Name: פרוטוקול לאימונוהיסטוכימיה והפצת RNA In-situ בתוך עובר דרוזופילה מוקדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 34 s
Description: למדו פרוטוקול לאימונוהיסטוכימיה והיברידיזציה in-situ בעוברי Drosophila melanogaster מוקדמים. השיטה משפרת את ההידבקות לזכוכית ומאפשרת הדמיית חלבונים ו-RNA בתהליכי התפתחות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (#31771377/ 31571273/31371256), תוכנית המדען המכובד הזר מהמחלקה הלאומית לחינוך (#MS2014SXSF038), הקרן הלאומית לחקר האוניברסיטאות המרכזיות של המחלקה הלאומית לחינוך (#GK201301001/201701005/GERP-17-45), ו-XZ נתמכת על ידי קרן תזת הדוקטורט המצטיין (#2019TS082/2019TS079), תוכנית המפתח של מחלקת החינוך המחוזית שאאנשי (#20JS138), פרויקט הנוער של תוכנית המחקר הבסיסית למדעי הטבע של המחלקה למדע וטכנולוגיה במחוז שאאנשי (#2020JQ-885).

<ol><li>Weisleder, N., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Ca2%2B+sparks+in+aging+skeletal+and+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle.</a> Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).</li>
<li>Cheng, H., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Calcium Sparks.</a> Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).</li>
<li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+Receptors%3A+Functional+Structure+and+Their+Regulatory+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors.</a> Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).</li>
<li>Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%3A+an+underlying+link+between+cardiac+disease+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis.</a> Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).</li>
<li>Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+cDNA+encoding+a+Drosophila+ryanodine+receptor+and+functional+studies+of+the+carboxyl-terminal+calcium+Release+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel.</a> Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).</li>
<li>George, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+FKBP+family+protein%3A+evaluation%2C+structure%2C+and+function+in+mammals+and+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster.</a> BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syncytium+calcium+signaling+and+macrophage+function+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart.</a> Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+CaSR%2FIP3R+in+prostate+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development.</a> Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).</li>
<li>Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+temporal+examination+of+calcium+signaling+in+cancer-+from+tumorigenesis%2C+to+immune+evasion%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis.</a> Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).</li>
<li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+defects+and+altered+ryanodine+receptor+function+in+mice+lacking+FKBP12%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12.</a> Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).</li>
<li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oestrogen+protects+FKBP12.6+null+mice+from+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy.</a> Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).</li>
<li>Zalk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+mammalian+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a mammalian ryanodine receptor.</a> Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).</li>
<li>Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+calcium+increases+explosively+in+activating+medaka+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Free calcium increases explosively in activating medaka eggs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).</li>
<li>Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+free+calcium+wave+traverses+the+activating+egg+of+the+medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes.</a> Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).</li>
<li>Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+health+span+and+life+span+in+Drosophila+by+S107+requires+the+calstabin+homologue+FK506-BP2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).</li>
<li>Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ryanodine+receptor+is+essential+for+larval+development+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).</li>
<li>Feng, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+expression+of+DmFKBP12%2FCalstabin+during+embryonic+early+development+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster.</a> Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+embryonic+development+of+Drosophila+melanogaster%22">The embryonic development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer. 633-645 (1958).</li>
<li>Xu, X., Dong, C., Vogel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemicentins+Assemble+on+Diverse+Epithelia+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).</li>
<li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12.6+deficiency+and+defective+calcium+release+channel+%28ryanodine+receptor%29+function+linked+to+exercise-induced+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death.</a> Cell. 113 (7), 829-840 (2003).</li>
<li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+from+cardiac+arrhythmia+through+ryanodine+receptor-stabilizing+protein+calstabin2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2.</a> Science. 304 (5668), 292-296 (2004).</li>
<li>Bellinger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+ryanodine+receptor+complex+causes+%26%2334%3Bleaky%26%2334%3B+channels%3A+a+molecular+mechanism+for+decreased+exercise+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Remodeling of ryanodine receptor complex causes &#34;leaky&#34; channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).</li>
<li>Maruyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12+is+a+critical+regulator+of+the+heart+rhythm+and+the+cardiac+voltage-gated+sodium+current+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice.</a> Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12+is+the+only+FK506+binding+protein+mediating+T-cell+inhibition+by+the+immunosuppressant+FK506%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506.</a> Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).</li>
<li>Zalk, R., Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+release+channels+join+the+%27resolution+revolution%27%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ca2+ release channels join the 'resolution revolution'.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

RyRs ו- IP3Rs מתווך סידן איתות הוא מסלול בסיסי בתהליך פיזיולוגי ופתולוגי רבים של בעלי חוליות וחסרי חוליות כאחד 1,2,3,4. אצל בני אדם, מוטציות נקודתיות, כגון מוטציה R4496C הקשורה ל- CPVT, בגן RyR2 מובילות לדליפת סידן מהרשת הסרקופלסמית של קרדיומיוציט, וכתוצאה מכך לתפקוד לקוי של הלב. מוטציות אלה מוצגות כהפרעות קצב עם סיכון גבוה למוות לבבי פתאומי במהלך פעילות גופנית, והוא ניתן לשחזור במודלים של עכבר...

איתות שחרור סידן המושרה בסידן (CICR) ממלא תפקיד קריטי בתהליכים ביולוגיים רבים, כגון שרירי שלד/חלק ותפקוד כלי הדם הלבביים, התפשטות התאים ואפופטוזיס, פיתוח, הזדקנות, פלסטיות סינפטית עצבית והתחדשות1,2,3,4,5,6 . קולטני ריאנודין (RyRs) ואינוזיטול 1,4,5-קולטני טריספוספט (IP3Rs) הם שחקנים מרכזיים במסלול איתות הסידן הנשלט על ידי הרגולטורים שלהם חלבון קינאז A (PKA), Ca2 +/calmodulin תלוי חלבון קינאז II (CaMKII), חלבונים מחייבים FK506 (FKBPs), קלסקסטרין (CSQ), טריאדין, ו junctin1,2,3,4,5,6 . ביטוי אנושי חריג ומוטציות בחלבונים אלה יכולים להוביל לפיזיולוגיה פתולוגית כגון הפרעות קצב7 והתפשטות אונקוגנית8,9.
FKBPs לווסת את שחרור הסידן מן הרשתית אנדופלסמית (ER) על ידי RyRs. תהליך זה חיוני למנגנון ההתכווצות, ולכן אחראי לכל תנועה מכנית שנוצרת על ידי התכווצות מיוזין-אקטין באמצעות שחרור סידן המושרה בסידן יחד עם RyRs עוברי 1,2. במודלים של עכבר, היעדר RyR2 והרגולטור שלו FKBP12/Calstabin הוא תמיד קטלני, בין אם במהלך התפתחות עוברית או בתקופה שלאחר הלידה המוקדמת10,11,12. עכברי נוקאאוט FKBP12/Calstabin מציגים מומים לבביים קריטיים עם צימוד עירור-התכווצות לא סדיר (EC) ובצקת מוחית במהלך התפתחות עוברית. זה מצביע על כך FKBP12/Calstabin ממלא תפקיד חיוני בוויסות ביטוי ערוץ RyR2, אשר חשוב הן להתפתחות הלב והן להתפתחות המוחית10.
ניצוצות סידן שנערכו על ידי RyR התגלו בתחילה בשלב היווצרות הזיגוטה של ביצי מדאקה מופרות13,14. עם זאת, חקירות מעטות בוצעו על הפונקציה של איתות סידן בהתפתחות עוברית מוקדמת. ב Drosophila melanogaster, תוצאות שהתקבלו DmFKBP12 S107 מוטציות לספק ראיות חזקות התומכות בחשיבות של גן זה להתפתחות זחל ותוחלת חיים בריאה, אשר מיוחס לתפקודו נגד סטרס חמצוני 15,16. לאחרונה, זיהינו את הלוקליזציה הדינמית של חלבון FKBP12 / Calstabin ו- RNA שליח במהלך פיתוח מלנוגסטר דרוזופילה מוקדם17. באמצעות הגישות המתוארות במתודולוגיה זו, הצלחנו לעקוב אחר הביטוי של FKBP12 / Calstabin ב D. melanogaster במהלך blastoderm סינסיטיאלי (0-2 שעות), blastoderm הסלולר (2-3 שעות), gastrula מוקדם (3-12 שעות) ו gastrula מאוחר (12-24 שעות). במאמר זה, אנו מציגים את הפרוטוקולים המפורטים של כל גישה במחקר הקודם, כולל הטמעה טרום-עוברית עבור חתך פרפין קלאסי, טיפול שקופיות טרום ציפוי עבור חלקים עובריים, היסטו-כימיה כתמים וחיסון, ו הכלאה mRNA in-situ לזיהוי ביטוי גנים.

<table><tbody><tr><td>-20&deg; C מקרר</td><td>Meiling ביולוגיה & </td><td>DW-YL270</td> רפואי <td>משמש לאחסון עוצר-80</td></tr><tr><td>&deg; C מקרר בטמפרטורה נמוכה במיוחד</td><td></td><td>Thermo Forma 90 סדרה</td><td>משמש לאחסון עוצר</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WXBB6360V</td><td>הכנת צלחות אגר מיץ ענבים</td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-AP, שברי Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td>לאיתור תרכובת עם תווית digoxigenin</td></tr><tr><td>חממה ביוכימית</td><td>Shanghai Bluepard Instruments</td><td>LRH-250</td><td>in-situ Hybridization</td></tr><tr><td>תמיסת בואין</td><td>מגיב כימי סינופארם בבייג'ינג</td><td>69945460</td> צנטריפוגה <td>להטמעת עובר דרוזופילה</td></tr><tr><td>אפנדורף</td><td>540BH07808</td><td></td><td>באתר צינור צנטריפוגה היברידית</td></tr><tr><td></td><td>דנוויל</td><td>C-2170</td><td>אוסף עוברי דרוזופילה</td></tr><tr><td>כרום אלום</td><td>סינופארם מגיב כימי ב בייג'ינג</td><td>10001018</td><td>ציפוי שקופיות</td></tr><tr><td>אמבט מים בטמפרטורה קבועה</td><td>ג'ינטאן Henfeng מכשירים</td><td>KW-1000DC</td><td>המטוקסילין-אאוזין צביעה, אימונוהיסטוכימיה, הכלאה במקום וצביעת חומצה-כסף מתנאמין תקופתית</td></tr><tr><td>Dako REAL EnVision זיהוי</td><td>מערכת Dako</td><td>K5007</td><td>בתגובה אימונוהיסטוכימית או בתגובת הכלאה באתר, הוא נקשר לנוגדני האנטיגן הראשוני, והמטרה מסומנת על ידי צביעה.</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td> ערכת תיוג RNA <td>היברידיזציה באתרה</td></tr><tr><td></td><td>של Roche</td><td>11093274910</td><td>תיוג RNA עם דיאגוקסיגנין-UTP על ידי שעתוק במבחנה עם SP6 ו-T7 polymerase</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664</td><td>המלאי של Drosophila melanogaster mutant</td></tr><tr><td>תנור ייבוש פיצוץ חשמלי</td><td>טיאנג'ין Taiste מכשירים</td><td>101-0AB</td><td>לציפוי שקופיות והטמעת פרפין</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230251</td><td>Hematoxylin-Eosin צביעת</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סינופארם מגיב כימי בבייג'ינג</td><td>100092680</td><td>הטמעת פרפין, צביעת המטוקסילין-אאוזין, אימונוהיסטוכימיה, הכלאה במקום וצביעה</td></tr> <tr><td>תקופתית של חומצה-כסף מתנאמיןמגיב</td><td>כימי ג'לטין סינופארם בבייג'ינג</td><td></td><td>10010328 ציפוי שקופיות</td></tr><tr><td>זהב כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>379948</td><td>חומצה תקופתית-כסף מתנאמין מכתים</td></tr><tr><td>המטוקסילין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H3136</td><td>המטוקסילין-אאוזין מכתים</td></tr><tr><td>ערכת טיהור מוצר PCR טהור גבוה</td><td>Roche</td><td>11732668001</td><td>לטיהור מוצרי</td></tr> <tr><td>PCRתיבת טמפרטורה ולחות קבועה אינטליגנטית</td><td>Ningbo Jiangnan Instruments</td><td>HWS</td><td>לתחזוקת זבובים</td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>HyAgarose</td><td>14190108029</td><td>Pre-embation</td></tr><tr><td>מגיב כימי מתנול</td><td>סינופארם בבייג'ינג</td><td>10014108</td><td>Drosophila Embryo Collection</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>ZEISS</td><td>Observer.A1</td><td>צביעת המטוקסילין-אאוזין, אימונוהיסטוכימיה, הכלאה באתרה ושקופיות מיקרוסקופ צביעת חומצה-כסף מתנאמין תקופתיות</td></tr><tr><td></td><td>MeVid Labware Manufacturing</td><td>P105-2001</td><td>ציפוי שקופיות מגיב</td></tr><tr><td>כימי סינופארם מסטיק ניטרלי</td><td>בבייג'ינג</td><td>10004160</td><td>מגיב כימי המטוקסילין-אאוזין מכתים</td></tr><tr><td>N-הפטן</td><td>סינופארם בבייג'ינג</td><td>40026768</td><td>עובר דרוזופילה אוסף</td></tr><tr><td>פורס פרפין</td><td>מכשיר מדעי</td><td>Huahai HH-2508III</td><<td>em>In-situ הכלאה</td></tr><tr><td>פרפין</td><td>סינופארם מגיב כימי בבייג'ינג</td><td>69019461</td><td>פרפין הטמעת</td></tr><tr><td>מד pH/mV Sartorius</td><td></td><td>PB-10</td><td>לקביעת ערך ה-pH של תמיסה</td></tr><tr><td>סינדראט</td><td>כסף מגיב כימי סינופארם בבייג'ינג</td><td>10018461</td><td>חומצה תקופתית-כסף מתנאמין מכתים</td></tr><tr><td>מד מים אולטרה-טהור</td><td>Thermo</td><td>AFXI-0501-P</td><td>In-situ הכלאה</td></tr><tr><td>קסילן</td><td>סינופארם מגיב כימי בבייג'ינג</td><td>10023418</td><td>הטמעת פרפין</td></tr></tbody></table>

פרוטוקול לאימונוהיסטוכימיה והפצת rna in-situ בתוך עובר דרוזופילה מוקדם

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

איתות שחרור סידן המושרה בסידן (CICR) ממלא תפקיד קריטי בתהליכים ביולוגיים רבים. כל פעילות תאית מהתפשטות תאים ואפופטוזיס, התפתחות והזדקנות, לפלסטיות סינפטית עצבית והתחדשות קושרו עם קולטני ריאנודין (RyRs). למרות החשיבות של איתות סידן, המנגנון המדויק של תפקידו בהתפתחות מוקדמת אינו ברור. כאורגניזם עם תקופת הריון קצרה, העוברים של Drosophila melanogaster הם נושאי מחקר עיקריים לחקר ההפצה והלוקליזציה של חלבונים הקשורים CICR והרגולטורים שלהם במהלך הפיתוח. עם זאת, בגלל העוברים העשירים בשומנים שלהם וכוריון עשיר בכיטין, התועלת שלהם מוגבלת על ידי הקושי של הרכבה עוברים על משטחי זכוכית. בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול מעשי המגביר באופן משמעותי את ההתקשרות של עובר Drosophila על שקופיות ושיטות פירוט עבור היסטוכימיה מוצלחת, אימונוהיסטוכימיה, הכלאה in-situ . שיטת ציפוי החלקת הג'לטין של אלום כרום ושיטת טרום ההטבעה של העובר מגדילה באופן דרמטי את התשואה בחקר חלבון העובר של דרוזופילה וביטוי RNA. כדי להדגים גישה זו, חקרנו DmFKBP12 / Calstabin, רגולטור ידוע של RyR במהלך התפתחות עוברית מוקדמת של Drosophila melanogaster. זיהינו את DmFKBP12 כבר בשלב blastoderm הסינכיטיאלי ולדווח על דפוס הביטוי הדינמי של DmFKBP12 במהלך הפיתוח: בתחילה כחלבון מבוזר באופן שווה ב blastoderm סינסיטיאלי, ולאחר מכן לוקליזציה מראש לשכבת המרתף של קליפת המוח במהלך blastoderm הסלולר, לפני הפצה בארכיטקטורה העצבית והעיכול הפרימיטיבית במהלך שלב שלוש אבני חן בשלב גסטרולציה מוקדמת. התפלגות זו עשויה להסביר את התפקיד הקריטי ש-RyR ממלא במערכות האיברים החיוניות שמקורן בשכבות אלה: הגנגליון התת-ושט והסופר-ושט, מערכת העצבים הגחונית ומערכת השלד והשרירים.

הדמויות מתארות פרוטוקולים המשמשים להתגבר על האתגר של חיבור עוברי שומנים גבוהים המכילים שומנים וכיטין Drosophila (טבלה 1) למשטח שקופית הזכוכית לבדיקה וניסויים. תוך שימוש בשיטת ציפוי השקופיות של אלום כרום ג'לטין המוצגת באיור 1, שיפרנו את החיבור של עוברים Drosophila על פני השטח של שקופיות בעוד שיטת טרום ההטבעה של העובר המוצגת באיור 2 מאפשרת בדיקה יעילה של ההתפלגות הדינמית של חלבון ורנ"א DmFKBPP12/Calstabin בכל ארבעת שלבי הפיתוח המ...

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לגילוי ולוקליזציה של חלבון עובר Drosophila ו- RNA מאוסף להטבעה והטבעה מראש, אימונוסטיור ו- mRNA בהכלאה במקום .

פרוטוקול לאימונוהיסטוכימיה והפצת RNA In-situ בתוך עובר דרוזופילה מוקדם

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

כאורגניזם עם תקופת הריון קצרה, העוברים של Drosophila melanogaster הם נושאי מחקר עיקריים לחקירת הפצה ולוקליזציה של חלבונים והרגולטורים שלהם במהלך הפיתוח. עם זאת, בגלל העוברים העשירים בשומנים שלהם וכוריון עשיר בכיטין, התועלת שלהם מוגבלת על ידי הקושי של הרכבה עוברים על משטחי זכוכית. בעבודה זו, אנו מציגים שיטה מעשית המשפרת באופן משמעותי את ההתקשרות של עובר Drosophila על שקופיות ומפרטת את השיטות שלנו להיסטוכימיה מוצלחת, אימונוהיסטוכימיה והכלאה פנימית.לפני השלבים המוצגים כאן, יש לשטוף שקופיות בחומר ניקוי, ולאחר מכן לשטוף במי ברז ומים מזוקקים לפני שהוכנסו לתנור לייבוש. שקופיות יבשות צריך בעדינות להשרות אשלגן dichromate במשך 24 שעות לפני שטף מיובש שוב, ולאחר מכן להציב 95% אתנול במשך שעתיים לפחות. במהלך שלב זה, אתה יכול להכין שקופיות נוספות או אלום כרום-ג'לטין על פי השיטות שלנו.לאחר מכן ניתן לאחסן ג'לטין במי אמבטיה של 60 מעלות לפני השימוש. כדי לצפות שקופיות, יש להניח כמות קטנה של ג'לטין על קצה אחד של השקופית. לאחר מכן השתמש במגלשת זכוכית נוספת כדי לגרור באיטיות ובאופן שווה את הג'לטין על פני השטח של השקופית כדי להיות מצופה.זה יוצר שכבה דקה ואחידת. לפני לשים בארון תקשורת או מנגנון ייבוש להיות מאוחסן בתנור כדי לאפשר ייבוש מלא במשך לילה אחר או 48 שעות. העובר נאספים באמצעות צלחת אגר מיץ ענבים, פעם מוכן, צלחת אגר מיץ ענבים לאחר מכן ניתן להסיר.מציפים את הצלחת ב-PBS ומברישים בעדינות עם מברשת רכה כדי להסיר את כל העוברים המצורפים. הסר עובר המכיל PBS לצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר ולאפשר לנוח על קרח. לאחר העובר הם התיישבו על קרח, בעדינות להסיר את PBS supernatant.היזהר לא להפריע לעובר בתחתית הצינור. מוסיפים 1 מ"ל של 50% אקונומיקה לדגימה ומנערים בעדינות במשך שתי דקות. הסר את האקונומיקה על ידי סינון ולשטוף עוברים ב- PBS שלוש פעמים.הכן n-heptane. ברגע שהם מוכנים, שטפו את העוברים מנייר הסינון לתוך n-heptane על ידי ניעור נייר הסינון בעדינות בתמיסה. אפשר לעוברים להתיישב בתחתית צלחת n-heptane ולאסוף את זה n-heptane לתוך צינור צנטריפוגה חדש 1.5 מיליליטר.הוסף מיליליטר אחד של מתנול לצינור, לאפשר את הפתרון לזרז ולאחר מכן לשאוף את מתנול n-heptane. לשטוף את העובר ב PBS שלוש עד חמש פעמים כדי להסיר מתנול שיורית. הסר PBS נוסף זה ולהוסיף את Bouin של fixative ולאפשר להסתפק במשך 30 עד 60 דקות על מנת לתקן את העוברים.הסירו את הקיבוע של בוין ושטפו שוב את העוברים ב-PBS שלוש פעמים. הכן 1.2% agarose ב- PBS ולשמור על חום באמבט מים 60 מעלות ולאחר מכן להכין את העוברים להטמעה על ידי שאיפה עדינה PBS נוסף כי זה כבר מאוחסן. היזהר לא להפריע לעוברים בתחתית, ולאחר מכן לשאוף את תקע העובר בתחתית הפתרון ומניחים בעדינות לתוך תבנית פקק בקבוק.שאפו כל PBS נוסף מתבנית זו לפני הוספת 1.2% ג'ל agarose. הכן פתרון של PBS כדי לאחסן תקעים אלה agarose. לאחר התגבשות האגרווז, תקעים בודדים לאחר מכן ניתן להעביר לתוך PBS זה לאחסון.כאן אנו מראים את תהליך התייבשות רציף. מאפשר 15 דקות לדגירה בכל פעם. לאחר מכן להסיר מן 100% אתנול ולתקן בתמיסה אחד על אחד של אתנול וקסילן במשך 15 דקות נוספות.לאחר הסרת פתרון זה אחד על אחד, להסיר קסילן טהור במשך דקה אחת. עכשיו דגימת הרקמה מוכנה להעברה לתמיסת פרפין קסילן מחוממת של אחד על אחד. אפשר לשבת 30 דקות לפני ההטבעה הסופית ב-100% פרפין.עבור לראשון של 100% פרפין ולנוח במשך שעתיים. חזור על תהליך זה בשניים ושלושת הפרפינים שלו. המדגם מוכן כעת להעברה לתבנית ולתבנית המלאה בשעווה כדי להשלים את תהליך ההטבעה.הטמעה של עוברים דרוזופילה. מניחים חלקי פרפין מוכנים של עוברים Drosophila בתנור 60 מעלות במשך 15 דקות. מניחים אותם בתמיסה של 100% של קסילן.לאחר מכן אנו מתחילים בהתייבשות. מקם את השקופיות בכל אחד מפתרונות אלה למשך שלוש דקות כל אחת. ברגע שהמגלשה נמצאת במים מזוקקים, מניחים בתמיסת המטוקסילין למשך שתי דקות.לאחר השלמת הקפד לנקז כמה שיותר של הפתרון ככל האפשר מן השקופית. לאחר השקופית נשטפה במים מזוקקים, ולאחר מכן להכתים את השקופית אאוזין במשך דקה אחת. לבסוף, להסיר את השקופית מן אאוזין לשטוף במים מזוקקים.ברגע שהשקופית הזו תהיה נקייה, אנחנו מתחילים עכשיו את תהליך ההתייבשות הסופי שלנו. לבסוף להיות ממוקם לתוך 100% קסילן במשך חמש דקות. תהליך זה חוזר על עצמו בשני פתרונות חדשים של 100% קסילן ומפיל כמות קטנה של מסטיק נייטרלי לאורך קצה אחד של השקופית.קח את החלקת הכיסוי הזו ומקם בעדינות בקצה אחד של השקופית. ראשית deparaffinize השקופיות על ידי הצבת 100% קסילן. ברגע שהמגלשות מוסרות ממים מזוקקים, הן צריכות להיות מכוסות בתמיסת חומצה תקופתית של 1%.לאחר מכן אנו משליכים את התמיסה העודפת ושוטפים במים מזוקקים. על-ידי מיקום השקופית ישירות בפתרון שחומם מראש. ברגע שזה הושלם אנחנו שוטפים את השקופית במים מזוקקים ולאחר מכן לצבוע את הפתרון עם 0.2% כלוריד זהב במשך דקה עד שתי דקות.לאחר מכן, אנחנו לתקן את הרקמה עם 3% נתרן thio סולפט במשך שלוש דקות באמצעות מים מזוקקים. ואז נגד ההמטוקסילין. לאחר ההטיה הנגדית, ניתן לשטוף את הכתם עם כל צינור של מים מזוקקים כפי שמוצג כאן.ואז נעבור לתהליך ההתייבשות. בצע את זה על ידי הצבת השקופיות ישירות לתוך 100% xylene ולאחר מכן להחיל כמות קטנה של מסטיק ניטרלי על הפינה של השקופית. יש לכסות בעדינות בתעודת כיסוי.התחל להכין את השקופיות כבעבר על-ידי ביטול פענוח וקסילן. ואז באחד על אחד קסילן אתנול. ברגע שהשקופיות מתפרקות, אנחנו מתחילים לייבש מחדש את הרקמה שלהן ואז סוף סוף ב-PBS.מניחים את השקופיות ב 0.3% מי חמצן שנעשו מתנול במשך 10 דקות. לאחר מכן השקופיות מכוסות ב- 20 mLs של פתרון אחזור יעד. לאחר מכן ניתן למקם את השקופיות בתיבת הכתמים.מניחים את קופסת הכתמים בתוך ספינת קיטור, ומוודאים ששום פתרון לא בורח והמגלשות עדיין מכוסות לחלוטין. שים לב כי מכסה תיבת הכתמים לא צריך להיות סגור לחלוטין, כך אדי מים יכולים לברוח במהלך תהליך האידוי. ואז שטיפה עדינה בPBS-T שלוש פעמים.להשליך את הפתרון העודף ולחזור על התהליך, הפעם עם PBS. לאחר מכן, אנו מדגרים את השקופיות בבלוק מי חמצן במשך חמש עד 10 דקות ולאחר מכן לשטוף מספר פעמים שוב ב- PBS-T ולאחר מכן ב- PBS. הכינו את הנוגדן ושחררו ישירות על הרקמה.לאחר מכן ניתן לדגור על רקמות אלה או בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות. הנוגדן המשני צריך להיות דגירה בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות, אשר מכתים עם 5% DAB במשך שתיים עד 10 דקות. לאחר קבלת הצבע המתאים, לשטוף במים מזוקקים, ולאחר מכן counterstain בהמטוקסילין.לאחר כתם המטוקסילין זה, השקופיות יכולות להיות מיובשות ברצף. מניחים את השקופיות לתוך 100% קסילן ולאפשר להשרות במשך שלוש דקות. לאחר מכן זרוק כמויות קטנות של מסטיק ניטרלי על קצה אחד של השקופית.לאחר הנחת מסטיק, קחו את כיסוי השקופית והניחו בעדינות מקצה אחד של המגלשה. הוסף מיקרוגרם אחד של DNA תבנית ליניארית מטוהרת לבקבוקון תגובה סטרילי ללא RNase. לאחר מכן הוסיפו מספיק DEPC סטריליים ללא RNase שטופלו במים מזוקקים כפולים כדי ליצור נפח מדגם כולל של 13 מיקרוליטרים.ואז צנטריפוגה לזמן קצר ודגרה במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס. עבור ניסויי הגנה RNase, אנו ממליצים דגירה במשך 15 דקות עם שני מיקרוליטרים של Dnase-1, ללא RNase כדי להסיר DNA תבנית. לאחר השלמת שלב הדגירה, עצרו את התגובה על ידי הוספת שני מיקרוליטרים של 0.2 טוחנת EDTA ב-pH של שמונה.לפני השלבים להראות כאן השקופיות היו deparaffinized rehydrated, על פי הפרוטוקול שלנו הודגם בעבר. לאחר rehydration לדגור השקופיות 0.01 שומה לליטר PBS ב pBS ב pH של 7.4 במשך חמש דקות כל אחד כדי להסיר את הפתרון הקיבוע מן הרקמה. לאחר השטיפה ב- PBS, אנו שוטפים לאחר מכן עם תמיסת גליצין 100 מילימולרית לליטר במשך חמש דקות פעמיים כדי להסיר קבוצות אלדהיד בחינם מהרקמה.לאחר שלב זה, לשטוף שקופיות עם PBS במשך חמש דקות. לאחר מכן, דגירה ב- PBS המכילה 0.3% טריטון X-100 במשך 15 דקות לפני השטיפה ולאחר מכן דגירה שוב עם מיקרוגרם אחד לכל מיקרוליטר של חלבוןאז K.Next, תקן שקופיות עם 4% paraformaldehyde ו- PBS ב- pH של 7.2 למשך שלוש דקות. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות לפני הדגירה עם 0.1 טוחן טריאתנולמין מאגר pH 8, המכיל 0.25% anhydride acetic.באפשרותך לבחור להטות את התיבה בשלב זה כדי להבטיח כיסוי מלא עם הפתרון. התיבה מוכנה על ידי הוספת 20% גליצרול או DEPC מים לתחתית תיבת הכלאה יבשה. לאחר מכן, לכסות את השקופיות ב 20 מיקרוליטרים של פתרון טרום הכלאה.דנ"א הזרע של הסלמון בריכוז של 100 מיקרוגרם למיליליטר לכל שקופית. ואז לדגור ב 42 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות. זה נעשה בקופסה לחה מוכנה מראש כדי להבטיח כי הפתרון אינו מתייבש במהלך תהליך זה.בשלב שלאחר ההיברידיה, חשוב מאוד שתמיסת ההיברידיזציה תשטוף לחלוטין מהדגימות שלכם. זה יכול להיעשות בשטיפה רצופה של 15 דקות ב 37 מעלות, באמצעות ארבע פעמים ריכוז SSC, פעמיים ריכוז כפול ריכוז אחד, 0.5 פעמים ריכוז ו 0.1 פעמים ריכוז SSC פתרון. כל דגירה במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.לאחר שזה נעשה, לשטוף עם PBS שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד לפני הוספת חיץ הכביסה. יש לשטוף את מאגר הכביסה במשך דקה אחת לפני השלבים הבאים ודאו שמאגר הכביסה יבש לחלוטין מהמגלשות לפני הוספת הפתרון הבא. הוסף 100 מיליליטר של פתרון חסימה לכל שקופית ודגר את השקופית במשך 30 דקות.מומלץ לעשות זאת בסביבה נטולת אור כדי להבטיח כתמים טובים. הבא לדגור השקופיות במשך 30 דקות שוב ב 20 mLs של תמיסת נוגדנים. החל את פתרון הנוגדנים ישירות על שקופיות לכיסוי מלא של הרקמה שלך.לאחר הדגירה הושלמה, להחיל 100 מיליליטר של חיץ כביסה. דגירה במשך 15 דקות בתנאים חופשיים קלים להסרת מצומדים נוגדנים לא מאוגדים. הסר את מאגר הכביסה.לאחר מכן, להחיל 20 מיליליטר של מאגר זיהוי מותר לדגור במשך כארבע דקות. לאחר ארבע דקות, הסר את מאגר הזיהוי. יבש את השקופיות כדי להבטיח שאין פתרון נוסף והוסף 10 מיליליטר של פתרון מצע צבע טרי מוכן.תגובה זו מתחילה תוך מספר דקות, אך היא הושלמה לאחר 16 שעות. אז אפשרו לדגור לתקופה זו של זמן במצב ללא אור. ברגע שהמקומות הרצויים שבהם מזוהות רצועות שוטפים את השקופית עם 50 מיליליטר של מאגר TE כדי לעצור את התגובה.ואז להשלים את תהליך ההתייבשות שהוכח בעבר שלנו ואת תהליך ההרכבה עבור מסטיק נייטרלי. איורים 1 ו-2 מדגימים את שיטת ציפוי הג'לטין מאלומיניום כרום עבור מקטעי פרפין ואת שיטת ההטבעה לפרופיל הביטוי של FKBP12 ו- DmFKBP12 בפיתוח עוברים דרוזופילה. איור 3 מראה את התפלגות החלבון של נוגדנים שזוהו FKBP12 בשלבי הבלאסטרודרמה התאית הסינכיטית.מן התוצאות היסטוכימיות האלה, ניתן לראות כי ביטוי FKBP12 הוא פחות מקוטב ב blastoderm הסינכיטיאלי, ואז מתחיל לוקליזציה בתוך קרום המרתף מתחת לאפיתל trophectoderm מודיע את ההדרגה עם ביטוי נוסף נמצא בקטבים הקדמיים והאחוריים. איור 4, העוקב אחר שלבי יחסי הגז המוקדמים והמאוחרים של העובר Drosophila מראה חלבון FKBP12 הופך מוגבל לרכיבים אדריכליים מסוימים של הרקמה העוברית הפרימיטיבית. עם התפלגות חוץ-תאית פחות מזו שנצפתה בשלבים עובריים גסטרו מוקדמים ומאוחרים.מעניין לציין כי התפלגות החלבון הדינמית המתוארת לעיל אינה מלווה בשינויים מקבילים ברמות ה-MRI של FKBP12 כפי שניתן לראות באיור חמש. מה שמצביע על ביטוי חלבון כתוצאה ממנגנון מולקולרי פוסט-תמלולי שעדיין לא ידוע. קולטן Ryanodine מתווך סידן איתות הוא מסלול בסיסי בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים של בעלי חוליות וחסרי חוליות כאחד.מוטציות בגן זה ידועות כגורמות להפרעות פיזיולוגיות רבות המובילות למחלות או למוות לבבי מוקדם. עם זאת, את התפקיד גן זה משחק בהתפתחות Drosophila מוקדם היה קשה ללמוד. כמרכיב מעבר של העובר, עובר עשיר בשומנים וכוריון עשיר בכיטין, להפוך את המחקרים של חלבון ביטוי עוברי בהתפתחות Drosophila מוקדם קשה.ציפוי השקופיות, הטמעת העובר והטכניקות האימונוהיסטוכימיות המתוארות במאמר זה אפשרו לנו ללמוד בפירוט את ההתפלגות הדינמית של חלבון קולטן ריאנודין ו- mRNA. אנו חולקים טכניקות אלה ואת התקווה כי הם יאפשרו לאחרים ללמוד חלבונים אחרים בשלבי פיתוח מוקדמים של Drosophila.

a-protocol-for-immunohistochemistry-rna-situ-distribution-within

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע אימונוהיסטוכימיה על הזחל תסיסנית גזור.

תסיסנית הזחל NMJ אימונוהיסטוכימיה

אנו מתארים את הליך להכין...

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

תסיסנית גלמי אימונוהיסטוכימיה בטן

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

צביעה חיסונית היא טכניקה יעילה להמחשת סוגי תאים וחלבונים ספציפיים בתוך רקמות. על ידי שימוש בסוניקציה, הפרוטוקול המתואר כאן מקל על הצורך לנתח רקמות Drosophila melanogaster מעוברים וזחלים בשלב מאוחר לפני צביעה חיסונית. אנו מספקים מתודולוגיה יעילה לצביעה חיסונית של זחלי הר שלמים קבועים בפורמלדהיד.

הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות<em&gt; באתר</em

אנו מתארים הליך רב-יעד chromogenic כל הר הכלאה באתר (MC-תרצה) בעוברים שלמים תסיסנית מאפשרים זיהוי סימולטני וספציפי של שלושה דפוסי הפצת mRNA שונים על ידי מנוגד משקעים צבע.

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

המתואר RNA בחיי עיר הכלאה פרוטוקול מאפשרת הגילוי של RNA כל עוברי דרוזופילה או רקמות גזור. באמצעות לוחות 96-ובכן microtiter tyramide אות הגברה, תעתיקים שניתן לאתר ברזולוציה גבוהה, רגישות, ואת התפוקה, בעלות נמוכה יחסית.

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

מוצג כאן פרוטוקול microinject ובו זמנית תמונה עוברי Drosophila מרובים במהלך התפתחות עוברית באמצעות צלחת מבוססת, דימוי תוכן גבוה.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

מחקר זה מציג פרוטוקול פשוט לעיבוד רקמות הכולל עריפת ראש, קיבוע, קריוסקציה, צביעה פלואורסצנטית, צביעה חיסונית והדמיה, שניתן להרחיב להדמיה קונפוקלית ורב-פוטונית. השיטה שומרת על יעילות דומה לדיסקציות מורכבות, ועוקפת את הצורך במיומנויות מוטוריות מתקדמות. ניתוח תמונה כמותי מספק פוטנציאל חקירה נרחב.

הקפאה ישירה של ראשי דרוזופילה לצביעה פלואורסצנטית משופרת של המוח וצביעה חיסונית

פרוטוקולים אלו מתארים כיצד לאפיין את הארגון ותפקוד החסימה של צמתקי מחיצה מקופלים באפיתל העוברי של דרוזופילה.

ניסויי צביעת חיסון וחדירת צבע להגדרת חלבוני צומת ספטט מקופלים בליבה באפיתל עוברי של דרוזופילה

למדו פרוטוקול לאימונוהיסטוכימיה והיברידיזציה in-situ בעוברי Drosophila melanogaster מוקדמים. השיטה משפרת את ההידבקות לזכוכית ומאפשרת הדמיית חלבונים ו-RNA בתהליכי התפתחות.

פרוטוקול לאימונוהיסטוכימיה והפצת RNA In-situ בתוך עובר דרוזופילה מוקדם

גלה סרטונים נוספים