Um método de co-cultura para estudar o crescimento da neurita em resposta aos sinais de paracrina da polpa dentária

Este protocolo fornece um esboço detalhado de como co-cultivar células-tronco de polpa dentária com neurônios trigêmeos. Com ele, podemos investigar múltiplas respostas impulsionadas por seu crosstalk. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de estudar e manipular ou ambas as populações celulares e medir precisamente os resultados.

Este método tem relevância direta para a pesquisa neural e poderia fornecer insights sobre pesquisas sobre como as células-tronco da polpa dentária reparam tecido neural danificado por eventos traumáticos ou doenças neurodegenerativas. Há várias etapas desta técnica para aprender e pode ser difícil manter o trato de todos eles. Este protocolo detalha cada etapa para ajudar com isso.

A polpa dentária e a gânglio são difíceis de dispersar e requerem vários vórtices e pipetagem. Mesmo assim, você não terá dispersão total, então será necessária otimização e réplicas. Após a eutanásia do mouse, coloque a cabeça no subpad descartável para que a boca fique em direção ao teto e a base do pescoço fique plana na superfície de trabalho.

Use uma lâmina de barbear e um movimento de serragem para separar a mandíbula da maxila. Remova a língua com tesouras ou fórceps para facilitar o acesso aos molares. Coloque a cabeça aberta no prato em cima de uma gaze estéril e coloque o espécime sob o microscópio de dissecação.

Remova o tecido ósseo alveolar ao redor dos primeiros molares. Insira fórceps na abertura alveolar e provoque o tecido para longe do dente em direção ao bucáculo ou lado lingual da boca. Colete todos os molares maxilares e transfira suavemente os primeiros molares submandibulares e maxilares para um prato de cultura celular separado com 1X PBS no gelo.

Remova o órgão externo do esmalte ao redor do exterior de cada primeiro molar maxilar. Com um conjunto de fórceps gire o molar de modo que as bordas estejam para baixo e a raiz aberta seja exposta. Há uma abertura oval na parte inferior do dente e tecido de polpa dentária opaco encapsulado por uma fina camada de dentina e esmalte.

Utilizando a ponta dos fórceps, solte suavemente a polpa dentária executando um braço dos fórceps ao redor da circunferência interna do tecido mineralizado. Retire o tecido da polpa dentária da estrutura mineralizada e transfira para um terceiro prato contendo 1X PBS. Remova o órgão externo do esmalte se ele ainda não estiver separado.

Transfira todo o tecido de polpa dentária para 0,25% de trippsina EDTA em um tubo cônico de 50 mililitros. Vórtice da mistura e coloque-a em um banho de água morna de 37 graus Celsius por 10 minutos. Sob um capô estéril, adicione mídia de co-cultura aquecida a uma proporção final de pelo menos uma mídia para tentar inativar a enzima.

Encobrindo a mídia várias vezes com uma tubulação de 10 mililitros para dispersar ainda mais a polpa dentária na mídia, evitar grandes bolhas. Transfira um mililitro da polpa dentária dispersa para cada poço de 24 poços de cultura tecidual. Coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius.

E permitir que as células se conectem e migrem do tecido não desfeita por 48 horas antes de mudar a mídia. Após a eutanização e remoção da pele, insira a ponta de uma tesoura de micro dissecação na base do crânio. Corte ao longo da sutura sagital do crânio.

Faça quatro pequenos cortes horizontais ao longo das suturas coronais pelas orelhas até ao longo das suturas lambdoid da base do crânio. Isso cria dois retalhos de osso. Use os fórceps para descascar os dois retalhos de osso para revelar o cérebro.

Localize o gânglio trigêmeo alojado na dura-maternidade entre o cérebro e o osso do processo maxilar. Corte os três ramos que viajam até os olhos, maxilas e mandíbula. E use fórceps finos de borda reta para transferir o gânglio para o frio 1X PBS em um prato no gelo.

Uma vez que todos os feixes trigeminaris são colhidos usem fórceps de arquivo para transferir gânglios para tubo cônico de 50 mililitros contendo cinco miligramas por mililitro de colagenase filtrada estéril tipo II.Vortex a mistura e coloque o tubo no banho de água Celsius de 37 graus por 25 a 30 minutos. A cada cinco a dez minutos, tire o tubo do banho de água, vórtice, e volte ao banho. Centrifugar a solução de neurônio trigêmeo de colagem por dois minutos a 643xg.

Sob uma capa de cultura de tecido, aspire suavemente a colagem com um micropipet e adicione cinco mililitros de trippsina filtrada 1%estéril tipo II.Em seguida, coloque o tubo em um banho de água de 37 graus Celsius por 25 a 30 minutos e dentro deste período de tempo o vórtice do tubo brevemente a cada cinco minutos. Adicione mídia a uma proporção de trypsin para mídia para desativar o trypsin restante. Conte o número de células e dilua a mistura para 200.000 células por mililitro na mídia.

Coloque filtros transwell revestidos em poços com polpa dentária. Pipet 250 microliters no filtro transwell e cultura as células a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, substitua a mídia por um mililitro de mídia de co-cultura complementada com uma uridina micromolar e 15 micromolar 5-Fluoro-2'desoxyuridina para impedir a proliferação excessiva de células mesenquimais que podem impedir o crescimento de neurite.

Você deve adicionar inibidores mitóticos no segundo dia ou o crescimento de neurite não ocorrerá. Neste estudo, o crescimento da neurita trigeminal foi aumentado na presença de células primárias de polpa dentária no poço subjacente em comparação com o controle da monocultura de neurite nriginal. As células primárias isoladas do receptor TGF-beta 2 flox/flox foram equivalentes em número após injeções de ade-Cre-GFP ou ade-eGFP.

O PCR semi-quantitativo demonstra que o adenovírus-Cre-GFP excluiu o gene flanqueado transformando o receptor beta do fator de crescimento 2 com adenovírus-eGFP servindo como vetor viral de controle. Nas culturas com transformação do fator de crescimento beta receptor 2 exclusão, o crescimento do neurite foi diminuído. Imagens de campo brilhante de filtros transwell após a coloração cristalina violeta de populações celulares mostram que grandes poros são prevalentes.

A grande seta aponta uma célula com morfologia mesenquimal, enquanto a pequena seta aponta para uma célula de morfologia neuronal. Violeta cristalina manchou ambas as células sem preconceitos. Além disso, a coloração da imunofluorescência da tubulina beta-III com um anticorpo secundário alexa 488 mostra coloração não específica de múltiplas células dificultando a imagem de estruturas aferentes.

Como nem as células de polpa dentárias nem os neurônios trigêmeos se dispersam facilmente, cada pesquisador precisará otimizar seus procedimentos de revestimento. Se você cultivar células de polpa dentária sozinhas em poços separados, você pode usar imunofluorescência ou você pode quantificar níveis de RNA ou proteína para determinar como as células de polpa dentária estão respondendo aos neurônios. Lembre-se de branquear quaisquer recipientes ou dicas que entrem em contato com adenovírus.

Certifique-se de descartar corretamente as lâminas em uma lixeira afiada.