Создание In Situ закрытого цепи перфузии нижних органов брюшной полости и задних конечностей у мышей

Этот протокол может быть использован для ответа на вопросы о доставке лекарств и иммунных взаимодействий в органах, включенных в нашу схему. Этот метод позволяет перфузии органов, которые не могут пронизыть традиционными методами экс-виво, избегая при этом основных органов клиренса. Перед началом операции установите циркулирующую водяную баню и все компоненты в водяной куртке до 37 градусов по Цельсию.

Подтвердите, что трубки очищаются, и использовать пузырь ловушку во влажной камере, как перфусировать резервуар, чтобы ограничить объем перфусации. Для выполнения процедуры катетеризации, подтвердить отсутствие реакции на педаль рефлекс, в 8 до 10 недель мужчина анестезировал луковицу увидеть мышь. И поместите мышь в положение на спине на доске пенополистирола, с головой в шесть часов.

Обездвижить конечности животных лентой и протереть живот изопропиловым спиртом. Сделайте Т-образный разрез в брюшной полости, используя электрокоагуляцию, чтобы остановить кровотечение по краю разреза. Нажмите живот, jejunum и толстой кишки на правую сторону живота, чтобы выявить брюшной аорты, полости вены и общих подвздошных и илиолумбарных артерий и вен.

Под микроскопом вскрытия, найти и ligate яичников и илиолумбарных артерий и вен с 4-O шелковые швы. Петля два 4-O шелковые швы под брюшной аорты и нижней полости вены около одного сантиметра выше подвздошной артерии и вены, один миллиметр друг от друга. Затем сделайте свободный кивнуть в шве ближе всего к подвиху судов.

Используйте держатель иглы, чтобы горизонтально выровнять и растянуть как нижняя вена cava и брюшной аорты. И, сохраняя сосуды растягивается, использовать 24-го калибра крылатый щит IV катетер для прокола брюшной аорты. Как только игла проникает примерно на один миллиметр в сосуд, на угнетают кнопку, чтобы втянуть ядро иглы, и вставляют катетер около пяти миллиметров в сосуд.

Вставьте катетер пять миллиметров в нижняя кава вены, таким же образом. И связать оба шва вокруг катетеризованных сосудов. Затем нанесите мгновенный клей, чтобы обездвижить катетеры, чтобы возвеститель спина, и заменить органы брюшной полости.

Чтобы настроить систему перфузии, поместите мышь на кремниевую площадку во влажную камеру с водяной курткой и обездвижйте крылья катетера на площадку 19-го калибра иглами. Заполните вход артериального катетера с предварительно разогретым буфером перфузии. Используйте гемостатические типсы и винтовой разъем, чтобы прикрепить вход катетера к трубе, и обездвижить вход перфузии трубки с лентой.

Отрегулируйте скорость перистальтического потока до 0,6 миллилитров в минуту и держите отток перфузии открытым в течение пяти-десяти минут, чтобы вымыть кровь через венозный катетер. Некоторые сгустки будут присутствовать в розетке катетер, промыть сгустки с перфузировать буфер, и использовать винт на разъем, чтобы прикрепить к концу венозного катетера к розетке трубки, чтобы закрыть цепь. Затем накройте влажную камеру предварительно разогретой крышкой на срок до двух часов перфузии, периодически проверяя уровень перфуза.

Здесь показаны конфокальные изображения после перфузии с решением звонаря, содержащим Hoechst 33342 и DyLight-649 lectin. Мышцы, костный мозг, яички, мочевой пузырь, простата и кожа стопы обычно демонстрируют эффективное ядерное и сосудистое окрашивание. Гематоксилин и эозин окрашивание этих тканей после трех часов нормальной темической перфузии, показывает успешное промывка органов, без видимых повреждений тканей.

Эта модель может быть использована для понимания путей поглощения наркотиков, в физиологической нерелевантной среде. Например, понять роль компонентов сыворотки в накоплении препарата. Мы используем систему, чтобы понять механизм липосомного накопления в коже.