting ligatie van elke baarmoeder hoorn uit te voeren, ongeveer 1,5 tot twee centimeter distaal aan de cervices en gewoon mediaal aan de baarmoeder slagaders. Bind vervolgens de hechtingen stevig vast om de distale baarmoederhoorns op te nemen. Om het myometrium in te enten met de eerder voorbereide VX2-celoping, laadt u een spuit van één milliliter uitgerust met een naald van 27 meter met één milliliter cellen.

Injecteer langzaam 0,5 milliliter van de celsuspensie gedurende een minuut in elke baarmoederhoorn proximale naar de hechtplaats tussen de hechting en de baarmoederhals. Breng vervolgens gedurende 30 seconden druk uit op de myometrial injectieplaats om cellekkage te minimaliseren. Inspecteer de injectie- en hechtingsplaatsen op hemostase voordat u de baarmoederhoorns terug in de buik plaatst.

Voor diepe buikwandsluiting, identificeer de top van de buikvliesincisie en gebruik een chirurgische klem om de buikvlies rectusspier en fascia te grijpen. Veranker de hechting door het plaatsen van een 3-0 opneembare polyfilament hechting, oppervlakkig tot diep op de ene top van de incisie, en diep te oppervlakkig op de andere. Met behulp van de bijgevoegde hechting, maak lopende steken loodrecht op de incisie door de lagen van de buikwand, werken stap-wijs langs de incisie van links naar rechts voor het binden van de hechting en het snijden van de losse eindjes.

Voor oppervlakkige buikwandsluiting, gebruik maken van een begraven lopen subcuticulaire 3-0 opneembare polyfilament hechting te hechten diep tot oppervlakkig aan de ene kant van de incisie en oppervlakkig te diep op de andere. Na het knopen van de hechtingen, gebruik maken van de verankerde hechtingen om lopende steken in de huidlaag parallel aan de incisie te maken, werken stap-wijs langs de incisie van links naar rechts. Bind de hechtingen en verwijder de losse eindjes.

Breng chirurgische lijm aan op de gesloten incisie om de huidranden te besmlijmen. Plaats het dier vervolgens op een warme deken met zuurstof en monitoring, totdat het dier alert is en zelfstandig kan zitten. Bij de vaststelling van dit model was een dosis van twee keer 10 tot de zeven cellen per baarmoederhoorn succesvol bij vier konijnen, in een gemiddelde tijd van 45 dagen van inenting tot experiment en werd dus bepaald als de optimale injectiedosis voor het gekweekte VX2-model.

Voor het in vivo gepropageerde VX2-model, dat met succes werd gemaakt bij 16 konijnen met een gemiddelde tijd van inenting tot experiment van 29 dagen, werd vijf keer 10 tot de zes cellen per baarmoederhoorn bepaald als de optimale injectiedosis. Alle modellen resulteerden in een succesvolle gemetastasieke transformatie van de retroperitoneale lymfeklieren. Verder, tumoren en gemetastaseerde lymfeklieren uit gekweekte VX2 cellen leek vergelijkbaar met tumoren uit in vivo-gepropageerde VX2 cellen door histologische analyse, met densymetoxolin-gekleurde cellen waargenomen in de binnenvallende spier en het vormen van klierachtige structuren met vele pathologische mytotische figuren.

Plaats uw hechting mediaal aan de baarmoederslagader om te voorkomen dat bloeden uit een vat punctie en zorg ervoor dat de cellen te infiltreren in het myometrium en niet de endometriumholte. Zorg ervoor dat u tijdens de modelcreatie de juiste steriele techniek gebruikt om postoperatieve infectie te voorkomen en uzelf tijdens de operatie te beschermen met het bariummateriaal.