Name: تحسين نمو بلورات الإندوثيابسين لتجارب علم البلورات التسلسلي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: اكتشف بروتوكولاً لتحسين نمو بلورات الإندوثيابسين الصغيرة لعلم البلورات التسلسلي باستخدام تقنيات التبلور الدفعي. يوفر هذا الإطار التجريبي قيمة للباحثين في علم الأحياء الهيكلي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تلقى هذا المشروع تمويلا من برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية منحة Marie Skłodowska-Curie رقم 701647. شكرا جزيلا لمساعدة ودعم علماء خط الشعاع في خط شعاع مصدر الضوء السويسري X10SA-PXII.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

توضح الطريقة المقدمة كيفية تحسين تبلور endothiapepsin من بلورات كبيرة (أطول بعد ≥ 100 ميكرومتر) ، نمت في شاشات متفرقة ذات مصفوفة 96 بئرا ، إلى بلورات دقيقة ، نمت في أنابيب طرد مركزي (حجم 300 ميكرولتر) عبر الدفعة. الفكرة وراء البروتوكول هي أن الخطوات المتخذة لتحسين endothiapepsin يمكن استخدامها أيضا للبروتينات الأخرى. في نهاية المطاف ، الإجابة على مشكلة إنشاء كميات كبيرة (>100 ميكرولتر) من البلورات الدقيقة (10-20 ميكرومتر) لتجارب علم البلورات التسلسلية في XFELs والسنكروترونات.
يقسم البروتوكول مهمة التبلور الدقيق كبير الحجم إلى ثلاث خطوات: (1) تحسين مورفولوجيا البلورة ، (2) الانتقال إلى الدفعة ، و (3) التحجيم. في الخطوة 1 ، يجب استكشاف مجموعة الأشكال البلورية التي يمكن أن ينتجها البروتين في ألواح انتشار البخار. يجب أن تكون الظروف التي تؤدي إلى بلورات مفردة تشبه الصندوق تنحرف إلى الدقة المطلوبة هي الهدف. في الخطوة 2 ، يمكن بعد ذلك تحويل الظروف المحددة من انتشار البخار إلى الدفعة. هنا ، معيار التحسين هو وقت نمو البلورات وإيجاد الظروف التي تؤدي إلى بلورات البروتين في غضون 24 ساعة. يمكن أيضا رسم مورفوجرام لإعطاء المجرب فكرة عن موقع خط الذوبان وحدود منطقة النواة. هذا المورفوغرام له فائدة كبيرة في الخطوة 3 ، التحجيم. سيعطي المورفوجرام مؤشرا على ما إذا كانت النواة وحدها يمكن أن تزيد Xn وتدفع Xs إلى أسفل. مع زيادة حجم التجربة ، يمكن تقييم Xn و Xs باستمرار كمعايير رئيسية لتوسيع نطاق النجاح.
في حالة Endothiapepsin ، اكتشفت الخطوة 1 ما يحتمل أن يكون مورفولوجيا بلورية غير معروفة سابقا ل endothiapepsin. كان لهذا التشكل نفس المجموعة الفضائية مثل تلك التي تم الإبلاغ عنها سابقا ، ولكن الأهم من ذلك بالنسبة لعلم البلورات التسلسلي ، شكل يشبه الصندوق. يبدو أيضا أن البلورات المفردة تنمو من نقاط نواة مفردة ، على عكس المراوح التي تم إنشاؤها من ظروف أخرى (الشكل 4). بالنسبة للحالة المحددة ، كانت الخطوة 2 راضية جزئيا بالفعل حيث حدث نمو بلوري في < 24 ساعة. أشار المورفوجرام إلى أن كلا من بروتوكول الدفعات المستقيمة أو المصنفة قد يكون ناجحا عند التوسع في الخطوة 3. أدى التحجيم الأولي في دفعة مستقيمة إلى إنشاء حالة أنتجت بلورات بنطاق Xn و Xs من 3.6 ± 1.2 × 106 بلورات · mL-1 و 42 ± 4.1 ميكرومتر ، على التوالي. هذه البلورات ، على الرغم من أنها مقبولة لبعض تجارب علم البلورات التسلسلي ، اعتبرت كبيرة جدا. لذلك تم إجراء تحسينات إضافية. أنتج البروتوكول النهائي بلورات بتركيز ونطاق حجم 3.1 × 106 بلورات · مل -1 و 15 ± 3.9 ميكرومتر ، على التوالي. كان هذا أكثر من مثالي للتجارب المخطط لها.
تركز الطريقة على تحويل بلورات البروتين "القابلة للذوبان" المزروعة في ألواح انتشار البخار إلى دفعة. والسبب في هذا التركيز هو أن الغالبية العظمى من بلورات البروتين القابلة للذوبان تزرع عن طريق انتشار البخار26. ومع ذلك ، يمكن أيضا تطبيق المفاهيم المقدمة على بلورات البروتين القابلة للذوبان المزروعة باستخدام طرق أخرى ، مثل الدفعة الدقيقة. قد تكون المفاهيم قابلة للتطبيق أيضا على بلورات البروتين الغشائية المزروعة في LCP. لأن هذه أيضا عملية بلورة دفعية.
يتمثل أحد الجوانب الرئيسية للبروتوكول في عملية تحويل ظروف البلورات المزروعة في ألواح انتشار البخار بحيث يمكن زراعتها دفعة واحدة. لهذا التحول ، تستخدم الطريقة المعيار الذي اقترحه Beale et al. (2019) 26. تتشكل البلورات المزروعة عبر عملية الدفعات ، حتى في ألواح انتشار البخار ، بسرعة (< 24 ساعة). هذا المعيار هو تقريب يعتمد على سرعة توازن انخفاض انتشار البخار ، وهو أكثر صحة بالنسبة لظروف الراسب القائمة على PEG. ومع ذلك ، ستحتوي ظروف التبلور على مجموعة متنوعة من المركبات التي ستؤثر على وقت التوازن. يمكن أن يحدث توازن ظروف التبلور القائمة على الملح ، على سبيل المثال كلوريد الأمونيوم عالي التركيز ، في 1-2 أيام. لذلك ، قد لا يكون معيار 24 ساعة صحيحا بالنسبة للظروف القائمة على الملح. يمكن أن تحتوي الظروف القائمة على الملح أيضا على مخططات طور أكثر تعقيدا 26,30 قد لا تتوافق مع النموذج الأصلي المقدم في هذا البروتوكول. قد يكون من الضروري تقليل المعيار الزمني للظروف القائمة على الملح إلى 12 أو 6 ساعات إذا ثبت أن التوسع إلى أحجام أكبر مستحيل.
قيد آخر لهذه الطريقة هو تعقيدها الواضح. البروتوكول الذي تم اتباعه لتحسين التبلور الدقيق للإندوثيابسين غير الحالة الأصلية من شاشة المصفوفة المتناثرة قليلا نسبيا. كانت الضربة الأولى التي لوحظت في شاشة PACT هي 0.1 HEPES pH 7.0 و 0.2 M MgCl2 و 20٪ (وزن / حجم) PEG 6000. كان المخزن المؤقت النهائي للتبلور المتدرج 0.1 Tris-HCl pH 7.0 و 0.15 M MgCl2 و 40٪ (w / v) PEG 6000. من الممكن أيضا أن يكون التغيير في المخزن المؤقت من HEPES إلى Tris-HCl ، وتركيز MgCl2 ، قد ساهم قليلا في نجاح العملية. ترك الزيادة في تركيز PEG 6,000 هو التحسين الوحيد ، والذي كان من الممكن تحقيقه بكل بساطة.
غير أن هذا التقييم مفرط في التبسيط. إنه لا يقلل فقط من المشاكل التي تواجهها أثناء التحجيم (أي استخدام البذور والتبريد) ، ولكن أيضا حقيقة أنه لمجرد أن هذا البروتين أثبت أنه واضح ومباشر ، فليس هناك ما يضمن أن البروتين التالي سيثبت أيضا. تم وضع الخطوات الموصى بها في البروتوكول لأن تحسين حجم أحجام بلورة البروتين يمكن أن يكون مكلفا للغاية بالنسبة للبروتين. خلال تجارب تحجيم الإندوثيابسين السبع الموضحة ، تم استهلاك 100 ملغ من البروتين. ومن المسلم به أن بعض هذه الخطوات قد نفذت لإظهار عواقبها في ضوء هذا البروتوكول. ومع ذلك ، فإن 100 ملغ من البروتين ، بالإضافة إلى 50 ملغ أخرى للبروتين المستهلك أثناء التجربة (الجدول 1) ، يمكن أن يكون استثمارا كبيرا في الوقت أو المال.
لحسن الحظ ، ليس من الواضح أن هذه الكتلة من العينة المطلوبة موجودة في كل مكان عبر جميع البروتينات. كان Endothiapepsin قابلا للذوبان بدرجة عالية ، وبالتالي يتطلب تركيزا كبيرا من البروتين للوصول إلى التشبع الفائق. في حالات أخرى (قيد التحسين حاليا) ، يمكن الوصول إلى التشبع الفائق عند 10 أو حتى 5 مجم / مل. هذه المتغيرات خاصة بالبروتين وتحتاج إلى تبنيها عند ظهورها.
تشمل القيود الأخرى للطريقة اعتمادها على المعدات المعقدة مثل روبوتات معالجة السوائل لإنشاء الشاشة واللوحة ، وأجهزة التصوير لتصوير اللوحات تلقائيا عند الحاجة. تم تقديم إجراءات بديلة للحد من الحاجة إلى بعض هذه القطع من المعدات ، لكن البروتوكول سيستغرق وقتا أطول للمتابعة بدونها. يقترح البروتوكول أيضا اختبار حيود البلورات المحسنة. بالنسبة لعلماء البلورات الذين ليس لديهم وصول منتظم إلى السنكروترون ، قد تكون هذه الاختبارات صعبة. قد لا تكون عناصر التحكم في كل خطوة ضرورية ، ولكن يوصى بشدة بهذه الاختبارات بمجرد تحديد النتيجة ، وقبل القياس وبعده. البلورات غير الحيود في XFEL ، للأسف ، ليست أمرا غير شائع. بالنظر إلى هذا ، من الأفضل أن نخطئ في جانب الحذر فيما يتعلق بالافتراضات حول حيود البلورة.
في النهاية ، سيقدم هذا البروتوكول والنتائج المعروضة هنا دليلا وأفكارا ومثالا لأولئك الذين يكافحون من أجل إنتاج عينات لتجارب علم البلورات التسلسلية. ومن المأمول، مع زيادة تطوير علم البلورات التسلسلي، أن تقل متطلبات العينات لهذه التقنية بحيث تقل الحاجة إلى بروتوكولات كهذه. ومع ذلك ، حتى في هذا الحدث ، ستظل الاستراتيجيات المقدمة هنا مفيدة لأولئك الذين يرغبون في استكشاف مساحة تبلور البروتين الخاصة بهم.

<table><tbody><tr><td>Swissci 96 بئر 2 إسقاط لوحات</td><td>الأبعاد الجزيئية</td><td>MD11-002</td><td>96 بئر 2 قطرة لوحة تبلور</td></tr><tr><td>سويتشي 96 بئر 3 قطرات لوحات</td><td>الجزيئية</td><td>MD11-003</td><td>96 بئر 3 قطرات لوحة</td></tr><tr><td>تبلور البعوض LCP معالجة السوائل</td><td>روبوت sptlabtech</td><td>البعوض LCP</td> روبوت <td>التبلور</td></tr><tr><td>ClearVue الأبعاد</td><td>الجزيئية</td><td>MD6-015</td><td>أختام لوحة التبلور 96 جيدا</td></tr><tr><td>أنبوب آمن 1.5 مل</td><td>أنابيب الطرد المركزي Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1.5 مل مشرط</td></tr><tr><td>Scaple</td><td>Swan و Morton</td><td>رقم 3 مشرط ومقبض رقم 3</td><td>مشرط لقطع أختام اللوحة المفتوحة</td></tr><tr><td>MS 3 Vortex</td><td>IKA</td><td>3319000</td><td>Vortex لخلط المحلول وصنع مخزون البذور</td></tr><tr><td>24 بئر XRL</td><td>لوحة الأبعاد الجزيئية</td><td>MD3-11</td><td>24 بئر معلقة لوحات إسقاط</td></tr><tr><td>أنبوب مسدس / دوار</td><td>ثيرمو فيشر Scientific</td><td>88881001</td><td>أنبوب مسدس لخلط الحل أثناء التحجيم</td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus الماصات</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>مجموعة الماصات اليدوية ، 0.5-10 ، 1-20 ، 10-100 ، 100-1000 & L</td></tr><tr><td>أطراف ماصة Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>مجموعة من أحجام الأطراف للماصات اليدوية</td></tr><tr><td>Suparen 600</td><td>Prochem AG</td><td>Suparen 600</td><td>محلول Endothiapepsin</td></tr><tr><td>أسيتات الصوديوم</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>241245-1KG</td><td>أسيتات الصوديوم</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>8382T014</td><td>تريس</td></tr><tr><td>كلوريد المغنيسيوم</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-1kg</td><td>كلوريد المغنيسيوم</td></tr><tr><td>PEG 6,000</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>81255-1 كجم</td><td>PEG 6,000</td></tr><tr><td>إيثيلين جلايكول</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>324558-1L</td><td>إيثيلين جلايكول لحماية البلورات</td></tr><tr><td>PACT Premier HT شاشة</td><td>الأبعاد الجزيئية</td><td>MD1-36</td><td>PACT Premier شاشة كريستال 96 جيدا</td></tr><tr><td>DOW CORNING الشحوم عالية الفراغ</td><td>الأبعاد الجزيئية</td><td>MD6-02</td><td>الشحوم لختم الألواح ذات 24 بئرا</td></tr><tr><td>شرائح غطاء Hirschmann 22 × 22 مم</td><td>شرائح غطاء Hirschmann</td><td>8000104</td><td>لإغلاق ألواح إسقاط الجلوس 24 بئر</td></tr><tr><td>دبابيس كريستال</td><td>PSI</td><td>مصنعة داخليا</td><td>يدعم الأغشية الرقيقة للبلورات الدقيقة.</td></tr><tr><td>1-1.3 مم SiLibeads Type S</td><td>Faust</td><td>6239547</td><td>خرز زجاجي لصنع مخزون بذور</td></tr><tr><td>ميكرو ماك بوك برو</td><td>أبل</td><td>ماك بوك برو</td><td>كمبيوتر لإجراء تحليل البيانات</td></tr><tr><td>مجموعة برامج CCP4</td><td></td><td>برنامج معالجة</td><td>بيانات نمط الحيود</td></tr><tr><td>برنامج Excel</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Office</td> أداة <td>التخطيط لمخطط</td></tr> <tr><td>المرحلةغرفة العد العلمية للخط الساطع</td><td>Hausser Thermo Fischer Scientific</td><td>02-671-51B</td><td>أداة لحساب تركيز البلورات</td></tr><tr><td>PACT Premier</td><td>الأبعاد الجزيئية</td><td>MD1-29-ECO</td><td>شاشة بلورة مصفوفة متناثرة</td></tr><tr><td>Rock</td><td>Imager Formulatrix</td><td>Rock Imager</td><td>تخزين الألواح البلورية التي يتم التحكم فيها في درجة الحرارة والتصوير</td></tr><tr><td>Rock MakerWeb</td><td>Formulatrix</td><td>Rock MakerWeb</td><td>إنشاء لوحة الكريستال وتخزين الصور stoftware</td></tr><tr><td>Formulatrix</td><td></td><td>Formulator</td><td>96 بئر كريستال شاشة إنشاء روبوت مناولة السوائل</td></tr><tr><td>Leica MZ16 مجهر</td><td>Leica</td><td>Leica MZ16</td><td>المجهر الخفيف</td></tr><tr><td>LAS V4.6</td><td>Leica</td><td>LAS V4.6</td><td>برنامج لمجاهر Leica</td></tr><tr><td>Spectra / Por 3.5 kDa أنابيب غسيل الكلى</td><td>Spectrumlabs</td><td>Spectra / Por 3 غشاء غسيل الكلى</td><td>3.5 كيلو دالتون غشاء غسيل الكلى</td></tr><tr><td>إغلاق أنابيب غسيل الكلى</td><td>Spectrumlabs</td><td>Spectra / Por 3 Duniversal Closures</td><td>Clips لإغلاق نهايات أنابيب غسيل الكلى</td></tr><tr><td>Amicon 10 kDa مكثف الطرد المركزي</td><td>Merck-Millipore</td><td>Amicon Ultra-15 10 kDa مكثف الطرد المركزي</td><td>10 كيلو دالتون مرشح الطرد المركزي</td></tr><tr><td>5810 R دلو التأرجح جهاز الطرد المركزي</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R أجهزة الطرد</td> <td>المركزيجهاز طرد مركزي دلو متأرجح</td></tr></tbody></table>

تحسين نمو بلورات الإندوثيابسين لتجارب علم البلورات التسلسلي

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتسهيل إنشاء كميات كبيرة (> 100 ميكرولتر) من الملاط البلوري الدقيق المناسب لتجارب علم البلورات التسلسلي في كل من السنكروترونات و XFELs. تعتمد الطريقة على فهم مخطط الطور البلوري للبروتين ، وكيف يمكن استخدام هذه المعرفة. تنقسم الطريقة إلى ثلاث مراحل: (1) تحسين التشكل البلوري ، (2) الانتقال إلى الدفعة ، و (3) التحجيم. تتضمن المرحلة 1 العثور على بلورات مفردة حيود بشكل جيد ، نأمل ولكن ليس بالضرورة ، في شكل يشبه المكعب. في المرحلة 2 ، يتم تحسين حالة المرحلة 1 من خلال وقت نمو البلورة. يمكن لهذه الاستراتيجية تحويل البلورات المزروعة عن طريق انتشار البخار إلى دفعة. بمجرد أن يحدث نمو بلوري في غضون 24 ساعة تقريبا ، يمكن رسم مورفوجرام للبروتين وخليط الراسب واستخدامه كأساس لاستراتيجية التحجيم (المرحلة 3). عندما يمكن زراعة البلورات دفعة واحدة ، يمكن محاولة التحجيم ، وتحسين حجم البلورة وتركيزها مع زيادة الحجم. تم استخدام Endothiapepsin كبروتين توضيحي لهذا البروتوكول. بعض القرارات المقدمة خاصة بالإندوثيابسين. ومع ذلك ، من المأمول أن تلهم الطريقة التي تم تطبيقها بها طريقة للتفكير في هذا الإجراء يمكن للآخرين تكييفها مع مشاريعهم الخاصة.

الهدف من هذه المقالة هو إعطاء المشاهد فهما قويا لكيفية تحويل بروتوكول انتشار البخار صغير الحجم ، لزراعة بلورات بروتينية كبيرة مفردة ، إلى طريقة تبلور دقيق دفعة كبيرة الحجم لعلم البلورات التسلسلي.

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

يمكن أن تكون تجارب علم البلورات التسلسلي صعبة. العقبة الرئيسية في ممارستهم هي إنشاء عينات الجريزوفولفين. يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن إنشاء هذه العينات بشكل موثوق.تستخدم هذه الطريقة endothiapepsin لإعطاء إطار لتحسين البلورات الكبيرة المزروعة في ألواح انتشار البخار صغيرة الحجم إلى ملاط الجريزوفولفين كبير الحجم. لا يمكننا الادعاء بأن هذا البروتوكول سيكون ناجحا عالميا. ومع ذلك ، نأمل أن الأفكار والأساليب المقترحة هنا تعطي الآخرين إطارا تجريبيا لتوظيفه على البروتينات الأخرى.للبدء ، قم بإعداد صفيحة بئر 96 قطرتين باستخدام مخزن التبلور باستخدام روبوت Formulatrix. باستخدام مزيج روبوت مناولة السوائل ، امزج 150 نانولترا من إندوثيابسين المذاب حديثا مع 150 نانولترا من مخزن التبلور في كل بئر. أغلق اللوحة واترك البلورات تنمو لمدة 24 ساعة داخل فندق Formulatrix.بعد 24 ساعة ، قم بتفتيت وإزالة البلورات من خمسة آبار من لوحة التبلور المكونة من 96 بئرا. ضعها في 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتبلور في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر يوضع في دلو ثلج. أضف 10 إلى 15 حبة زجاجية بحجم ملليمتر واحد في أنبوب الطرد المركزي.دوامة البلورات والخرز عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية ، واستبدالها على الجليد لمدة 30 ثانية. يمكن بعد ذلك استخدام البذور على الفور أو تخزينها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. لإجراء تجربة مورفوجرام ، أضف خمسة إلى 40٪ تركيزات من PEG 6000 مع ضرس واحد Tris-HCl عند الرقم الهيدروجيني سبعة و 0.15 مولار كلوريد المغنيسيوم على طول أعمدة اللوحة لشاشة شبكية ذات قطرتين 96 بئرا إصلاح التخفيف المتسلسل للإندوثيابسين في 0.1 أسيتات الصوديوم المولية من 100 إلى 12.5 ملليغرام لكل ملليلتر على ثماني خطوات.ثم ماصة ثمانية ميكرولتر من كل تخفيف متبوعا باثنين ميكرولتر من مخزون البذور في لوحة روبوت مناولة السوائل. باستخدام روبوت مناولة السوائل ، قم بتوزيع 150 نانولترا من كل تخفيف للإندوثيابسين في الآبار الفرعية الأولى والثانية من الشاشة. متعدد الشفط 50 نانولترا من مخزون البذور المذابة و 100 نانولتر من محلول البئر من البئر الفرعي الثاني ووزع كلاهما في محلول البروتين.امزج المحاليل ثلاث مرات عند إضافة محلول التبلور أو محلول التبلور ومزيج البذور. الآن أغلق اللوحة والصورة عند صفر وثلاث وست و 12 و 18 و 24 ساعة من اليوم الأول كل يوم للأسبوع الأول وكل أسبوع للأسابيع الأربعة التالية عند 20 درجة سلزية. بعد 24 ساعة ، انظر إلى اللوحة تحت المجهر ، وقم بتقدير عدد البلورات داخل كل بئر وقياس عينة من البلورات.سجل هذه التقديرات في ورقة عمل مولد مورفوجرام المقدمة. أدخل تركيزات البداية من endothiapepsin و PEG 6000 في الصناديق المناسبة. ستقوم ورقة العمل تلقائيا برسم النتائج بتنسيق مخطط الطور التقليدي مع تركيزات المرسب والبروتين على المحور X و Y على التوالي.تشير ظروف البئر التي تؤدي فقط إلى ظهور بلورات في قطراتها المصنفة إلى منطقة MetaStable في الرسم البياني ، في حين أن الظروف مع البلورات في كل من القطرات المصنفة وغير المصنفة تشير إلى منطقة النواة. من تحليل المورفوغرام ، حدد الشرط الواعد للتوسع إلى 24 لوحة بئر. ثم ابدأ ب 100 ملليغرام لكل ملليلتر من إندوثيابسين و 35٪ PEG 6000.تحضير خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت للتبلور مع 35٪ PEG 6000 ، 0.1 مولار Tris-HCl مع الرقم الهيدروجيني سبعة ، و 0.15 كلوريد المغنيسيوم المولي. الآن ضع 0.5 ملليلتر من المخزن المؤقت للتبلور في ثلاثة آبار من لوحة إسقاط معلقة مدهونة ب 24 بئرا. امزج 15 ميكرولترا من الإندوثيابسين مع 15 ميكرولترا من محلول التبلور على زلة غطاء زجاجي.ضع المحلول فوق الآبار واترك الطبق لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، انظر إلى اللوحة تحت المجهر ، وقم بتقدير عدد البلورات في القطرة ، وقياس حجمها. إذا كانت البلورات غير صحيحة ، كرر هذه الخطوة ، ولكن قم بتغيير تركيز البروتين أو أضف البذور إذا لم تكن نواة البلورة عالية بما يكفي.كرر تجربة تحجيم 24 بئرا عن طريق إضافة البذور بتركيز أعلى من PEG 6000. ضع 0.5 ملليلتر من مخزن التبلور الجديد في ثلاثة آبار من صفيحة معلقة مدهونة ب 24 بئرا. ضع 15 ميكرولترا من إندوثيابسين على غطاء زجاجي واخلط خمسة ميكرولترات من مخزون البذور و 10 ميكرولترات من محلول التبلور مع محلول إندوثيابيبسين.اقلب زلات الغطاء ، وضعها فوق الآبار ، واتركها لمدة 24 ساعة. أعد فحص القطرات لمعرفة ما إذا كانت البلورات أصغر حجما ولها تركيز أعلى. قم بتقدير عدد البلورات في القطرة وقياس حجمها مرة أخرى لمعرفة ما إذا كانت الآن بالحجم الصحيح.لتنفيذ بروتوكول دفعة البذور ، قم بإعداد المخزن المؤقت للتبلور بنسبة 40٪ PEG 6000 ، و 0.1 مولار Tris-HCl مع درجة حموضة سبعة ، و 0.15 مولار كلوريد المغنيسيوم. امزج مسبقا 50 ميكرولترا من مخزون البذور و 100 ميكرولتر من محلول التبلور ، واخلطه بمحلول البروتين في أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر. دوامة الأنبوب لمدة 10 ثوان ووضعه على الروك أو شاكر عند 20 درجة مئوية.خذ حصصة 2.5 ميكرولتر من محلول الدفعات كل 20 دقيقة. مراقبة حجم وعدد البلورات باستخدام مقياس الدم. احسب عدد البلورات وقياس حجمها تحت المجهر.عندما تصل البلورات إلى حوالي 15 ميكرون ، قم بإخماد التفاعل ب 150 ميكرولتر من 0.5 مولار أسيتات الصوديوم المكملة ب 0.5 مولار Tris-HCl و 0.075 مولار كلوريد المغنيسيوم و 20٪ PEG 6000. أعد فحص حجم البلورة وتركيزها باستخدام مقياس الدم. قم بتخزين البلورات على حرارة 20 درجة مئوية.اقترح تحليل مورفوغرام الإندوثيابسين أن النواة تأثرت بكل من تركيزات البروتين والراسب. يمكن تمييز مناطق MetaStable و nucleation و Precipitation في الرسم البياني بشكل جيد. أدت إضافة البذور إلى زيادة كبيرة في عدد البلورات مقارنة بالقطرات بدون بذور.كشف تحليل التبلور الدقيق للإندوثيابسين في أحجام 200 إلى 300 ميكرولتر عن التغيرات في نواة البلورة وأطول بعد بمرور الوقت. زيادة تركيز PEG إلى 35٪ تحسن بشكل ملحوظ في التبلور ، مع تركيز بلوري نهائي يبلغ حوالي 3.6 مرات 10 إلى ستة لكل مليلتر ، وأطول بعد بلوري يبلغ 42 ميكرومتر. لتقليل حجم البلورات النهائية ، تم تطبيق نهج تقليل تركيز البروتين ، مما أدى للأسف إلى تقليل تركيز البلورات بشكل كبير ، وفي النهاية أنتج بلورات أكبر.ومع ذلك ، فإن نهج زيادة تركيز PEG إلى 40٪ أسفر عن بلورات حوالي 3.1 مرات 10 إلى ستة لكل مليلتر وحجم حوالي 39 ميكرومتر. علاوة على ذلك ، أدت إضافة البذور إلى زيادة كبيرة في تركيز البلورات ، حوالي 1.1 مرة 10 إلى ثمانية لكل ملليلتر وأبعاد أصغر تبلغ حوالي 4.2 ميكرومتر. أعطى تأثير التبريد الذي تمت محاولته في تفاعل التبلور تركيزا بلوريا نهائيا يبلغ حوالي 2.6 في 10 إلى ستة لكل مليلتر وحجم حوالي 15 ميكرومتر.أظهر نصف CC المرسومة مقابل الدقة من بيانات الأشعة السينية انخفاضا طفيفا في الدقة البلورية من أحجام 10 ميكرولتر إلى 200 إلى 300 ميكرولتر. ومع ذلك ، لا تزال البلورة تنحرف إلى 1.5 قلق ، وهو ما اعتبر كافيا. Endothiapepsin هو بروتين متسامح للعمل معه.نأمل أن تؤدي تجربة بروتوكول endothiapepsin هذا إلى توليد أفكار وطرق مفيدة للبروتينات الأخرى. خاصة مع علم البلورات ، من المفيد أن نرى كيف تبدو الأشياء وتشعر بها بدلا من محاولة اتباع بروتوكول مكتوب فقط. نأمل أن يمنحك هذا الفيديو بعضا من هذا الشعور.

optimizing-growth-endothiapepsin-crystals-for-serial-crystallography

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

البروتوكولات وصف الخطوات الضرورية للحصول على بلورات حيود نوعية من البروتين غشاء بدءا من إعادة تشكيل البروتين في مرحلة مكعب lipidic (LCP) ، وإيجاد الظروف الأولية مع فحوصات ما قبل تبلور LCP - FRAP ، وإقامة محاكمات تبلور LCP الحصاد والبلورات .

بلورة البروتينات في الغشاء Mesophases Lipidic

نحن هنا تصف طريقة عامة لفحص عشوائي microseed المصفوفة. ويظهر هذا الأسلوب إلى زيادة كبيرة في معدل نجاح بلورة البروتين التجارب الفرز، وتقلل من الحاجة إلى التحسين، وتوفير إمدادات موثوقة من بلورات لجمع البيانات والتجارب يجند تمرغ.

تحسين نسبة نجاح تبلور البروتين بواسطة عشوائية Microseed ماتريكس فحص

نصف إجراءات تحضير وتسليم البلورات الدقيقة للبروتين الغشائي في الطور المكعب الدهني لعلم البلورات التسلسلي في ليزر الإلكترون الحر بالأشعة السينية ومصادر السنكروترون. يمكن أيضا تطبيق هذه البروتوكولات لدمج وتسليم بلورات البروتين الدقيقة القابلة للذوبان ، مما يؤدي إلى انخفاض كبير في استهلاك العينة مقارنة بالحقن السائل.

إعداد وتسليم Microcrystals البروتين في المرحلة مكعب شحمي عن المسلسل الفيمتو ثانية البلورات

&lt; p class = 'jove_content'&gt;Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) هو متالوبوتياز مفرز وهدف دوائي واعد من العامل الممرض البشري المطثية العسيرة. نصف هنا جميع الطرق اللازمة لإنتاج وتحديد هيكل هذا البروتين.

إنتاج وبلورة وتحديد هيكل<em&gt; C. صعب</em&gt; PPEP-1 عن طريق Microseeding والزنك والصحراء

نقدم هنا بروتوكولا للإنتاج الخاضع للرقابة للبروتين ميكروكريستالس. تقوم العملية باستخدام جهاز الآلي يسمح للتلاعب التي تسيطر عليها لبلورة العديد من المعلمات. تبلور البروتين هو نفذتها الخاضعة للرقابة والآلي بالإضافة لبلورة الحلول أثناء الرصد والتحقيق في دائرة نصف قطرها توزيع الجسيمات في الحبرية تبلور.

تنامي البلورات البروتينية مع أبعاد متميزة باستخدام الآلي تبلور مقرونا في الموقع الحيوي تشتت الضوء

نجاح تجربة علم البلورات femtosecond المسلسل وقت حلها مرهون بتسليم عينة تتسم بالكفاءة. هنا، نحن تصف البروتوكولات الأمثل النتوء ميكروكريستالس باكتيريورهودوبسين من حاقن النتوء الصغير لزوجة عالية. المنهجية تعتمد على تجانس العينة مع مقرنة الثلاثية رواية والتصور مع كاميرا عالية السرعة.

تحسين قذف لزوجة عالية من ميكروكريستالس لحل وقت المسلسل Femtosecond البلورات في أشعة الليزر

ونحن نقدم وصفا للبروتوكولات الخاصة بتحديد هيكل المجال الملزم IKK من نيمو بواسطة البلورات بالاشعه السينية. وتشمل الأساليب التعبير البروتين, تنقيه وتوصيف وكذلك استراتيجيات لتحسين الكريستال الناجحة وهيكل تحديد البروتين في شكله غير منضم.

الإنتاج ، البلورة ، وتحديد الهيكل للمجال الملزم IKK من نيمو

وقد تم تطوير هذا البروتوكول لدراسة التحول dimer-dodecamer من TmPep1050، M42 aminopeptidase، على المستوى الهيكلي. وهو خط أنابيب مباشر يبدأ من تنقية البروتين إلى معالجة بيانات الأشعة السينية. وقد تم التأكيد على كريستالودينسيس، فهرسة مجموعة البيانات، واستبدال الجزيئية من خلال حالة من الدراسة، TmPep1050H60A H307A البديل.

التصوير البلوري بالأشعة السينية لدراسة انتقال الدولة أوليغومريك من Thermotoga maritima M42 أمينوببتيداسي TmPep1050

تتطلب الدراسات الهيكلية للجزيئات الحيوية بواسطة البلورات بلورات عالية الجودة. هنا نبرهن على بروتوكول يمكن استخدامه من قبل OptiCrys (أداة مؤتمتة بالكامل تم تطويرها في مختبرنا) و / أو أزرار التحليل الدقيق لزراعة بلورات كبيرة عالية الجودة استنادًا إلى معرفة الرسم التخطيطي لمرحلة التبلور.

تحسين النمو البلوري للبلورات النيوترونية الجزيئية

يصف البروتوكول المقدم نهجا مباشرا لفحص ظروف تبلور البروتين ونمو البلورات باستخدام لوحة غسيل الكلى عالية الإنتاجية المكونة من 96 بئرا. كما تم إثبات استخدام أنابيب غسيل الكلى للنمو على نطاق واسع للبلورات الدقيقة لعلم البلورات التسلسلي وتطبيقات MicroED.

تبلور البروتين عالي الإنتاجية عن طريق غسيل الكلى

يصف هذا البروتوكول إعدادا لتبلور ناقل الستيرول ABCG5 / G8. يتم إعادة تشكيل ABCG5 / G8 إلى ثنائيات للتبلور المعلق والقطرة. لا يتطلب البروتوكول مواد أو ركائز متخصصة ، مما يجعله متاحا وسهل التكيف في أي مختبر لتحديد بنية البروتين من خلال علم البلورات بالأشعة السينية.

ABCG5 / G8 التبلور في بيئة ثنائية الخلية الدهنية لعلم البلورات بالأشعة السينية

اكتشف بروتوكولاً لتحسين نمو بلورات الإندوثيابسين الصغيرة لعلم البلورات التسلسلي باستخدام تقنيات التبلور الدفعي. يوفر هذا الإطار التجريبي قيمة للباحثين في علم الأحياء الهيكلي.

تحسين نمو بلورات الإندوثيابسين لتجارب علم البلورات التسلسلي

استكشف المزيد من الفيديوهات