وحيد الخلية القرار التصوير ثلاثي الأبعاد من organoids سليمة

يمكن استخدام بروتوكولنا لتصور التعقيد الهيكلي للعضيات ، مما يسمح برسم خرائط الهوية ، الكبريتات ، والتوزيع في هذه الهياكل ثلاثية الأبعاد عند دقة الخلية الواحدة. تم تحسين بروتوكولنا السريع لمدة ثلاثة أيام بشكل كامل للأعضاء ذات الأصل المختلف ويستخدم إعداد عينة مباشرة ، يتضمن خطوة مقاصة بصرية غير سامة وطريقة تركيب تعتمد على السيليكون. على الرغم من أن البروتوكول لدينا هو واضح، وبعضها خطوات حاسمة مثل معالجة منظمة، أو إعداد الشريحة، يمكن أن يكون أفضل شرح من خلال مظاهرة مرئية من خلال النص.

لاسترداد 100 إلى 500 ميكرومتر قطر organoids نمت في الطابق السفلي استخراج غشاء في 24 لوحات جيدا، وغسل كل لحام ليتم حصادها مع برنامج تلفزيوني دون تعطيل المصفوفات 3D، ووضع لوحة على الجليد. إضافة ملليلتر واحد من الجليد الباردة حل الانتعاش إلى كل بئر ووضع لوحة على شاكر أفقي في أربع درجات مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة. تراجع نصائح ماصة ملليلتر واحد في 1٪ BSA في حل PBS والماصة صعودا وهبوطا مرتين لمعطف كل تلميح مع BSA.

بعد ذلك ، أضف خمسة ملليلترات من 1٪ PBS BSA إلى أنبوب واحد 15 ملليلتر لكل حالة ، وعكس الأنبوب مرتين إلى ثلاث مرات قبل التخلص من الحل ، لمعطف داخل الأنبوب. لجمع الأعضاء، استخدم طرف مغلفة لإعادة تعليق بلطف محتويات البئر خمس إلى 10 مرات، وسحب كل من organoids من كل حالة في أنبوب واحد المغلفة 15 ملليلتر. شطف كل بئر مع ملليلتر واحد من الجليد البارد 1٪ PBS BSA لضمان أن جميع organoids قد تم جمعها، ونقل يغسل إلى الأنابيب المناسبة.

جلب حجم النهائي في كل أنبوب تصل إلى 10 ملليلتر مع برنامج تلفزيوني الباردة، ورواسب organoids من قبل الطرد المركزي للحصول على لوحة ضيقة دون طبقة مرئية من مصفوفة 3D. لإصلاح organoids، واستخدام رأس ماصة مليلتر المغلفة بعناية إعادة تعليق كل بيليه في ملليلتر واحد من الجليد البارد para الفورمالديهايد، وإصلاح في أربع درجات مئوية لمدة 45 دقيقة. بلطف إعادة تعليق organoids في منتصف الطريق من خلال وقت التثبيت.

بعد 45 دقيقة، إضافة 10 ملليلتر من الجليد البارد برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى tween 20 إلى كل أنبوب ويخلط بلطف عن طريق الانقلاب، قبل وضع الأنابيب في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. لمنع organoids، في نهاية الحضانة، تدور أسفل العينات وإعادة تعليق الكريات في ما لا يقل عن 200 ميكرولترات من الجليد الباردة العازلة غسل الأعضاء في البئر أن تكون مطلية. ثم نقل organoids إلى آبار فردية من لوحة تعليق 24 بئرا لاحتضان 15 دقيقة في أربع درجات مئوية.

للحصول على علم المناعة إضافة 200 ميكرولترات من العازلة غسل organoid في مرجع فارغ جيدا، والسماح لعضية لتسوية إلى الجزء السفلي من لوحة. عندما استقرت organoids، إمالة لوحة في زاوية 45 درجة للسماح بإزالة جميع ما عدا آخر 200 ميكرولترات من العازلة الغسيل. المقبل، إضافة 200 ميكرولترات من العازلة غسل organoid التي تحتوي على الأجسام المضادة الأولية من الفائدة، ووضع لوحة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع هزاز معتدل ويهتز في 40 الثورات في الدقيقة الواحدة.

في صباح اليوم التالي، إضافة ملليلتر واحد من عازلة غسل organoid إلى كل بئر، والسماح لعضية لتسوية إلى الجزء السفلي من لوحة لمدة ثلاث دقائق. عندما استقرت organoids، وإزالة جميع ما عدا آخر 200 ميكرولترات من كل بئر، وغسل organoids مع ثلاثة يغسل لمدة ساعتين مع ملليلتر واحد من عازلة غسل الأعضاء الطازجة، وهز خفيف وهتز في غسل. بعد الغسيل الثالث ، اسمح للعضية بالاستقرار في الجزء السفلي من اللوحة لمدة ثلاث دقائق قبل إزالة جميع الـ 200 ميكرولترات ما عدا آخر 200 من عازل الغسيل العضوي من كل بئر.

إضافة 200 ميكرولترات من العازلة غسل organoid التي تحتوي على الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لكل بئر لاحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع هزاز خفيف والهز. في صباح اليوم التالي ، اغسل الأعضاء بثلاثة غسلات لمدة ساعتين في ملليلتر من عازل الغسيل العضوي الطازج لكل غسل ، كما هو موضح. بعد الغسيل الأخير، نقل organoids في أنبوب واحد 1.5 ملليلتر في البئر، وجمع organoids عن طريق الطرد المركزي.

لإزالة البصرية من organoids، وإزالة قدر الغسيل العازلة من كل أنبوب ممكن، دون تعطيل organoids، واستخدام تعديل 200 دقيق ماصة تلميح لإضافة ما لا يقل عن 50 ميكرولترات من FUnGI إلى كل بيليه. بعد حضانة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة يمكن تخزين organoids لمدة تصل إلى أسبوع واحد في أربع درجات مئوية، أو لمدة تصل إلى ستة أشهر في ناقص 20 درجة مئوية. لإعداد الشرائح للتصوير العضوي عن طريق المجهر confocal، ملء حقنة 10 ملليلتر مع تسرب السيليكون وإرفاق 200 ميكرولتر تلميح ماصة المعدلة إلى الحقنة.

استخدام حقنة لرسم مستطيل من واحد في اثنين سنتيمتر في منتصف شريحة، واستخدام الثانية تعديل 200 دقيق ماصات تلميح لوضع organoids مسح في منتصف المستطيل. لوضع زلة غطاء فوق الأجهزة، ضع الجانب الأيسر من الغطاء ينزلق أولاً، قبل أن يخفض زلة الغطاء ببطء من اليسار إلى اليمين حتى لا يكون هناك هواء محاصر. ثم تطبيق بلطف الضغط على جميع حواف زلة الغطاء لإرفاقه بحزم إلى تسرب السيليكون.

لتصوير الأعضاء، ضع الشريحة على خشبة مسرح مجهر المسح الضوئي بالليزر confocal، وحدد هدف الغمر المتعدد 25 X للتصوير confocal. تعيين المجهر إلى إعدادات الاقتناء المناسبة، واختيار قوة ليزر منخفضة للحد من تبييض الصورة. استخدم وضع المكدس Z لتعريف الحدود العليا أدنى نهاية وتعيين حجم الخطوة Z إلى الأمثل.

عند تصوير هياكل أعضاءية كبيرة، أو عدة أجهزة أوغنويد معا، استخدم وضع التجانب مع تداخل 10٪، وتشير إلى منطقة الاهتمام. عندما يتم تعيين كافة المعلمات، الحصول على تمثيل عرض 3D من التصوير في برنامج التصوير، وتحسين خصائص السطوع والتباين وتقديم 3D. ثم تصدير لقطات RGB من النتائج كملفات TIFF.

ويتضح قوة التصوير 3D مقارنة مع التصوير 2D من خلال هذه الصور من الماوس الأعضاء الغُدَّة الثديية التي تم إنشاؤها كما هو موضح. الطبقة المركزية لهذه الأعضاء تمثيلية يتكون من العمود على شكل K8/K18 الخلايا البارزة الإيجابية، والطبقة الخارجية تحتوي على خلايا الريحان K5 ممدود إيجابية، وخلاصة مورفولوجيا الغدة الثديية في الجسم الحي. هذه المنظمة المستقطبة هي التحدي لتقدير من قسم بصري 2D من نفس organoid.

مثال آخر على بنية معقدة من المستحيل تفسيرها بدون معلومات ثلاثية الأبعاد هي شبكة من القنوات الموجبة MRP2 التي تسهل جمع السائل الصفراوي من الأعضاء الكبدية البشرية. وعلاوة على ذلك، فإن الجودة التي تم الحصول عليها والدقة تسمح بالتجزئة شبه الآلية وتحليل الصور. وبالتالي، يمكن قياس إجمالي عدد الخلايا ووجود علامات في أنواع فرعية خلوية محددة في الأعضاء الكاملة.

عن طريق تجزئة نواة من organoid بأكملها التي تحتوي على 140 الخلايا، يمكن تحديد ثلاث خلايا التي تظهر إيجابية عالية لعلامة دورة الخلية Ki67. وكيل المقاصة البصرية، FUnGI، يتفوق على مقاصة وفركتوز-غليسيرول المقاصة في جودة إشارة الفلورسنت في عمق organoid. مع FUnGI تطهير organoids مما يدل على كثافة الفلورانس تعزيز العام مقارنة مع organoids غير مُفح.

لاحظ أن أي بقايا BME في العينة قد يؤدي إلى انخفاض اختراق الأجسام المضادة ويمكن أن يؤدي إلى إشارة خلفية عالية. وبالإضافة إلى ذلك، لا ينبغي أن تكون organoids الكيسي مسح بصريا إذا أنها تنهار. مع تعديلات طفيفة على البروتوكول، يمكن استخدام العينات مع كونوكال فائقة، متعددة الفوتون، والمجهر ورقة ضوء.