在可变形基底上调控人胚胎干细胞集落几何形状以控制组织尺度力学特性

本方案使研究人员能够在水凝胶上培养干细胞集落，并完全控制水凝胶的刚度以及集落的几何形状。该技术的主要优势在于，它允许研究人员在比传统组织培养塑料更接近生理环境的条件下培养干细胞集落。首次执行本方案时，务必额外制备少量每种材料，并使用荧光配体，以便在每个步骤中进行故障排查和优化。

该技术包含多个步骤，涉及多种材料的精确定位。在观看过该实验操作后，理解本方案的书面说明会容易得多。开始此操作时，按10:1的质量比将PDMS基础剂与PDMS固化剂混合，并充分搅拌均匀。

将此混合物置于干燥器中脱气 30 至 60 分钟，或直至所有气泡完全消除。缓慢而均匀地将 PDMS 混合物倾倒至已准备好的晶圆表面。轻敲培养皿底部，使晶圆表面的气泡逸出。

将PDMS在70摄氏度下烘烤两小时，然后冷却至室温。接着将PDMS切成约10毫米×10毫米的正方形，每个正方形包含一个实验条件的特征结构。在本实验方案的其余部分中，这些正方形将被称为“stamp”。

此后，按八比一的重量比将PDMS基础剂与PDMS固化剂混合，并充分搅拌均匀。将混合物置于真空干燥器中脱气30至60分钟，直至所有气泡完全去除。接着，缓慢而均匀地将PDMS倒入洁净的100毫米培养皿中。

轻敲培养皿以释放所有气泡。将PDMS在70摄氏度下烘烤两小时，随后冷却至室温。针对每个先前制备的印模，裁剪一块15毫米×15毫米的PDMS方片。

在本方案的后续步骤中，这些将被称为平片。将每个制备好的印章倒置在一块平的PDMS片上，使印章上的结构面与PDMS平片接触。用镊子轻轻按压印章顶部，以确保接触均匀。

接下来，在每对印章与平板的顶部界面处滴加少量紫外光固化聚合物。在重力辅助下，聚合物将通过表面张力作用被吸入两片之间。在印章与平板界面的边缘周围滴加少量紫外光固化聚合物。

这将形成一个用于容纳配体溶液的边界。然后小心地将印模和 slap 配对放入紫外灭菌箱中，使用无菌 STR 功率设置，照射 10 分钟。

此后，将成对物品从紫外灭菌盒中取出，用两把镊子夹住由紫外光固化聚合物形成的平板和模板，同时轻轻取下印章。用镊子小心地取下模板，并将其翻转，使与PDMS平板接触的一面朝上。将翻转后的模板放回紫外灭菌盒中。

使用无菌的 STR 功率设置，照射三分钟。用镊子小心地将每个模板的平面朝下放置在经酸洗涤的盖玻片上，确保模板图案位于盖玻片中央。在每个模板上方放置一小片实验室保鲜膜。

用力且均匀地按压模板，使模板与盖玻片之间形成牢固接触。将带有模板的盖玻片放入培养皿中。将该培养皿放入等离子清洗仪中，以高功率等离子处理30秒。

然后，将配体溶液移液至每个模板的表面。对于由 10 × 10 毫米方形印章制成的模板，每个模板加入 100 µL。随后，用实验室保鲜膜包裹含有盖玻片的培养皿，并在 4 °C 下孵育过夜。

首先，用镊子夹住带有模板的盖玻片，短暂浸入含有无菌 PBS 的培养皿中进行清洗。随后将带有模板的盖玻片浸入第二道 PBS 中再次清洗。小心地从盖玻片表面移除模板，注意不要损坏盖玻片。

接下来，将盖玻片短暂浸入盛有超纯水的培养皿中，以去除 PBS 洗涤残留的盐分。用盖玻片边缘接触一张精细擦拭纸，吸去多余水分。在惰性气体（如氮气）下吹干盖玻片。

然后，配制聚丙烯酰胺溶液以获得所需水凝胶弹性。对于每张图案化盖玻片，准备一张经戊二醛活化的底部盖玻片，并在其上放置垫片。将 75 至 150 微升聚丙烯酰胺溶液移液至每张戊二醛活化盖玻片的中央。

使用镊子将带有图案的配体盖玻片放置到经戊二醛活化的、含有聚丙烯酰胺和间隔分子的盖玻片上，使图案化的配体面朝向聚丙烯酰胺溶液。小心地将每一片聚丙烯酰胺夹心结构放入与15毫升锥底管螺纹匹配的盖帽支架中。将15毫升锥底管旋入每个盖帽支架，以固定聚丙烯酰胺夹心结构。

将含有聚丙烯酰胺凝胶的夹心结构放入离心管中，于室温下在摆桶转子中以200 × g离心10分钟。从离心机中取出离心管，放入试管架中保持原有方向，继续静置50分钟，以确保凝胶完全聚合。随后，从离心管中取出凝胶夹心结构，并将其浸入PBS中。

用实验室封口膜包裹培养皿，在室温下孵育3小时，或在4摄氏度下过夜。之后，在聚丙烯酰胺凝胶三明治结构仍浸没于PBS中的情况下，使用手术刀和镊子小心去除覆盖在盖玻片上的图案以及间隔物。将每张带有图案化聚丙烯酰胺凝胶的盖玻片放入帽状支架中。

将垫圈放置在盖玻片顶部，并围绕聚丙烯酰胺凝胶中隔片所在的位置。将截去底部的15毫米锥形管旋入盖帽支架中，使底部带有图案化聚丙烯酰胺凝胶形成一个孔状结构。这些组件可放入标准12孔板的孔中，便于操作。

进行该技术操作时，应使用荧光配体以确保在玻璃盖玻片表面形成预期的图案，并在聚合过程中成功转移至聚丙烯酰胺水凝胶表面。该方法成功的最终衡量标准是能够在图案化的水凝胶上以预期的几何形态培养人胚胎干细胞（hESCs）。按照文本方案所述进行培养时，通常在完全去除培养基中的Y27632后48至72小时内，hESCs会增殖并填满图案化的几何区域。

在聚丙烯酰胺水凝胶上以受限几何形状培养人胚胎干细胞（hESC）集落，可利用牵引力显微镜技术测量细胞产生的牵引力。该测量方法通过在水凝胶中嵌入荧光微球，并在接种hESC前后对这些微球的位置进行成像来实现。微球位置的图像可用于生成微球位移图谱，进而用于计算底层的牵引应力。

在人胚胎干细胞（hESCs）的圆形克隆中，最大的牵引应力出现在克隆的周边边缘区域，而克隆中心区域的牵引应力则均匀且较低。尽管观察到牵引应力分布不均，但在维持培养条件下以图案化圆形方式培养的hESCs，其多能性标志物Oct 3/4和细胞黏附分子E-cadherin的表达仍保持均匀。该技术将使研究人员能够更好地利用人胚胎干细胞模拟人类胚胎发育过程，从而深入理解人类发育机制。

该实验方案可适用于任何需要在软性水凝胶上以特定几何形态培养细胞的研究应用。本方法与大多数生化酸类兼容，使研究人员能够探究组织几何形态和细胞自身产生的力学作用等因素如何影响蛋白质表达和细胞信号传导。目前，许多研究人员正利用人胚胎干细胞来模拟人类早期发育过程。

该技术将使研究人员能够在更接近生理环境的条件下回答这些重要问题。