Name: 바깥쪽을 바라보며: 시안박테리아 방출 탄수화물 고분자 및 단백질 의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 배우세요 시안박테리아에서 방출된 탄수화물 고분자와 단백질을 분리하는 방법을. 이 프로토콜은 생명공학 및 의학적 응용을 위한 고순도 샘플을 제공하며 다른 박테리아에도 적용 가능합니다.

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이 작품은 FUNdo Europeu de Desenvolvimento 지역 (FEDER) 기금을 통해 COMPETE 2020 - 경쟁력 및 국제화를위한 오페라 프로그램 (POCI), 포르투갈 2020, FCT를 통해 포르투갈 어 펀드에 의해 지원되었습니다 - Fundação para a Ciência e Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino 슈페리어 프로젝트 POCI-01-0145-FEDER-028779 및 보조금 SFRH/BD/99715/2014(CF).

1. 시아노박테리아 방출 탄수화물 폴리머 분리
<ol><li>
폴리머 분리 및 오염 물질 제거
	<ol>
<li>표준 조건하에서 시아노박테리아 균주를 배양[예를 들어, 12h 빛 하에서 30°C(50 μEm-2s-1)/12h 암흑 요법, 150 rpm에서 궤도 흔들림]. 표준 프로토콜을 이용한 성장을 측정[예를 들어, 730 nm(OD730nm)에서의광학 밀도), 엽록소 a,건식 중량 등], 페놀-황산 방법에 따라 방출된 다당류의 생산을 측정한다 16.</li>
		<li>배양을 투석 막(분자량 컷오프의 12-14 kDa)으로 옮기고 연속 교반을 통해 24시간 동안 최소 10부량의 탈이온수에 대해 투석을 합니다. 참고 : 투석 및 중간 조성물에 대한 배양량에 따라 투석 수를 변경해야 할 수도 있습니다.</li>
		<li>4°C에서 15분 동안 15,000 x g에서 배양한다. 상급체를 새로운 바이알로 옮기고 펠릿(세포)을 버린다.</li>
		<li>다시 20,000 x g에서 4°C에서 15분 동안 원심분리를 하여 세포벽 파편 또는 리포폴리당류(LPS)와 같은 오염물질을 제거한다.</li>
		<li>상급자를 유리 비커로 옮기고 펠릿을 버립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
중합체의 침전
	<ol>
<li>상급체에 96% 에탄올 2부 볼륨을 추가합니다.</li>
		<li>적어도 하룻밤 동안 4°C에서 현탁액을 배양한다.</li>
		<li>폴리머 회수<ol>
<li>침전 된 폴리머의 작거나 눈에 보이지 않는 양의 경우 : 4 °C에서 25 분 동안 13,000 x g에서 현탁액을 원심 분리합니다. 상급물을 버리고 1 mL 또는 2 mL의 오토 클레이브 탈이온수에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 수성 현탁액을 바이알로 옮김. 주의: 상급제는 쉽게 다시 일시 중단 될 수 있으므로 부드럽게 버려야합니다.</li>
			<li>가시적/다량의 침전된 폴리머의 경우: 멸균 금속 집게가 있는 침전된 폴리머를 바이알에 수집합니다. 중합체를 짜내고 여분의 에탄올을 버립니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>선택 사항: 필요한 중합체 정제 정도에 따라, 탈이온수에서 폴리머를 재증탁한 후 96% 에탄올로 침전 단계를 반복한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
중합체의 부호 애용
	<ol>
<li>침전된 폴리머를 가진 바이알을 -80°C, 적어도 하룻밤 사이에 유지한다.</li>
		<li>적어도 48 시간 동안 폴리머를 동결 건조 (lyophilize)(동결 건조 전에 현탁액을 해동시키지 마십시오).</li>
		<li>건조된 폴리머를 실온(RT)에 보관하여 추가 로 사용하십시오. 참고: 시간이 지남에 따라 물을 흡수할 수 있으므로 폴리머를 건조기에 보관하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 시아노박테리아 엑소프로테오메 분리
<ol><li>
중간 농도
	<ol>
<li>표준 조건하에서 시아노박테리아를 배양[예를 들어, 12시간 빛 하에서 30°C(50 μEm-2s-1)/12h 암흑 요법, 150 rpm에서 궤도 흔들림]. 표준 절차 (예 : OD730nm,엽록소 a, 건조 중량 등)를 사용하여 시아노박테리움 성장을 모니터링하십시오.</li>
		<li>RT에서 10 분 동안 4,000 x g의 배양액을 원심 분리합니다.</li>
		<li>상급자를 플라스크에 옮기고 세포 펠릿을 버립니다.</li>
		<li>0.2 μm 기공 크기 필터를 통해 디캔트 된 배지를 필터링합니다. 참고: 배지가 4°C로 유지되는 경우, 프로토콜은 짧은 기간 동안 여기서 일시 중지될 수 있다.</li>
		<li>3 kDa의 명목 분자량 차단을 가진 원심 농축기를 사용하여 약 500x (여과 된 매체의 초기 부피를 고려)에 매체를 집중시다. 원심분리는 15 °C에서 4,000 x g (최대 1 시간 의 원심 분리 라운드)에서 작동해야합니다. 주의: 대부분의 농축기 브랜드의 경우, 필터 장치는 사용하기 전에 초순수로 원심분리하여 헹구어야 합니다. 필터가 젖으면 건조시키지 마십시오. 장치를 사용하지 않을 때는 저장소에 충분한 액체를 두십시오. 참고: 원심분리 온도를 4°C로 낮추면 단백질 활성을 연구하는 것이 도움이 될 수 있지만, 샘플 농도에 필요한 시간이 늘어납니다. 이 프로토콜은 배지가 4°C에서 유지되는 경우 짧은 기간 동안 원심분리 단계 사이에서 일시 중지될 수 있다.</li>
		<li>농축 된 샘플로 필터 장치 샘플 저장소의 벽을 헹구고 내용물기를 미세 원심 분리튜브로 옮김을 옮김.</li>
		<li>필터 장치 샘플 저장소의 추가 세척 단계를 오토클레이브 배양 배지로 수행하여 최대 외아 체회수를 보장합니다. 참고: 복구 비율을 정량화하려면 특정 제조업체의 지침을 따르십시오.</li>
		<li>외프로테오메 샘플을 추가 사용 전까지 -20°C에서 보관하십시오. 참고 : 장기간 보관에는 프로테아제 억제제첨가가 권장됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
외시 분석
	<ol>
<li>제조업체의 지침에 따라 96웰 플레이트에서 BCA 단백질 분석법으로 단백질 함량을 정량화합니다.</li>
		<li>나트륨 도데실 황산염-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)에 의해 단백질을 분리하고, 표준 염색 프로토콜(예를 들어, 쿠마시 블루, 은 염색)을 사용한다.</li>
		<li>관심있는 밴드 / 젤 영역을 잘라 초순수의 적절한 볼륨을 포함하는 다른 미세 원심 분리튜브에서 수집합니다.</li>
		<li>질량 분석법에 의한 단백질의 식별 및 분석을 진행합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pereira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexity+of+cyanobacterial+exopolysaccharides%3A+composition%2C+structures%2C+inducing+factors+and+putative+genes+involved+in+their+biosynthesis+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly.</a> FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).</li>
<li>Kanekiyo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+an+Antiviral+Polysaccharide%2C+Nostoflan%2C+from+a+Terrestrial+Cyanobacterium%2C+Nostoc+flagelliforme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Natural+Products%22%5BJournal%5D)">Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme.</a> Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).</li>
<li>Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+human+adaptive+immune+responses+by+administration+of+a+high-molecular-weight+polysaccharide+extract+from+the+cyanobacterium+Arthrospira+platensis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Food%22%5BJournal%5D)">Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis.</a> Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).</li>
<li>Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+polysaccharides+from+cyanobacteria+Nostoc+commune+and+their+antioxidant+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Polymers%22%5BJournal%5D)">Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities.</a> Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).</li>
<li>Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+removal+of+cyanobacterial+exopolysaccharides+by+uronic+acid+content+and+monosaccharide+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Polymers%22%5BJournal%5D)">Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition.</a> Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).</li>
<li>Han, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulsifying%2C+flocculating%2C+and+physicochemical+properties+of+exopolysaccharide+produced+by+cyanobacterium+Nostoc+flagelliforme%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).</li>
<li>Leite, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacterium%E2%80%90Derived+Extracellular+Carbohydrate+Polymer+for+the+Controlled+Delivery+of+Functional+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins.</a> Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206(2017).</li>
<li>Estevinho, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+cyanobacterial+extracellular+polymeric+substance+in+the+microencapsulation+of+vitamin+B12%5BTitle%5D)+AND+%22Powder+Technology%22%5BJournal%5D)">Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12.</a> Powder Technology. 343, 644-651 (2019).</li>
<li>Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+polymeric+substances+%28EPS%29+from+cyanobacterial+mats%3A+characterisation+and+isolation+method+optimisation%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation.</a> Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).</li>
<li>Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+extraction+and+characterization+of+microalgal+and+cyanobacterial+exopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides.</a> Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).</li>
<li>Costa, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+systems+in+gram-negative+bacteria%3A+structural+and+mechanistic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).</li>
<li>Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicle+biogenesis%3A+a+new+mechanism+and+its+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications.</a> Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).</li>
<li>Sergeyenko, T. V., Los, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+secreted+proteins+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).</li>
<li>Oliveira, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatile+TolC-like+Slr1270+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).</li>
<li>Flores, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alternative+sigma+factor+SigF+is+a+key+player+in+the+control+of+secretion+mechanisms+in+Synechocystis+sp.+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).</li>
<li>Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).</li>
<li>Parikh, A., Madamwar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+characterization+of+extracellular+polysaccharides+from+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria.</a> Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).</li>
<li>Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+identify+the+unexplored+diversity+of+microbial+exopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 565(2015).</li>
<li>Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPathak%2C+J+%22Marine+Glycobiology%22">Marine Glycobiology</a>. , CRC Press. 343-358 (2016).</li>
<li>Nguyen, A. T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performances+of+different+protocols+for+exocellular+polysaccharides+extraction+from+milk+acid+gels%3A+Application+to+yogurt%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt.</a> Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).</li>
<li>Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+recovery+procedures+on+structural+and+rheological+properties+of+schizophyllan+produced+from+date+syrup%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).</li>
<li>Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+profiles+of+outer+membrane+vesicles+and+extracellular+matrix+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

세균 분비 메커니즘을 더 잘 이해하고 방출된 제품을 연구하기 위해 세포외 세균 환경에 존재하는 생체 분자의 효율적인 격리 및 분석을 입증하는 것이 매우 중요합니다(예: 방출됨) 탄수화물 중합체 및 단백질).
시아노박테리아 세포외 탄수화물 중합체는 그들의 조성물을 구성하는 상이한 단당류의 수및 비율로 인해 극도로 복잡하다 1. 이러한 고분자 물질의 분리에 사용되는 기존의 방법은 이러한 설탕이 풍부한 물질이 수용성 용액에 용해되고 유기 용매 (예 : 아세톤 또는 에탄올)의 첨가에 의해 침전 될 수 있다는 단순한 개념에의존9 ,17,18. 이는 폴리머의 수화 쉘에서 물 분자를 추출하기 때문에 발생하며, 공정의 효율은 본질적으로 폴리머의 분자량(더 높은 분자량 분획에서 보다 효...

시아노박테리아는 유망한 생명공학/생명의학 응용 분야와 함께 천연 제품의 다산 공급원으로 널리 인정받고 있습니다. 따라서, 시아노박테리아 분비 메커니즘을 이해하고 추출/회수 방법의 최적화는 효율적인 미생물 세포 공장으로서 시아노박테리아를 구현하는 데 필수적입니다.
많은 시아노박테리아 균주는 주로 이종대당에 의해 형성된 세포외 고분자 물질(EPS)을 생성할 수 있으며, 이는세포 표면과 연관되거나 배지 1로 방출된다. 이 방출된 탄수화물 중합체는 다른 박테리아에서 그들에 비해 명백한 특징을 가지고 있습니다, 이는 응용의넓은 범위에 적합하게 (예를 들어, 항 바이러스 2, 면역 자극3,항산화44) 금속 킬레이트5, 유화6, 약물 전달 제7,8). 이들 중합체의 분리를 위한 방법론은 크게 수율 향상뿐만 아니라 수득된 폴리머의 증가된 순도 및 특이적 물성에기여한다. 중합체의 분리를 위한 이들 방법의 대부분은 중합체의 강한 음이온 성질9,10으로인해 쉽게 달성되는 배양 배지로부터의 침전 전략에 의존한다. 또한, 침전 단계에서 사용되는 용매의 제거는 증발 및/또는 호혜화에 의해 급속히 달성될 수 있다. 예측 된 응용 프로그램에 따라, 다른 단계는 트리클로로 아세트산 (TCA) 처리, 여과, 또는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 포함하는 최종 제품을 맞추기 위해 중합체 침전 후 또는 전에 결합 될 수있다 열 정제10.
시아노박테리아는 또한 막 수송기(classical)(11) 또는 소포(non-classical)에 의해 매개되는 경로를 통해 광범위한단백질을 분비할 수 있다(12). 따라서, 시아노박테리아 엑소테오솜의 분석은 시아노박테리아 단백질 분비 메커니즘을 이해하고 조작하고 이들 단백질의 특정 세포외 기능을 이해하는 데 필수적인 도구를 구성한다. 탈전의 신뢰할 수있는 격리 및 분석은 분비 된 단백질의 풍부가 상대적으로 낮기 때문에 세포 외 밀리외의 농도를 필요로합니다. 또한, 다른 물리적 또는 화학적 단계(예를 들어, 원심분리, 여과 또는 단백질 침전)는 얻어진 엑소테오므의 품질을 최적화할수 있고, 단백질 함량을 풍부하게 하고, 오염물질의 존재를 피할 수 있다(예를 들어, 안료, 탄수화물 등) 14세 , 샘플에서 세포내 단백질의 우위 또는 15. 그러나, 몇몇은의 이 단계는 또한 편향된 분석으로 이끌어 내는 검출될 수 있는 단백질의 세트를 제한할 수 있습니다.
이 작품은 시안박테리아 배양 배지로부터 방출된 탄수화물 중합체 및 엑소프로테옴의 분리를 위한 효율적인 프로토콜을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 여기에 제시된 기본 단계를 유지하면서 연구의 특정 목표및 사용자 요구에 쉽게 적응할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>투석 멤브레인</td><td>Medicell Membranes Ltd&nbsp;</td><td>DTV.12000.07</td><td>Visking 튜빙 크기 7, 지름 23.8 mm, 너비 39-41 mm 30m 롤&nbsp;</td></tr><tr><td>에탄올 96%</td><td>AGA - &급성; lcool e G&eacute; neros Alimentares, S.A.</td><td>4.000.02.02.00</td><td>발효 에틸 알코올 96 % AGA</td></tr><tr><td>PES 필터 0.2 &mu; m</td><td>Fisher Scientific, Lda</td><td>15206869</td><td>주사기 필터 폴리스티렌 33MM 0.2&마이크로; M 스트렝&nbsp;</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, Ultracel-3K</td><td>Merck Millipore Ltd.</td><td>UFC900324</td><td>3 kDa 공칭 분자량 컷오프를 가진 원심 필터</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; Pierce BCA 단백질 분석</td><td>Fisher Scientific, Lda</td><td>10741395</td><td>Green-to-blue, 정밀한, 세제 호환 분석 시약으로 총 단백질 농도를 측정합니다</td></tr>. <tr><td>Brillant Blue G 콜로이드 농축액&nbsp;</td><td>시그마 알드리치 Qu&iacute; 운모 SL</td><td>B2025-1EA</td><td>쿠마시 블루&nbsp;</td></tr></tbody></table>

바깥쪽을 바라보며: 시안박테리아 방출 탄수화물 고분자 및 단백질 의 분리

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

시아노박테리아는 이종대당및단백질과같은세포외환경으로광범위한생체분자를능으로분비할수있습니다. 이 생체 분자의 확인 및 특성화는 그들의 분비 경로에 대한 지식을 향상시키고 그(것)들을 조작하는 것을 도울 수 있습니다. 또한, 이러한 생체 분자 중 일부는 생명 공학 응용 분야에서도 흥미롭습니다. 여기서 설명된 것은 시안박테리아 방출 탄수화물 중합체 및 단백질의 쉽고 신속한 분리를 위한 두 가지 프로토콜이다. 방출된 탄수화물 중합체의 분리 방법은 유기 용매를 사용하는 수성 용액에서 다당류의 기존 침전 기술을 기반으로합니다. 이 방법은 중합체의 특성을 보존하고 동시에 세포 파편 및 배양 배지에서 오염 물질의 존재를 방지한다. 공정의 끝에서, 용약화된 중합체는 최종 의도된 용도에 따라 사용 되거나 특성화될 준비가 되거나 추가의 정제를 실시할 수 있다. 시아노박테리아 엑소프로테오메의 분리에 관해서는, 이 기술은 원심분리 및 여과에 의한 주요 오염물질을 제거한 후 무세포 배지의 농도에 기초한다. 이 전략은 막 수송기 또는 외부 막 소포를 통해 세포외 milieu에 도달하는 단백질의 믿을 수 있는 격리를 허용합니다. 이 단백질은 표준 질량 분석 기술을 사용하여 이후에 확인될 수 있습니다. 여기에 제시 된 프로토콜은 광범위한 시아노 박테리아뿐만 아니라 다른 박테리아 균주에도 적용 될 수 있습니다. 더욱이, 이러한 절차는 제품의 최종 사용, 필요한 순도 및 세균 균주에 따라 용이하게 맞춤화될 수 있다.

시아노박테리아 배양물로부터 방출된 탄수화물 중합체를 추출하기 위해 기술된 방법의 개략적 표현은 도1에 도시되어 있다. 적당한 EPS 생산자시아노박테리움 시네시스ss. PCC 6803 및 효율적인 EPS 생산자 시아노테스 sp. CCY 0110으로부터의 침전된 중합체는 도2에 도시되어 있다. 그림3에서는 다른 오염 도를 가진 동색화된 폴리머가 도시되어 최종 제품 순도에 대한 원심분리 단계의 중요성을 강조합니다. 도 4는 시아노박테리아 외각에 대한 격리 방법을 도시한다. 뚜렷한 무세포 배지 농축 샘플(즉, 상이한 성장 단계의 배양물및 낮은 카로티노이드 생산을 가진 시아노박테리아 균주로부터 수득됨)은 도5에 나타내었다. 두 개의 형태학적으...

여기서, 시안박테리아 방출 된 탄수화물 중합체의 분리 및 그들의 엑소프로테옴의 격리에 대한 프로토콜이 설명된다. 두 절차 모두 추가 분석 또는 응용 분야에 사용할 수 있는 고순도의 중합체 또는 단백질을 얻기 위한 주요 단계를 구현합니다. 또한 특정 사용자 요구에 따라 쉽게 조정할 수 있습니다.

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

우리가 개발한 이 프로토콜은 시아노박테리아와 그들의 방출된 제품, 즉 세포외 탄수화물 폴리머 및 단백질에 있는 분비 기계장치를 공부하는 것이 중요합니다. 생성 된 지식은 우리가 여러 응용 프로그램에 대한 이러한 제품을 사용자 정의 할 수 있습니다, 즉 생명 공학 및 생물 의학 응용 프로그램. 이러한 프로토콜은 매우 간단합니다.그들은 생산 유기체, 사용자의 요구 및 제품의 최종 응용 프로그램에 따라 조정할 수 있습니다. 이러한 프로토콜의 주요 장점은 다른 살아있는 시스템, 특히 다른 박테리아에 쉽게 적응할 수 있다는 것입니다. 이러한 프로토콜은 쉽습니다.그러나, 하나는 세균성 긴장 또는 요구되는 순도의 정도에 따라 몇몇 변경을 소개할 필요가 있을 수 있습니다. 시작하려면 표준 조건에서 치아노균 균주를 재배하십시오. 표준 프로토콜을 사용하여 성장을 측정합니다.다음으로, 투석막으로 문화를 옮기고, 연속 교반으로 24시간 동안 최소 10권의 탈온수에 투석한다. 원심 분리는 15 분 동안 섭씨 4도에서 15, 000 배 g에서 문화를 원심 분리합니다. 상체를 새로운 바이알로 옮기고 펠릿을 버립니다.원심분리기는 15분 동안 섭씨 4도에서 20, 000배 g에서 다시 20g, 세포벽 파편 또는 리포폴리사카라이드와 같은 오염물질을 제거합니다. 원심 분리 후, 상체를 유리 비커로 옮기고 펠릿을 버린다. 중합체를 침전시키기 위해, 상체에 96%에탄올의 두 부피를 추가하고, 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 서스펜션을 배양한다.작거나 눈에 보이지 않는 양의 침전 된 폴리머의 경우, 25 분 동안 섭씨 4도에서 13, 000 배 에서 서스펜션을 원심 분리합니다. 상체를 부드럽게 버리고, 오토클레이브 디온화 된 물의 1 ~ 2 밀리리터에 펠릿을 다시 놓습니다. 수성 서스펜션을 바이알로 옮기는다.눈에 띄는 다량의 침전 된 폴리머의 경우 멸균 금속 집게를 가진 침전 된 폴리머를 유리병에 수집합니다. 중합체를 짜내고 과도한 에탄올을 버린다. 동결 건조라고도 하는 리오필화 공정을 수행하려면, 하룻밤 사이에 침전된 폴리머로 바이알을 영하 80도에서 유지한다.적어도 48 시간 동안 중합체를 lyophilize. 그런 다음, 건조 된 폴리머를 실온에서 추가 사용까지 저장합니다. 매체를 농축하려면 먼저 표준 조건하에서 시아노박테리아를 재배합니다.표준 절차를 사용하여 시아노박테리움의 성장을 모니터링합니다. 그런 다음, 원심 분리는 10 분 동안 실온에서 4, 000 배 g에서 배양합니다. 상체를 플라스크로 옮기고 셀 펠릿을 폐기합니다.다음으로, 0.2미크론 모공 크기 필터를 통해 탈란된 매체를 필터링한다. 배지를 약 500회 농축하려면 원심 4, 000배, 섭씨 15도까지 3킬로달톤의 명목 분자량 컷오프가 있는 원심 농축기를 최대 1시간 원심 분리 라운드에 사용하십시오. 원심분리 후, 필터 장치 샘플 저장소의 벽을 농축 된 샘플로 헹구고 마이크로 원심 분리기 튜브로 함량을 전달합니다.최대 외프로테아메 회수를 보장하기 위해 오토클레이브 배양 배지를 사용하여 필터 장치 샘플 저장소의 추가 세척 단계를 수행한다. 그런 다음 외음항샘플을 영하 20도에서 추가 사용까지 저장합니다. 에탄올은 중합체 강수량과 수율을 최적화하기 위해 적극적으로 첨가되어야 합니다.침전된 중합체를 원심분리한 후, 플라스크 벽에 느슨하게 부착될 수 있는 펠릿의 재발을 피하기 위해 상체부의 폐기를 신중하게 해야 한다. 수동 여과가 수행되면 필터 멤브레인을 깨는 것을 피하기 위해 부드럽게해야합니다. 일부 침전 된 폴리머는 시에코시스티스의 EPS의 경우와 같은 플라스크의 벽에 주로 원심 분리 후에만 볼 수 있습니다.다른 경우에는, 시아노시스 폴리머와 같은, 강수직후 유리 비커에 떠있는 폴리머 덩어리를 볼 수 있다. 일부 오염은 폴리머 색소 침착, 일반적으로 흰색 또는 밝은 갈색을 변화시킬 것이기 때문에 폴리머 lyophilization 후에 매크로로 쉽게 검출될 수 있다. 주황색 폴리머는 카로티노이드 또는 이러한 안료를 포함하는 구조로 오염됩니다.예를 들어, 녹색 폴리머는 세포 파편과 엽록소로 오염됩니다. 외프로테옴은 세균균에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 단세포 시아노박테리움과 필라멘트 균주에서 외프로테아메를 참조하십시오.외프로테오메 농축 시료에서 다당류의 양이 많음은 외음류 분석을 저해할 수 있다. 예를 들어, 단백질 분리를 지연시키고 덜 풍부한 단백질을 마스크할 수 있습니다. 사용자는 조성물, 물리적/화학적 특성, 시험 폴리머 생물학적 활성 또는 변형된 폴리머 성분의 관점에서 폴리머를 특성화할 수 있다.단백질 식별을 위해 젤 및 질량 분석에서 단백질의 분리를 수행 할 수 있습니다. 그리고 소포의 분리를 위해, 외막의 초원심분리가 수행되어야 한다. 우리 그룹에서, 이러한 프로토콜은 이미 생물학적 제제 또는 항종양 또는 약물 전달 제로서와 같은 다른 분야에서 세포외 탄수화물 폴리머의 시아노균 분비 메커니즘 또는 응용 프로그램을 해명하는 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

출처: Shivaiah, K., et al. 식물 잎 조직 및 시아노박테리아에서 Plastoglobule 지질 방울 분리. J. Vis. 경험. (2022년)비디오는 시아노박테리아에서 플라스토글로불을 분리하는 방법을 보여줍니다. 이는 시아노박테리아 배양으로 시작하여 기계적 힘을 사용하여 세포 파괴를 통해 진행됩니다. 광합성 색소의 방출은 성공적인 용해를 나타냅니다. 그런 다음 자당 단계 구배를 사용하여 밀도에 따라 세포 성분을 분리하여 저밀도 편성소구가 상단에 뚜렷한 밴드를 형성할 수 있도록 합니다. 이 분획은 추가 분석을 위해 수집 및 보존됩니다.

광합성 박테리아에서 Plastoglobules의 추출 및 정제

출처: Shivaiah, K., et al. 식물 잎 조직 및 시아노박테리아에서 Plastoglobule 지질 방울 분리. J. Vis. 경험. (2022).이 비디오는 자당 밀도 구배 원심분리를 사용하여 시아노박테리아에서 장소구를 분리하는 방법을 보여주며, 지질이 풍부하고 밀도가 낮은 특성을 강조하고 다운스트림 분석을 위한 구조적 보존을 보장합니다.

시아노박테리아 플라스토소블의 밀도 구배 정제

출처: Jiang, H., Ho, M. 시아노박테리아에서 온전한 피코빌리좀의 분리 및 특성화. J. Vis. Exp.(2021).이 비디오는 이산화탄소 공급과 영양이 풍부한 조건으로 지속적인 조명 하에서 세포를 성장시킨 다음 원심분리를 통해 수확하여 바이오매스를 얻기 위해 시아노박테리아를 배양하는 절차를 보여줍니다.

바이오매스 생산을 위한 시아노박테리아 배양 준비

여기, 시아 노 박테리아 세포에서 글리코겐 함량을 측정하기위한 신뢰할 수 있고 쉬운 분석법을 제시합니다. 이 과정은 침전, 선택 가능한 해중합 및 포도당 잔류 물의 검출을 수반한다. 이 방법은 야생형 및 유 전적으로 변형 된 균주 모두에 적합하며 시아 노 박테리아의 대사 공학을 촉진 할 수 있습니다.

시아 노 박테리아의 글리코겐 함량 측정

여기, 선물이 양적 phycobiliprotein cyanobacterium Synechocystis spectrophotometric 메서드를 사용 하 여에서 콘텐츠를 결정 하는 프로토콜. 추출 프로시저 또한 성공적으로 다른 박테리아 및 조류 긴장;에 적용 했다 그러나, 안료 흡수 스펙트럼에 있는 변이 때문 그것은 각 스트레인에 대 한 spectrophotometric 방정식을 개별적으로 테스트 하는 데 필요한입니다.

Spectrophotometric Cyanobacterium Synechocystis 에서 Phycobiliprotein 콘텐츠 결정

현재 프로토콜은 불연속 자당 밀도 그라데이션을 통해 원심분리에 의한 시아노박테리아로부터의 피코빌리좀의 분리를 자세히 설명합니다. 그대로 피코빌리좀의 분획은 77K 형광 스펙트럼 및 SDS-PAGE 분석에 의해 확인된다. 결과 물리경분획은 TEM 및 질량 분광법 분석의 음수 염색에 적합합니다.

시아노박테리아의 피코빌리좀의 격리 및 특성화

본 프로토콜은 시아노박테리아 배양물로부터의 세포밖 소포의 분리, 농도 및 특성화에 대한 상세한 설명을 제공한다. 서로 다른 규모의 문화에서 소포를 정화하기위한 접근법, 방법론 간의 절충점 및 현장 샘플 작업을위한 고려 사항도 논의됩니다.

시아 노 박테리아 세포 밖 소포의 분리 및 특성 분석

다양한 광합성 유기체와 관련된 플라스토글로불 지질 방울의 분리를 위한 빠르고 효율적인 프로토콜이 제시됩니다. 분리된 플라스토글로불의 성공적인 준비는 단백질체학 및 지질체 분석과 같은 상세한 분자 조사에 앞서 중요한 첫 번째 단계입니다.

Plastoglobule 지질 액적 분리 식물 잎 조직 및 시아노박테리아

우리는 XY 평면에서 필라멘트 시아노박테리아 시각화를 위한 간단하고 접근 가능한 방법을 제시합니다. 저융점 아가로스 매트릭스가 사용되어 수직 방향에서 분열에 관여하는 단백질의 이미지를 획득할 수 있었습니다. 따라서 이 방법론은 모든 필라멘트 유기체와 다양한 종류의 단백질에 적용할 수 있습니다.

필라멘트 시아노박테리아의 타임랩스 현미경 분석을 위한 수직 고정화 방법

여기에서는 시아노파지(및 그 숙주)를 분리하기 위해 해양 및 담수 생태계의 유쾌한 영역에서 샘플링하는 방법과 단일 유전자형을 풍부하게 하고 바이러스-숙주 상호 작용 역학을 특성화하는 사후 샘플링 프로세스에 대해 설명합니다.

광합성 미생물 및 바이러스의 환경 샘플링: 현장에서 실험실까지

배우세요 시안박테리아에서 방출된 탄수화물 고분자와 단백질을 분리하는 방법을. 이 프로토콜은 생명공학 및 의학적 응용을 위한 고순도 샘플을 제공하며 다른 박테리아에도 적용 가능합니다.

바깥쪽을 바라보며: 시안박테리아 방출 탄수화물 고분자 및 단백질 의 분리

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