Generazione di organoidi endometriali primari umani multicellulari

L'endometrio è un tessuto che cambia ogni mese in risposta agli ormoni. Lo squilibrio ormonale può prevenire l'attaccamento dell'embrione e causare anche malattie come il cancro. Il nostro protocollo ricostruisce l'endometrio in modo che possa essere studiato al di fuori del corpo della donna in modo fisiologico.

Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce una struttura 3D di cellule composte da due tipi di cellule ormonalmente reattive, le cellule epiteliali e stroma che si organizzano e si comportano specificamente come fanno nel corpo. Poiché gli organoidi possono imitare meglio il comportamento dei tessuti, alla fine possono essere utilizzati per testare diversi farmaci. Gli organoidi endometriali possono essere utilizzati per studiare gli effetti diretti dei fattori di rischio attualmente noti per il cancro, tra cui obesità e sindrome ovarica policistica.

I nostri organoidi sottolineano l'importanza delle azioni paracrine tra due tipi di cellule. È importante iniziare con una quantità adeguata di tessuto. Ottenere la giusta densità di cellule epiteliali e stromali può essere complicato.

Inoltre, gli organoidi sono piuttosto piccoli e possono essere difficili da visualizzare con la colorazione IHC. La visualizzazione di questa procedura è importante perché ci sono alcuni passaggi che saranno molto più facili da capire dopo averli visti. Questi includono ottenere il giusto strato tissutale dell'utero, ottenere la giusta densità di cellule da combinare e seminare gli stampi di agarosio.

Prima di iniziare l'isolamento cellulare, lanciare ed equilibrare microsta stampi all'1,5% di agarosio secondo le istruzioni del produttore per ospitare gli organoidi. In un armadio di biosicurezza, utilizzare tecniche asettiche per preparare una soluzione enzimatica a 37 gradi Celsius e filtrare sterilemente la soluzione utilizzando un filtro siringa da 0,2 micrometri in un tubo conico da 15 millilitri. Usando un bisturi, raschiare l'endometrio dalle biopsie uterine e tritare il tessuto in pezzi molto piccoli.

Posizionare il tessuto appena tritato nel tubo conico da 15 millilitri contenente la soluzione enzimatica. Chiudere il cappuccio e avvolgere la parte superiore del tubo con un film di cera per evitare la contaminazione. Posizionare il tubo in un bagno d'acqua o in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 30 minuti con tremare delicatamente.

Successivamente, impilare un colino a celle da 100 micron sopra un colino a celle da 20 micron su un tubo conico da 50 millilitri. Filtrare la soluzione attraverso i due filtri. Risciacquare il tubo conico da 15 millilitri con HBSS e mettere questo lavaggio attraverso il colino per garantire che tutte le cellule vengano raccolte.

Quindi, invertire il filtro cellulare da 20 micron su un nuovo tubo conico da 50 millilitri e lavare le cellule epiteliali dal colino con 20 millilitri di mezzi organoidi integrati con 1%penicillina e streptomicina. Centrifugare i tubi conici a 500 G per cinque minuti. Per le cellule stromali raccolte, rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in 10 millilitri di tampone dilisi dei globuli rossi.

Incubare a 37 gradi Celsius per 10-15 minuti. Centrifuga queste cellule a 500 G per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet con da 200 a 300 microlitri di mezzi organoidi.

Per le cellule epiteliali raccolte, rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in 100 microlitri di mezzi organoidi. Dopo che gli stampi di agarosio all'1,5% sono equilibrati, rimuovere il mezzo organoide all'esterno degli stampi di agarosio e inclinare la piastra di coltura tissutale in modo che anche il mezzo dalla camera di semina cellulare dei piatti di agarosio possa essere accuratamente rimosso. Visualizza le sospensioni cellulari epiteliali e stromali al microscopio e aggiungi più mezzi organoidi alle sospensioni, assicurandoti di aggiungere solo 100 microlitri alla volta in modo che le sospensioni siano approssimativamente uguali in densità.

Quindi combinare una parte delle cellule stromali con tre parti delle cellule epiteliali per volume. Pipetta 50 microlitri della sospensione cellulare combinata nella camera di semina cellulare dello stampo di agarosio. Una volta riempiti gli stampi di agarosio con cellule, aggiungere con cura 400 microlitri di mezzi organoidi freschi nei pozzi della piastra a 24 porri.

Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%, assicurandosi di cambiare il mezzo ogni secondo giorno con 500 microlitri di mezzi organoidi. Dopo sette giorni, cambiare il mezzo in uno che è integrato con 0,1 estradiolo nanomolare e testosterone nanomolare 0,8 per promuovere l'organizzazione delle cellule epiteliali e stromali. In primo luogo, sciogliere l'1,5% di agarosio in PBS facendo bollire.

Posizionare l'agarosio liquido in un bicchiere di acqua calda e lasciare raffreddare a circa 50 gradi Celsius. Al microscopio sezionato, inclinare la piastra a 24 poggia e pipettare con cura il mezzo dall'esterno dello stampo di agarosio. Quindi pipettare con cura il mezzo dall'interno dello stampo di agarosio per evitare di interrompere gli organoidi.

Aggiungere con cura tra 70 e 75 microlitri di agarosio caldo all'1,5% nella camera del piatto di agarosio, facendo attenzione a non disturbare gli organoidi. Lasciare raffreddare il piatto a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, aggiungere il 4% di paraformaldeide in ogni pozzo della piastra da 24 po 'e fissare l'intero stampo di agarosio sigillato durante la notte a quattro gradi Celsius.

Il giorno successivo, conservare la piastra in 70%etanolo a quattro gradi Celsius fino a quando non è pronto per il processo per l'incorporamento della paraffina. Per iniziare l'isolamento dell'RNA, vedere la piastra al microscopio di sezionazione. Inclinare la piastra e pipettare con cura il mezzo dalla camera dello stampo di agarosio.

Pipettare con forza un millilitro di mezzo organoide fresco direttamente nello stampo dell'agarosio in modo che gli organoidi vengano esacquati dai microlitri, facendo attenzione a non creare troppe bolle. Ripetere questo processo di pipettazione forzata una volta utilizzato lo stesso mezzo. Dopo questo, raccogliere tutto il mezzo contenente gli organoidi.

Centrifugare a 500 G per raccogliere gli organoidi e procedere all'estrazione dell'RNA. In questo studio, gli organoidi endometriali umani composti da cellule epiteliali e stromali dell'endometrio vengono generati senza l'uso di materiali di impalcatura esogeni. Per la lavorazione istologica, gli stampi di agarosio contenenti gli organoidi endometriali sono sigillati con agarosio, seguiti da fissazione con paraformaldeide al 4% durante la notte.

Questi stampi sono lavorati per l'incorporamento standard di paraffina sessato e macchiato per istologia, immunofluorescenza o immunoistochimica. L'ematossilina nella colorazione dell'eosina rivela una struttura simile a uno sferoide con un singolo strato di cellule che rivestono l'esterno e cellule al centro. Marcatori specifici delle cellule per cellule endometriali, epiteliali e stromali rivelano cellule epiteliali che circondano l'organoide con cellule stromali al centro.

Marcatori di fisiologia endometriale confermano che gli organoidi endometriali hanno mantenuto alcune caratteristiche del tessuto nativo. La colorazione tri-cromo, che macchia il blu del collagene e il rosso delle cellule, mostra la presenza di collagene all'interno del centro in cui risiedevano le cellule stromali, dimostrando la produzione attiva e la secrezione di collagene da parte di cellule stromali simili al tessuto nativo. Inoltre, la colorazione immunoistochimica rivela la presenza di recettori degli estrogeni, recettori degli androgeni e recettori del progesterone sia nelle cellule epiteliali che stromiche.

È importante placcare densamente le cellule in modo da avere abbastanza organoidi per gli esperimenti a valle. Ci sarà un po' di pratica. Gli organoidi endometriali possono essere coltivati in diverse condizioni e quindi raccolti per esperimenti come l'immunoistochimica o l'immunofluorescenza per studiare l'espressione proteica o raccolti per l'RNA per studiare l'espressione genica.

Il nostro laboratorio indaga come l'endometrio risponde ai livelli alterati di ormone, che possono portare all'iperplasia endometriale e al cancro. Possiamo usare questi organoidi per trattamenti a lungo termine di ormoni e aggiungere condizioni patologiche come l'eccesso di testosterone presente nella sindrome ovarica policistica, o segnali da adipociti per studiare i cambiamenti endometriali indotti dall'obesità. I tessuti umani sono considerati pericolosi per il rischio biologico e sarà importante prendere le precauzioni appropriate.