הדור של אורגנואידים האדם העיקרי של רירית הרחם

רירית האנדומטריום היא רקמה משתנה מדי חודש בתגובה להורמונים. חוסר איזון הורמונלי יכול למנוע התקשרות עובר וגם לגרום למחלות כמו סרטן. הפרוטוקול שלנו בונה מחדש את האנדומטריום כך שניתן יהיה ללמוד אותו מחוץ לגוף האישה בצורה פיזיולוגית.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מבנה תלת מימדי של תאים המורכבים משני סוגי תאים מגיבים הורמונלית, תאי האפיתל והסטרומה המארגנים ומתנהגים באופן ספציפי כפי שהם מתנהגים בגוף. מאז האורגנואידים יכולים לחקות טוב יותר התנהגות רקמות, הם יכולים לשמש בסופו של דבר כדי לבדוק תרופות שונות. אורגנואידים רירית הרחם ניתן להשתמש כדי ללמוד השפעות ישירות של גורמי סיכון ידועים כיום לסרטן, כולל השמנת יתר ותסמונת השחלות הפוליציסטיות.

האורגנואידים שלנו מדגישים את החשיבות של פעולות פרקטריניות בין שני סוגי תאים. חשוב להתחיל עם כמות מספקת של רקמה. קבלת הצפיפות הנכונה של תאים אפיתל וסטרומל יכול להיות מסובך.

כמו כן, האורגנואידים הם די קטנים וקשה לדמיין אותם עם כתמי IHC. הדמיה של הליך זה חשובה מכיוון שיש כמה שלבים שיהיה הרבה יותר קל להבין לאחר שראו אותם. אלה כוללים קבלת שכבת הרקמה הנכונה של הרחם, מקבל את הצפיפות הנכונה של תאים לשלב, וזרע את תבניות אגרוז.

לפני תחילת בידוד התא, יציקה לצייד 1.5% agarose מיקרו תבניות על פי הוראות היצרן לשכן את האורגנואידים. ב ארון biosafety, להשתמש בטכניקות aseptic להכין פתרון אנזים ב 37 מעלות צלזיוס מסנן סטרילי את הפתרון באמצעות מסנן מזרק מיקרומטר 0.2 לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר. באמצעות אזמל, לגרד את אנדומטריום מן ביופסיות הרחם טחון את הרקמה לחתיכות קטנות מאוד.

מניחים את הרקמה הטרייה בצינור חרוט 15 מיליליטר המכיל את פתרון האנזים. סגור את הכובע ולעטוף את החלק העליון של הצינור עם סרט שעווה כדי למנוע זיהום. מניחים את הצינור לתוך אמבט מים או אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עם רעידות בעדינות.

לאחר מכן, מחסנית מסננת תא 100 מיקרון על גבי מסננת תא 20 מיקרון על צינור חרוט 50 מיליליטר. סנן את הפתרון דרך שני מסננים. לשטוף את הצינור חרוט 15 מיליליטר עם HBSS ולשים את זה לשטוף דרך מסננת כדי להבטיח כי כל התאים נאספים.

לאחר מכן, להפוך את מסננת תא 20 מיקרון על צינור חרוט חדש 50 מיליליטר ולשטוף את תאי האפיתל את מסננת עם 20 מיליליטר של מדיה אורגנואידית בתוספת 1%פניצילין סטרפטומיצין. צנטריפוגה צינורות חרוט ב 500 G במשך חמש דקות. עבור תאים סטרומה שנאספו, להסיר את supernatant ו resuspend את גלולה ב 10 מיליליטר של חיץ תות דם אדום.

דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 עד 15 דקות. צנטריפוגה תאים אלה ב500 G במשך חמש דקות. הסר את supernatant ו resuspend גלולה עם 200 כדי 300 microliters של מדיה אורגנואידית.

עבור תאים אפיתל שנאספו, להסיר את supernatant ו resuspend גלולה ב 100 microliters של מדיה אורגנואידית. לאחר 1.5% תבניות agarose הם שיווי משקל, להסיר את התקשורת organoid בצד החיצוני של תבניות אגרוז להטות את צלחת תרבות הרקמה, כך המדיום מתא זריעת התא של מנות אגרוז ניתן גם להסיר בזהירות. הצג את המתלים אפיתל ותא סטרומה תחת מיקרוסקופ ולהוסיף מדיה אורגנואידית יותר המתלים, הקפד להוסיף רק 100 microliters בכל פעם, כך ההשעיה שווים בערך בצפיפות.

לאחר מכן לשלב חלק אחד של התאים stromal עם שלושה חלקים של תאי האפיתל לפי נפח. פיפטה 50 מיקרוליטרים של ההשעיה התא המשולב לתוך תא זריעת התא של עובש אגרוז. לאחר תבניות agarose מלאים בתאים, בזהירות להוסיף 400 microliters של מדיה organoid טרי לתוך הבארים של צלחת 24 היטב.

הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני, הקפדה לשנות את המדיום כל יום שני עם 500 microliters של מדיה אורגנואידית. לאחר שבעה ימים, לשנות את המדיום לאחד כי הוא הוסיף 0.1 אסטרדיול ננו-מולאר ו 0.8 טסטוסטרון nanomolar כדי לקדם את הארגון של התאים אפיתל וסטרומל. ראשית, להמיס 1.5% agarose ב PBS על ידי רותחים.

מניחים את הנוזל התעורר לתוך מקור של מים חמים ולאפשר לו להתקרר כ 50 מעלות צלזיוס. תחת מיקרוסקופ ניתוח, להטות את הצלחת 24 היטב בזהירות pipette החוצה את המדיום מבחוץ של עובש אגרוז. ואז בזהירות pipette את המדיום מפנים של עובש אגרוז, כדי למנוע שיבוש האורגנואידים.

בזהירות להוסיף בין 70 ל 75 microliters של חם, 1.5% התעורר לתוך התא של צלחת אגרוז, נזהר לא להפריע האורגנואידים. תן לצלחת להתקרר בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו 4% paraformaldehyde לכל באר של צלחת 24 בארות ותקן את כל עובש אגרוז אטום לילה בארבע מעלות צלזיוס.

למחרת, לאחסן את הצלחת ב 70% אתנול בארבע מעלות צלזיוס עד מוכן לעבד להטמיע פרפין. כדי להתחיל בבידוד רנ"א, הצג את הלוח תחת מיקרוסקופ לנתח. להטות את הצלחת בזהירות pipette את המדיום מן התא של עובש אגרוז.

בכוח pipette מיליליטר אחד של מדיום אורגנואיד טרי ישירות לתוך עובש אגרוז, כך organoids הם סמוקים מתוך microwells, נזהר לא ליצור בועות רבות מדי. חזור על תהליך צינורות כוחני זה פעם אחת באמצעות אותו מדיום. לאחר מכן, לאסוף את כל המדיום המכיל את האורגנואידים.

צנטריפוגה ב 500 G כדי לאסוף את האורגנואידים, ולהמשיך מיצוי RNA. במחקר זה, אורגנואידים רירית הדם האנושית המורכבת תאים אפיתל וסטרומלי של רירית האנדומטריום נוצרים ללא שימוש בחומרי פיגום אקסוגני. לעיבוד היסטולוגי, תבניות אגרוז המכילות אורגנואידים רירית האנדומטריאלית אטומים עם אגרוז, ואחריו קיבעון עם 4% paraformaldehyde לילה.

תבניות אלה מעובדות להטבעת פרפין סטנדרטית חתוכה ומוכתמת בהיסטולוגיה, שפעת חיסונית או אימונוהיסטוכימיה. המטוקסילין מכתים אאוסין מגלה מבנה דמוי כדורית עם שכבה אחת של תאים רירית בחוץ ותאים במרכז. סמנים ספציפיים לתאים אנדומטריאליים, אפיתל וסטרומל חושפים תאי אפיתל המקיפים את האורגנואיד עם תאים סטרומה במרכז.

סמנים של פיזיולוגיה רירית רירית האנדומטריה לאשר כי האורגנואידים רירית האנדומטריאלי שמרה על מאפיינים מסוימים של הרקמה המקורית. כתמים תלת-כרום, אשר מכתים קולגן כחול ותאים אדומים, מראה את נוכחותו של קולגן בתוך המרכז שבו התגוררו תאים סטרומה, המדגים ייצור פעיל הפרשת קולגן על ידי תאים סטרומה דומה לרקמה המקומית. בנוסף, כתמים אימונוהיסטוכימיים חושפים את נוכחותם של קולטני אסטרוגן, קולטני אנדרוגן, קולטני פרוגסטרון בתאי האפיתל והסטרומל.

חשוב לצלחת את התאים בצפיפות, כך שיש לנו מספיק אורגנואידים לניסויים במורד הזרם. זה ייקח קצת תרגול. אורגנואידים רירית רירית האנדומטריה ניתן לתרבת בתנאים שונים ולאחר מכן שנקטפו לניסויים כמו אימונוהיסטוכימיה או כתם immunofluorescence ללמוד ביטוי חלבון או שנקטפו עבור RNA ללמוד ביטוי גנים.

המעבדה שלנו חוקרת כיצד רירית הרחם מגיבה לרמות הורמונים משתנות, אשר יכול להוביל היפרפלזיה רירית הרחם וסרטן. אנחנו יכולים להשתמש אורגנואידים אלה לטיפולים ארוכי טווח של הורמונים ולהוסיף תנאים פתולוגיים כגון עודף טסטוסטרון נמצא תסמונת השחלות הפוליציסטיות, או אותות מ adipocytes לחקור שינויים רירית הרחם הנגרמת על ידי השמנת יתר. רקמות אנושיות נחשבות לביו-האזרדיות, וחשוב לנקוט באמצעי זהירות מתאימים.