Name: Updegraff 방법을 사용하여 식물 바이오매스의 크리스탈 셀룰로오스 함량 추정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: 학습하세요 식물 바이오매스에서 크리스탈 셀룰로오스 함량을 추정하는 Updegraff 방법을. 아세트산과 질산 처리로 헤미셀룰로오스와 리그닌을 제거하고 안트론 분석으로 정량합니다. 이 프로토콜은 식물 세포벽 구성 연구에 필수적입니다.

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이 연구의 부분적인 지원에 대해 식물및 토양 과학 및 면학과에 감사드립니다.

1. 실험 준비
<ol><li>말린 식물 재료를 미세 한 분말로 갈아 넣습니다.</li>
	<li>단백질 용해화 버퍼 (PSB): 1 M 트리 (pH 8.8), 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) (pH 8.0)의 스톡 솔루션을 준비하고 오토클레이브. 멸균 물에 50mM Tris, 0.5mM EDTA 및 10% 나트륨 도데실 황산염(SDS)의 최종 농도로 이러한 스톡 솔루션에서 신선한 PSB 버퍼를 만듭니다.</li>
	<li>70% 에탄올(v/v)의 100mL준비: 100% 에탄올 70mL, 멸균수 30mL를 준비한다.</li>
	<li>메탄올 100mL 준비: 클로로폼은 1:1 비율(50mL 메탄올 및 50mL 클로로폼)으로 준비한다.</li>
	<li>Updegraff 시약의 82.5 mL을 준비합니다. 75mL의 아세트산을 7.5mL의 질산에 추가하여 물의 궁극적인 비율인 아세트산: 질산은 2:8:1(v/v)에 있습니다. 80% 아세트산을 제조하려면 멸균수(v/v)의 20mL에 빙하 아세트산 80mL를 용해하십시오.</li>
	<li>1 mg/mL 포도당 용액의 신선한 육수를 준비하십시오. 10mL의 물 (w /v)에 포도당 10 mg을 녹입니다.</li>
	<li>67% 황산(v/v)의 100mL를 준비하려면 67mL의 농축 황산을 33mL의 물에 추가하십시오. 항상 유리 병을 사용하고 물에 천천히 산을 추가합니다. 이 단계는 외재 (열을 방출)입니다. 따라서, 얼음에이 솔루션을 준비하고 사용하기 전에 적어도 2 시간 동안 냉장고에서 냉각.</li>
	<li>실험 샘플의 각 배치에 대해 신선한 0.2 %의 왕좌 (w /v)를 준비하십시오. 무게 0.2 g의 왕좌와 알루미늄 호일로 싸여 유리 병에 미리 냉장 농축 황산의 100 mL에 용해. 사용하기 전에 1-2 시간 동안 냉장고에 보관하십시오. 참고: 실험 당일 냉장고에 농축된 황산이 미리 들어있으며, 포도당 함량을 정확하게 추정하기 위해 새로운 안장 제제를 권장합니다.</li>
</ol>2. 식물 바이오매스 재료의 준비
<ol><li>동일한 성장 조건, 동일한 발달 단계, 식물의 동일한 위치 및 조직의 동일한 유형 (잎 / 줄기 / 뿌리)와 온실에서 성장 2 개월 된 면 실험 라인에서 식물 바이오 매스 샘플을 수집합니다. 참고: 각 샘플에 대해 최소 3개의 생물학적 복제를 수집합니다. 뿌리 조직에서 모든 먼지를 제거하기 위해 물로 철저히 씻으십시오.</li>
	<li>실온에서 종이 타월에 2일 동안 공기 건조 루트 조직을 사용하여 수분 함량을 제거합니다(도1). 참고: 곰팡이 오염을 방지하기 위해 셀룰로오스 추정을 위한 공기 건조 원하는 조직.</li>
	<li>루트 샘플을 개별 컨테이너에 넣습니다. 그런 다음 라벨을 부착하고 10일 동안 49°C에서인큐베이터로 건조시다(재료표). 참고: 또는, 동결 건조기는 식물 바이오매스 물질에 화학적 변화를 일으키지 않고 공장 조직을 1~2일 이내에 건조시키는 데 사용할 수 있다.</li>
	<li>말린 샘플을 작은 조각으로 자르고 액체 질소로 동결하고 박격포와 유봉, 냉동고 공장 또는 바이오 매스 분쇄기(그림 1)를사용하여 균일 한 미세 분말로 갈아냅니다. 참고: 냉동고 공장은 3사이클동안 10cps의 속도로 사용되었습니다.</li>
	<li>접지조직(도 2)을수집하고 세포벽 추출을 진행한다. 참고: 샘플을 실온의 밀폐 용기에 저장하여 이 시점에서 프로세스를 일시 중지할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 식물 바이오매스에서 조세포벽 추출
참고: 식물 세포벽에는 셀룰로오스, 리그닌, 비셀룰로오스 성분, 펙틴, 매트릭스 단백질, 페놀 화합물 및물(26)이함유되어 있다. 셀룰로오스가 세포벽에 존재하기 때문에, 첫 번째 단계는 식물바이오매스(26)의비세포벽 성분으로부터 세포벽 성분을 분리하는 것입니다.
<ol><li>세포벽 추출 공정을 시작하기 전에 개별 빈 2mL 튜브를 라벨및 계량합니다.</li>
	<li>더 진행하기 전에 실험실 노트북에 빈 튜브 가중치를 기록하십시오.</li>
	<li>무게 20 단계에서 분말 조직의 mg 2.5 미리 무게 2 mL 튜브에 전송 하 고 그들을 레이블.</li>
	<li>단백질 용해화 완충제(PSB) (50mM Tris 염산염(HCl) 완충 pH 8.8, 0.5mM EDTA, 10% 나트륨 도데실 황산염(SDS)을 첨가하여 단백질을 용해시켰다. 소용돌이와 원심분리기는 실온(RT)에서 5분 동안 25,200 x g의 소용돌이. 원심 분리 후, 상체를 버리고 펠릿을 저장합니다. 참고: 단백질 성분을 분석해야 하는 경우 상체를 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>3.4 단계를 두 번 더 반복합니다.</li>
	<li>유지 된 펠릿에 증류수와 소용돌이 1 mL을 추가하십시오. 실온(RT)에서 5분 동안 25,200 x g의 원심분리기와 상류체를 제거합니다.</li>
	<li>3.6 단계를 두 번 더 반복합니다.</li>
	<li>저장된 펠릿, 소용돌이에 70% 에탄올 1mL을 넣고 수조/열 블록에 70°C에서 1시간 동안 가열하여 샘플에서 수용성 성분과 전분을 제거합니다. RT에서 5 분 동안 25,200 x g의 소용돌이와 원심 분리기.</li>
	<li>3.8 단계를 한 번 더 반복합니다.</li>
	<li>펠릿에 1mL의 100% 메탄올과 소용돌이를 추가합니다. 실온(RT)에서 5분 동안 25,200 x g의 원심분리기와 상류체를 제거합니다.</li>
	<li>펠릿과 소용돌이에 클로로폼/메탄올 1mL(클로로폼 및 메탄올 1:1 비율)를 넣습니다. RT에서 5 분 동안 25,200 x g의 원심 분리기와 상체를 제거하십시오. 메탄올 및 클로로폼 용매를 첨가하여바이오매스(27)로부터지질 분획을 용해시키고 제거한다.</li>
	<li>펠릿에 1mL의 100% 아세톤과 소용돌이를 넣습니다. 실온에서 5분 동안 배양하십시오. RT에서 5 분 동안 25,200 x g의 원심 분리기와 상체를 제거하십시오. 아세톤은 바이오매스28,29에서엽록소 및 자유 지방산과 같은 안료를 제거한다.</li>
	<li>하룻밤 사이에 37°C에서 펠릿을 말리거나 진공 건조에 의해 더 진행하십시오. 참고: 말린 펠릿은 결정성 셀룰로오스 추정에 사용되는 조세포벽입니다. 이 시점에서 공정을 일시 중지하거나 건조 시료를 위한 진공 건조기사용으로 더 진행할 수 있습니다.</li>
</ol>4. Updegraff 시약 (아세트 및 질산)으로 치료하여 비 셀룰로오스 성분을 제거합니다.
참고: 이 프로토콜에는 산 및 기타 화학 물질의 사용이 포함됩니다. 프로세스 전반에 걸쳐 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오.
<ol><li>말린 조세포 벽 펠릿 5 mg을 신선한 2mL 나사 캡튜브에 넣습니다. 정확한중량(그림 3)30을참고하십시오.</li>
	<li>이 시점에서 양수 컨트롤을 포함합니다. 80% 셀룰로오스 함량을 산출하는 양수 제어로 필터 용지 2mg(재료 표)을사용하십시오.</li>
	<li>무게가 있는 5 mg의 세포벽 추출물과 양수 조절에 Updegraff 시약의 1.5mL를 추가합니다. 소용돌이에 의해 혼합. 참고: 양수 제어는 이 단계의 실험 샘플과 동일한 방식으로 처리되어야 합니다. 이 단계는 적절한 개인 보호 장비 (PPE)와 연기 후드에서 수행해야합니다. 주의: 이 단계는 샘플의 튀기고 튜브의 터지는 것을 방지하기 위해 나사 캡 튜브에서 수행되어야합니다. 양수 제어를 위한 3개의 복제와 더불어 각 견본의 3개의 생물학 복제는 포함되어야 합니다.</li>
	<li>현탁액을 끓는 수조에서 30분 동안 100°C로 가열하고 벤치에서 10분 동안 식힙니다. RT에서 10 분 동안 25,200 x g의 원심 분리기. 원심 분리에 의해 상체를 제거하고 펠릿을 저장합니다. 참고: 생성된 폐기물은 유기 용매, 황산 및 Updegraff 시약(아세트산 및 질산)을 위해 별도로 수거해야 합니다. 아세트산과 질산을 가진 폐기물은 통풍이 잘 되는 캡으로 시원한 온도에서 보관되어야 하며 폭발을 방지하기 위해 다른 유기 용매 및 기타 산과 혼합해서는 안 됩니다.</li>
	<li>펠릿에 1mL의 물을 넣습니다. RT에서 10분 동안 25,200 x g의 원심분리기는 수퍼나티의 500 μL을 제거하고 튜브에 아세톤 1mL을 추가합니다.</li>
	<li>RT에서 5 분 동안 25,200 x g의 원심 분리기는 1 mL의 상퍼를 제거하고 RT에서 5 분 동안 25,200 x g에서 튜브및 원심 분리기에 1 mL의 아세톤을 추가합니다.</li>
	<li>원심 분리 후, 모든 상체를 제거하고 아세톤의 1 mL에서 펠릿을 중단합니다. 실온에서 5분 동안 튜브를 배양하고 RT에서 5분 동안 25,200 x g에서 회전합니다.</li>
	<li>상체를 버리고 펠릿을 저장합니다. 펠릿을 하룻밤 사이에 37°C에서 건조시키십시오(그림3). 참고: 이 시점에서 공정을 일시 중지하거나 건조를 위해 진공 건조기를 사용하여 계속 하고 다음 단계로 진행할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 포도당 단량체 단위를 생성하는 산에 의한 셀룰로오스의 가수 분해
<ol><li>말린 펠릿에 67% 황산 1mL를 넣습니다. 소용돌이는 산에 완전히 펠릿을 혼합합니다.</li>
	<li>실온에서 튜브를 1시간 동안 흔들어 셀룰로오스 펠릿을 67% 황산으로 녹입니다. 참고: 대안으로, 67% 황산에서 셀룰로오스 펠릿의 용용화는 셰이커에서 잠복식 30분 후 10분 동안 각 시료의 초음파 처리에 의해 개선될 수 있다. 초음파 처리 후, 샘플은 RT에서 셰이커에서 다시 배양 할 수 있습니다. 그러나, 우리는 우리가 원유 세포벽 추출물의 5 mg으로 시작할 때 초음파 처리없이 셀룰로오스 펠릿의 완전한 용해도를 관찰(도 3). 이 절차는 다양한 식물 바이오 매스 샘플3에적합했다.</li>
</ol>6. 셀룰로오스 함량의 반위 분석 및 추정에 의한 포도당 함량 측정
<ol><li>이 단계에서 셀룰로오스는 무료 포도당 단조량의 형태입니다. 분광측법에 의해 시료에 존재하는 포도당의 양을 측정하여 셀룰로오스의 양을 결정한다.</li>
	<li>5단계에서 시료의 10μL을 복용하여 멸균 증류수 490μL에 추가하여 각 시료를 500 μL로 희석시켰다.</li>
	<li>0.2%의 1mL을 각 튜브에 새로 준비한 앙위원 시약을 넣고 소용돌이에 섞어서 즉시 섞습니다.</li>
	<li>샘플을 100°C에서 10분간 끓이고 얼음에서 튜브를 5분간 식힙니다. 각 샘플의 200 μL을 96 웰 플레이트의 3개의 우물에 옮기. 96 웰 플레이트를 분광광계에 적재하여 620 nm에서 흡광도를 측정합니다. 참고: 고온에서 끓는 경우 나사로 덮인 튜브를 사용하여 유해한 화학 물질의 튀는 것을 방지하고 시료 손실을 방지하십시오.</li>
</ol>7. 포도당 표준 곡선의 준비
<ol><li>포도당 표준을 준비하려면 10 mg의 포도당을 10 mL의 멸균 증류수에 용해하여 1 mg / mL 포도당의 신선한 육수를 만듭니다. 이 스톡 용액은 20 μL 증분(0, 20, 40, 60, 80,100,120,140, 160, 180 μL)에 1 mg/mL의 이 스톡 용액을 첨가하여 0μg에서 180 μg/mL농도까지의 포도당 기준을 준비합니다(총 부피 1mL). 멸균 수를 첨가한 후 각 포도당 기준을 소용돌이시다.</li>
	<li>이 10개의 다른 농도에서, 신선한 2 mL 나사 덮인 튜브로 각 포도당 농도의 알리쿼트 500 μL.</li>
	<li>각 튜브에 갓 준비된 0.2%의 1mL을 넣고 소용돌이에 섞어 바로 섞습니다. 얼음에 배양하고 100 °C에서 10 분 동안 끓인 다음 5 분23동안 얼음에 인큐베이션이 있습니다.</li>
	<li>각 표준의 200 μL을 96개의 마이크로 티터 플레이트에 3개의 기술 복제를 위해 3개의 우물로 옮기고 620 nm(그림3)에서흡광도를 측정한다.</li>
	<li>620 nm(도7)에서정규화된 흡광도 값에 대해 상이한 포도당 농도(0~180 μg/mL)를 플로팅하여 표준 포도당 곡선을 개발한다. 흡광도 값에서 생성된 회귀 라인 Y= mx+c를 사용하여 준비된 샘플의 셀룰로오스 함량을 계산합니다. 참고: 포도당 표준은 실험의 각 세트에 대해 갓 준비해야합니다. 이러한 값이 표준 곡선 흡수도 값의 범위 내에 속할 수 있도록 OD 값이 너무 높으면 포도당의 농도가 증가되어야 한다. 회귀 라인은 샘플의 각 배치에 사용되는 포도당 표준에 따라 다른 m 및 c 값을 생성합니다. 왕좌 를 추가 한 직후 튜브를 혼합(23). 이 반응의 외신적 특성 때문에 왕좌 분석이 수행 될 때까지 왕좌, 희석 된 샘플 및 준비 된 표준은 항상 차갑게 유지되었습니다.</li>
</ol>

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저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

면 섬유는 면씨에서 생산 된 천연 섬유입니다. 면섬유는 섬유 산업에서 광범위한 응용 분야와 높은 결정 셀룰로오스 함량을 가진 ~ 95 % 셀룰로오스 함량2를 가진 단일 셀입니다31. 면 섬유에는 ~95% 셀룰로오스가 함유되어 있으므로, 결정성 셀룰로오스 함량의 추정을 시연하기 위해 면 뿌리 조직을 사용했습니다. 면 뿌리 조직은 결정성 셀룰로오스 함량이 적당히 풍부하며 일반적으로 이용 가능한 식물 바이오매스를 나타냅니다. 결정성 셀룰로오스 함량에 필요한 총 세포벽의 양은 5 mg에 불과하므로 이 방법은 상이한 발달 단계/조직 별 셀룰로오스 함량 추정에서 결정성 셀룰로오스 함량을 추정하기 위해 사용될 수 있다. 황산 비율 (67%) 또한 셀룰로오스를 포도당 모노머로 깨고 초음파 처리없이 셀룰로오스를 완전히23으로 용해시키는 데 중요한 역할을합니다. 시료 손실은 결정성 셀룰로오스 펠릿이 추정 과정에서 다른 ...

셀룰로오스는 1차 세포벽과 이차 세포벽 모두에 존재하는 세포벽의 1차 하중 베어링 성분입니다. 세포벽은 식물 세포를 포위하는 세포외 매트릭스이며 주로 셀룰로오스, 리그닌, 헤미셀룰로오스, 펙틴 및 매트릭스 단백질로 구성됩니다. 식물 바이오매스의 약 1/3은 셀룰로오스1이며, 세포 성장의 강도, 강성, 속도 및 방향, 세포 모양 유지 보수 및 바이오틱 및 무생물 스트레스요인으로부터의 보호를 제공함으로써 식물 성장과 개발에 중요한 역할을 합니다. 면 섬유는 95% 셀룰로오스2 함량을 포함하고 있으며, 나무는 식물 종 및 장기 유형에 따라 셀룰로오스의 40 %에서 50 %를 함유하고있습니다3. 셀룰로오스는 β-1,4 글리코시딕 본드4에의해 연결된 포도당 잔류물의 불협화기인 셀로바이오제의 반복 단위로 구성된다. 셀룰로오스 에탄올은 식물 세포벽5에존재하는 셀룰로오스로부터 유래된 포도당으로부터 생산된다. 셀룰로오스 섬유는 각 마이크로 피브릴이 500-15000 포도당 단량제1,6을가진 코어 단위로 작용하는 몇몇 마이크로 피브릴로 구성됩니다. 셀룰로오스 모합합체는 플라즈마 멤브레인 임베디드 셀룰로오스 신타스 복합체(CSC)1,7에의해 합성된다. 개별 셀룰로오스 신타제 A(CESA) 단백질은 글루칸 사슬을 합성하고 인접한 글루칸 사슬은 수소 결합에 의해 연결되어 결정성 셀룰로오스1,8을형성한다. 셀룰로오스는 2개의 우세한 형태, 셀룰로오스 Iα 및 셀룰로오스 Iβ를 네이티브 형태9로여러 결정 형태로 존재한다. 더 높은 식물에서 셀룰로오스는 셀룰로오스 Iβ 형태로 존재하며, 낮은 식물 셀룰로오스는 Iα 형태10,11에존재한다. 전반적으로, 셀룰로오스는 식물 세포벽에 강도와 강성을 부여하는 데 중요한 역할을한다.
1세대 바이오 연료는 주로 옥수수 전분, 지팡이 설탕 및 사탕무 설탕에서 생산되며, 2세대 바이오 연료는 비식품 식물바이오매스 세포벽재료(12)의바이오 연료 생산에 주력하고 있다. 결정성 셀룰로오스 함량의 정확한 추정은 셀룰로오스 생합성 및 세포벽 역학에 대한 근본적인 연구뿐만 아니라 적용 된 바이오 연료 및 바이오 제품 연구에도 중요합니다. 식물 바이오매스의 셀룰로오스 추정에 최적화된 다양한 방법이 개발되고 최적화되어 있으며, Updegraff 방법은 셀룰로오스 추정에 가장 널리 사용되는 방법입니다. 셀룰로오스 추정을 위한 첫번째 보고된 방법은 1908년13년에십자가와 베반에 의해 이었습니다. 이 방법은 황산나트륨에 의한 대체 염소화 및 추출 원리에 기초하였다. 그러나, 원래의 변형된 프로토콜뿐만 아니라 크로스 및 베반 방법의 변형된 프로토콜에 의해 얻어진 셀룰로오스는 상당한 양의 자일란과만난(14)에더하여 리그닌의 작은 분수의 오염을 보였다. 셀룰로오스 분획에서 리그닌과 헤미셀룰로스를 제거하기 위한 몇 가지 수정에도 불구하고, 크로스 베반 방법은 셀룰로오스와 함께 상당한 양의 만란을 유지했습니다. 나중에, 쿠르슈너의 방법은 셀룰로오스(15)를추출하기 위해 질산과 에탄올을 사용하여 개발되었다. 이 방법은 총 리그닌과 펜토산의 75%가 제거되었지만 진정한 셀룰로오스 결과는 크로스와 베반의 염소화 방법에 의해 추정된 것과 동일하다고 명시하였다. 또 다른 방법(Norman 및 Jenkins)은셀룰로오스(16)를추출하기 위해 메탄올 벤젠, 황산나트륨 및 하이포염소산나트륨을 사용하여 개발되었다. 이 방법은 또한 리그닌의 일부 일부를 유지 (3%) 그리고 셀룰로오스의 정확한 추정으로 이어지는 펜토산의 상당한 금액. 나중에, 키젤과 Semiganowsky는 80% 농축 황산을 사용하여 셀룰로오스에 다른 접근 법을 사용했으며, 가수 분해 감소 된 설탕은 버트 랜드의 방법에 의해 추정되었다17. 두 가지 방법, 왁스맨스와 스티븐스18 과 살로14,19 키셀과 세미 가노우스키의 방법에 따라 개발 된, 또한 이전 방법에 비해 4-5 % 적은 셀룰로오스 함량을 산출20.
Updegraff 방법은 결정성 셀룰로오스 함량의 추정을 위해 가장 널리 사용되는 방법입니다. 이 방법은 1969년21년셀룰로오스의 측정을 위해 Updegraff에 의해 처음 기술되었다. Updegraff 방법은 쿠르슈너 방법 (질산 사용), 키셀 및 세미노프스키 방법 (황산을 사용하여 포도당 모노머로 셀룰로오스의 가수 분해)를 통합하고, 포도당 및 결정 셀룰로오스 함량22의간단한 색소 추정을위한 빌스와 실버맨의 반위 분석법을 통합합니다. 이 방법의 원리는 아세트산과 질산(Updegraff 시약)을 사용하여 균질화된 식물 조직에서 헤미셀룰로오스와 리그닌을 제거하는 것으로, 아세트/질산 내성 셀룰로오스를 더 처리 및 추정을 위한 세포산내성 셀룰로오스를잎입니다(15) 아세트/질산 내성 셀룰로오스는 셀룰로오스를 포도당 단량체로 분해하기 위해 67%의 황산으로 처리되며, 방출된 포도당 단량제는 안계학적 분석21,23에의해 추정된다. 원래 Updegraff 방법의 몇 가지 수정은 anthrone분석서 (24)에의해 절차 및 셀룰로오스 추정을 단순화하는 데 사용되었다. 광범위하게 이 메서드는 5단계로 나눌 수 있습니다. 1단계에서는 식물 재료가 제조됩니다. 제2상에서, 조세포벽은 식물 세포벽의 핵심 성분이기 때문에 총 바이오매스로부터 분리된다. 나중에, 제 3 단계에서, 셀룰로오스는 Updegraff 시약으로 처리하여 비 셀룰로오스 세포벽 성분으로부터 분리된다. 네 번째 단계에서, 아세트/질산 내성 셀룰로오스는 황산 치료에 의해 포도당 단량체로 분해된다. 셀룰로오스의 황산 치료는 황산을 가진 포도당 단량제의 반응에서 5-하이드록시메틸푸르랄 화합물의 형성을 초래한다. 마지막으로, 마지막 단계에서, 왕좌는 이전 단계25에서생성된 모피 화합물로 끓여 서 녹색 의 푸른 복합체를 생성한다. 이 왕좌 기반 색법 방법은 드레이우드에 의해 1942 년에 처음 사용되었습니다. Anthrone는 산성 조건하에서 5-하이드록시메틸푸르랄과 같은 펜토스 및 헥소스 탈수 제품의 furfural 화합물을 식별하는 염료입니다. 헥소스를 가진 반응은 펜토스25에비해 강렬한 색상과 더 나은 반응을 생성합니다. 결합된 포도당의 양은 620nm에서 분광계 흡광도에 의해 측정되고 녹색 파란색 복합체의 강도는 시료의 설탕 양에 직접적으로 비례한다. 측정된 흡광도 값은 샘플의 포도당 농도를 계산하기 위해 포도당 표준 곡선 회귀 라인과 비교하였다. 측정된 포도당 함량은 식물 바이오매스의 셀룰로오스 함량을 추정하기 위해 사용되었다.

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Chemical</td><td>A18-500</td><td>프로토콜에 사용</td></tr><tr><td>Anthrone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90-44-8</td><td>비색 분석용</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>원심분리용</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Mallinckrodt</td><td>67-66-3</td><td>프로토콜에 사용</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6381-92-6</td><td>프로토콜에 사용됨</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Millipore</td><td>Sigma EM-EX0276-4S</td><td>프로토콜에 사용됨</td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Whatman</td><td>1004-090</td><td>Positive control</td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Sigma</td><td>SKU A6283</td><td>프로토콜에 사용됨</td></tr><tr><td>Heat block/ ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>13527550</td><td>온도 조절용</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Fisherbrand</td><td>150152633</td><td>건조 플랜트 샘플에 사용</td></tr><tr><td>측정 스케일</td><td>Mettler Toledo</td><td>30243386</td><td>특정 수량</td></tr><tr><td>메탄올 100 %</td> <td>Fisher Chemical</td><td>A412-500</td><td>프로토콜에 사용</td></tr><tr><td>Microplate (96 well)</td> <td>Evergreen Scientific</td><td>222-8030-01F</td><td>안트론 분석</td></tr><tr><td>용 질산</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695041</td><td>프로토콜에서 사용됨</td></tr><tr><td>폴리프로필렌 마이크로바이알(2 mL) / 스크류 캡 튜브</td><td>BioSpec Products</td><td>10831</td><td>고온용</td></tr><tr><td>분광광도계(다중 모드 검출기)</td><td>Beckmancoulter DTX880</td><td>1000814</td><td>흡광도 측정용</td></tr><tr><td>Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill</td><td>Spex Sample Prep</td><td>68-701-15</td><td>식물 조직을 미세한 분말</td></tr><tr><td></td><td></td><td>로 분쇄하는 데 사용됩니다.02-004-382</td><td>프로토콜에 사용됨</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151-21-3</td><td>PSB 버퍼</td></tr><tr><td>튜브 (2 mL)</td>에 사용됨<td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td>프로토콜에 사용됨</td></tr><tr><td>Tris Hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp; 1185-53-1</td><td>PSB 버퍼에 사용</td></tr> 초<tr><td>순수 증류수</td><td>Invitrogen</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>프로토콜 진공 건조기 (vacufuge plus)</td>에 사용 <td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td>샘플 건조용</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Fisherbrand</td><td>14-955-151</td><td></td></tr><tr><td>혼합용 Waterbath</td><td>Thermoscientific</td><td>TSGP02PM05</td><td>특정 온도 제어 조건용 단계</td></tr><tr><td>계량 종이</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-898-12A</td><td>프로토콜에 사용됨</td></tr></tbody></table>

updegraff 방법을 사용하여 식물 바이오매스의 크리스탈 셀룰로오스 함량 추정

Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method

셀룰로오스는 광합성및 세포벽의 주요 하중 베어링 성분에 의해 생성되는 지구상에서 가장 풍부한 폴리머이다. 세포벽은 세포 성장의 강도, 강성, 속도 및 방향, 세포 모양 유지 보수 및 생체 및 무생물 스트레스요인으로부터의 보호를 제공함으로써 식물 성장 및 개발에 중요한 역할을 합니다. 세포벽은 주로 셀룰로오스, 리그닌, 헤미셀룰로오스 및 펙틴으로 구성됩니다. 최근 식물 세포벽은 2세대 바이오 연료 및 바이오 에너지 생산을 목표로 하고 있습니다. 구체적으로, 식물 세포벽의 셀룰로오스 성분은 셀룰로오스 에탄올의 생산에 사용된다. 바이오매스의 셀룰로오스 함량의 추정은 기본 및 적용 된 세포 벽 연구에 매우 중요합니다. Updegraff 방법은 간단하고 견고하며 식물 바이오매스의 결정성 셀룰로오스 함량을 추정하기 위한 가장 널리 사용되는 방법입니다. Updegraff 시약으로 치료시 알코올 불용성 조세포 벽 분획은 헤미셀룰로오스와 리그닌 분획을 제거합니다. 나중에, Updegraff 시약 저항하는 셀룰로오스 분획은 단황 포도당 단위로 셀룰로오스 균합고를 가수분해하기 위하여 황산 처리를 실시한다. 회귀 라인은 포도당의 다양한 농도를 사용하여 개발되고 실험 샘플에서 셀룰로오스 가수 분해시 방출되는 포도당의 양을 추정하는 데 사용된다. 마지막으로, 셀룰로오스 함량은 색칠성 앙위 분석에 의한 포도당 단량의 양을 기준으로 추정된다.

녹색 집에서 자란 면화 식물은이 연구를 위해 선택되었다. 두 개의 상이한 실험 용 회선은 셀룰로오스 함량의 비교 분석을 위해 선택되었다. 각 실험 라인에 대해, 루트 조직은 세 가지 생물학적 복제로부터 수집되었다. 총 500 mg의 조직이 균질화되었고 20 mg의 조세포 벽 추출에 사용되었습니다. 나중에, 5 mg의 조세포벽 추출물은 셀룰로오스로부터 헤미셀룰로오스와 리그닌을 제거하기 위해 Updegraff 시약 치료에 사용되었습니다. 정제 된 셀룰로오스는 셀룰로오스를 포도당 단위로 분해하기 위해 황산 치료에 의해 가수 분해되었습니다. 620 nm(보충 표 1)에서흡광도 판독의 결과는 포도당 농도를 측정하고 상보 분석에 의한 셀룰로오스 함량을 추정하는 데 사용되었다. 3개의 기술 복제의 평균 흡광도 값은 0 μg 포도당 농도의 빈 흡광도 값을 빼서 정규화되었다. 포도당 표준 곡선은 산란된 막대그래프(도 4)를사용하여 생성되었다.
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Updegraff 방법은 셀룰로오스 추정에 가장 널리 사용되는 방법입니다. 이 데모의 주요 목적은 식물 바이오매스 샘플에서 셀룰로오스 함량을 추정하기 위한 상세한 Updegraff 프로토콜을 제공하는 것입니다.

Updegraff 방법을 사용하여 식물 바이오매스의 크리스탈 셀룰로오스 함량 추정

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a ...

여기서는 결정성 셀룰로오스 함량의 추정을 위해 세계에서 가장 널리 사용되는 방법인 Updegraff 방법을 시연합니다. 셀룰로오스는 기본적으로 베타-1, 4 글리코시딕 결합에 의해 연결된 포도당 단량으로 구성됩니다. 이 프로토콜을 5단계로 나누었습니다.1단계에서는 식물 바이오매스 물질을 준비합니다. 두 번째 단계에서는 조세포벽을 추출합니다. 3단계에서는 Updegraff가 아세트산과 질산으로 구성된 Updegraff 치료를 사용하여 샘플에서 헤미셀룰로오스와 리그닌을 제거하는 데 도움을 줍니다.네 번째 단계에서는 포도당 단량체를 생산하는 황산의 도움으로 산 성 가수 분해를 받습니다. 마지막으로, 다섯 번째 단계에서는 결정성 셀룰로오스 함량을 추정하기 위해 왕좌의 분석방법을 사용합니다. 온실에서 식물 재료를 수집하고, 물로 철저히 씻고, 2 일 동안 공기 건조하고, 조직을 분리하고 개별적으로 표시된 용기로 조직을 옮기고 10 일 동안 49도 Centigrade에서 인큐베이터에서 인큐베이터에 인큐베이션하십시오.그런 다음 마지막으로 가위 나 블레이드를 사용하여 조각으로 자른다. 조직을 동결하고 박격포에 적재하고 균일 한 분말로 미세 분쇄하거나 냉동고 / 밀을 사용하십시오. 여기에서는 냉동고/밀을 사용하여 티슈 샘플을 이 연삭 유리병에 적재하고 냉동고/밀에 넣고 3사이클동안 10CP 속도를 실행합니다.조직 분말은 여기에 표시된 대로 팔콘 튜브에서 수집됩니다. 20 mg의 티슈 파우더를 계량하고 미리 계량된 2mL 튜브로 전달합니다. 단백질 용해성 버퍼 1mL를 추가하여 단백질을 제거합니다. 소용돌이.원심분리기 15, 000 RPM5분. 상부체를 폐기합니다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다.유지된 펠릿에 멸균 수1mL를 추가합니다. 소용돌이. 원심분리기 15, 000 RPM5분. 이 단계를 두 번 더 반복합니다.유지 된 펠릿에 70 %의 에탄올 1 ML을 추가합니다. 소용돌이. 예열된 70도 섭씨 블록으로 1시간 동안 동시 흔들림이 있는 블록으로 옮겨보겠습니다. 1시간 배양 후 원심분리기는 15, 000 RPM에서 5분간.이 단계를 한 번 더 반복합니다. 저장된 펠릿에 100% 메틸론1mL을 추가합니다. 소용돌이. 원심분리기 15, 000 RPM5분.클로로폼 메탄올 1mL를 추가합니다. 소용돌이. 원심분리기 15, 000 RPM5분. 상체를 버리고 아세톤의 1mL를 추가합니다. 소용돌이.실온에서 5분간 배양하세요. 원심분리기 15, 000 RPM5분. 상체를 다시 버리고 공기는 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 건조하거나 진공 건조로 계속하십시오.샘플을 진공 건조기와 2~3시간 동안 또는 펠릿이 완전히 건조할 때까지 공기 건조에 실어 줍니다. 이전 단계에서 얻은 세포벽 추출물의 5 mg의 무게를 측정한다. 두 mL 나사 캡 튜브로 전송합니다.또한이 시점에서 긍정적 인 제어를 포함한다. 그 목적을 위해 Whatman 필터 용지의 두 mg을 사용합니다. 두 mL 나사 캡 튜브로 전송합니다.각 계량 세포벽 추출물에 Updegraff 시약 1.5mL를 추가합니다. 소용돌이와 30 분 동안 예열 된 블록에서 섭씨 100도에서 배양. 30분 간 인큐베이션 후 랙으로 옮김합니다.벤치에서 10분 동안 식힙니다. 15, 000 RPM에서 10분 동안 원심분리기. 펠릿을 방해하지 않고 상체를 버리십시오.멸균 물 1mL를 추가합니다. 소용돌이. 15, 000 RPM에서 10분 동안 원심분리기. 상수의 500 마이크로 리터를 폐기하십시오.아세톤 1mL를 추가합니다. 소용돌이. 원심분리기 15, 000 RPM5분. 상체의 1mL를 폐기합니다.아세톤 1mL를 추가합니다. 소용돌이. 원심분리기 15, 000 RPM5분. 상신을 완전히 버리십시오.아세톤 1mL를 추가합니다. 소용돌이. 원심분리기 15, 000 RPM5분. 상부체를 폐기합니다.하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 건조하십시오. 하룻밤 잠복 후 랙으로 옮김하십시오. 67%의 황산 1mL를 추가합니다. 소용돌이.동시 흔들림으로 섭씨 25도에서 1시간 동안 배양합니다. 1시간 동안 잠복한 후 펠릿이 완전히 용해되었는지 확인하십시오. 랙으로 옮기.이것은 셀룰로오스 추출의 마지막 단계입니다. 이제 샘플이 샘플 희석을 할 준비가 되었습니다. 시료 희석의 경우 이전 단계에서 각 샘플의 10 마이크로리터를 사용하고 멸균 수490 마이크로리터를 추가하십시오.모든 실험 샘플에 대해 이 것을 반복합니다. 포도당 표준 곡선 준비를 위해, mL 포도당 1 mg의 신선한 육수를 준비하고 20 마이크로 리터 단위로 mL 포도당 1 mg을 추가하여 20 마이크로 그램 농도에 0 마이크로 그램을 준비하고 멸균 물로 1 mL에 최종 볼륨을 구성합니다. 스크류 캡 튜브에 각 준비된 표준의 500 마이크로리터를 가지고 1 mL 0.2%의 왕좌를 추가하십시오.그리고 이제 샘플은 왕좌 분석에 대한 준비가되어 있습니다. 갓 준비된 왕좌 1mL을 추가합니다. 소용돌이를 통해 즉시 섞어서 얼음으로 옮으세요.동일한 방식으로 모든 표준 및 샘플을 반복합니다. 그런 다음 10 분 동안 예열 된 100도 섭씨 블록으로 옮겨. 10분 간 인큐베이션을 한 후 얼음으로 옮기고 얼음 위를 5분간 배양합니다.인큐베이션 후 각 샘플의 200 마이크로리터를 3개의 복제로 섭취하십시오. 동일한 방식으로 표준과 샘플 모두에 대해 반복합니다. 그리고 로드 된 96 웰 플레이트멀티 모드 검출기에로드되었다.스마트 맥스 프로 프로그램을 사용하여 필터 설정을 620나노미터로 설정했습니다. 플레이트 타입을 96웰 타입으로. 모든 읽기 영역을 선택합니다.확인을 클릭합니다. 읽다. 접시를 읽습니다. 셀룰로오스 함량의 추가 분석 및 추정을 위해 Excel 시트에서 수집되는 표준 및 샘플 모두의 흡광도 판독값을 얻을 수 있습니다.포도당 표준 곡선은 x 축에 mL 당 마이크로그램의 포도당 농도를 사용하고 y축에서 620 나노미터에서 각각농도의 정규화된 흡광도 값을 이용하여 제조된다. 샘플 결정 셀룰로오스 함량을 추정하는 데 사용하는 플롯된 산란 그래프에서 m 및 c 값으로 회귀 선을 얻습니다. 첫 번째 단계에서는 OD 값을 평균 620 나노미터로 측정했습니다.그런 다음 빈 값을 빼서 데이터를 정규화했습니다. 우리는 표준 곡선에서 회귀 라인의 이전 단계에서 c 및 m 값을 연결하는 OD 마이너스 c/m과 동일한 수식 x를 사용하여 포도당 농도를 계산합니다. 왕좌 분석에 사용 된 총 볼륨은 500 마이크로 리터이기 때문에 희석 계수 2로 나눕니다.사용된 견본 부피는 단지 10 마이크로리터이기 때문에, 우리는 mL 농도 당 mg과 동일한 포도당의 마이크로 리터 농도 당 마이크로 그램을 얻기 위하여 10에 의해 더 분할할 것입니다. 그리고 그 과정에서 수분 이득인 수분계 1.11을 사용했습니다. 그리고 마지막으로, 우리는 5 mg에 가까운 세포벽 무게로 분할하여 백분율 결정 셀룰로오스 함량을 계산하고, 백분율을 얻기 위해 100으로 곱합니다.그런 다음 3개의 생물학적 복제의 결정성 셀룰로오스 함량을 평균화하여 개별 샘플에 대한 값을 얻었으며, 이는 3개의 생물학적 복제의 또 다른 실험 라인 평균과 비교될 것입니다. 그리고 t-테스트는 그들의 중요성의 수준을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서 표 A에서, 우리는 620 나노미터에서 각각의 OD의 테이블 값을 나타내며, 이는 두 실험 라인 간의 셀룰로오스 함량 차이를 얻기 위해 C에서 사용된 m 및 c 값으로 산란 그래프 및 회귀 라인을 더 플롯하는 데 사용되었다.결론적으로, 두 샘플 모두 셀룰로오스 차이를 보여줍니다. 시청해 주셔서 감사합니다.

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연구

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Environment

환경

식물 바이오 매스는 바이오 연료 생산에 사용될 수있는 주요 탄소 중립 되살릴 수있는 자원입니다. 식물 바이오 매스는 주로 세포 벽, lignocellulosics를 칭했다 구조적으로 복잡한 복합 재료로 구성되어 있습니다. 여기서 우리는 내용과 polyphenolic의 리그닌의 구성의 포괄적인 분석을 위해 프로토콜을 설명합니다.

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 부 I : 리그닌

식물 바이오 매스는 바이오 연료 생산에 사용될 수있는 주요 탄소 중립 되살릴 수있는 자원입니다. 식물 바이오 매스는 주로 세포 벽, lignocellulosics를 칭했다 구조적으로 복잡한 복합 재료로 구성되어 있습니다. 여기서 우리는 콘텐츠와 벽 파생 탄수화물의 구성의 포괄적인 분석을 위해 프로토콜을 설명합니다.

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 2 부 : 탄수화물

빠른 방법은 세포외 기질에서 다당류의 구조에 대한 통찰력을 얻을 수 설명되어 있습니다. 방법은 glycosylhydrolases의 특이성과 물질의 미세한을 분석 수 있도록 질량 분석계의 감도 활용합니다. 이 기술은 조직 자체에서 직접 사용할 수 적용할 수 있습니다.

세포외 다당류의 OLIgo 질량 프로파일 (OLIMP)

이중 가닥 RNA 간섭 (dsRNAi) 기술은 옥수수 신나 코엔자임에게 낮은 식물 리그닌 함량에 대한 환원 (ZmCCR1) 유전자를 하향 조절하기 위해 사용된다. 세포벽에서 리그닌 다운 규제는 현미경 분석에 의해 시각과 Klason 방법에 의해 정량화된다. 헤미셀룰로오스 및 결정 셀룰로오스의 조성 변화를 분석됩니다.

의 리그닌 아래로 규제<em&gt; ZEA 메이스</em&gt; dsRNAi 및 Klason 리그닌 분석을 통해

식물 세포벽 구조 및 화학적 특성을 평가하여 바이오 연료 및 바이오 재료에 이상적인 공급 원료를 식별합니다. 표준 방법은 대규모 데이터 세트에 적용할 때 제한이 있습니다. 이러한 고처리량 전처리, 효소 당화 및 열분해 분자 빔 질량 분석 방법은 많은 수의 바이오매스 샘플을 비교하여 실험 시간과 비용을 줄입니다.

총 리그닌, 리그닌 단량체, 및 효소 설탕 자료 : 리그 노 셀룰로오스 바이오 매스의 반항의 변화의 높은 처리량 검열

결정질 셀룰로오스는 식물 세포벽의 중요한 구성 성분입니다. 그러나 세포 분해능에서 정량화하는 것은 기술적으로 어렵습니다.  여기에서는 시공간 해상도에서 세포벽 구성에 대한 정보를 얻기 위해 편광 기술과 뿌리 단면을 사용하는 방법을 보고합니다.

에서 결정 셀룰로오스 축적의 높은 해상도 정량<em&gt; 애기 장대</em&gt; 뿌리 조직 특이 세포 벽 수정을 모니터링하는

이 프로토콜은 라만 이미징 및 다 변수 분석을 사용하여 식물 세포 벽에서 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미 셀룰로오스를 시각화하는 일반적인 방법을 제시합니다.

라만 이미징과 다변량 분석을 결합하여 식물 세포벽에서 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미 셀룰로스를 시각화합니다.

여기, 시아 노 박테리아 세포에서 글리코겐 함량을 측정하기위한 신뢰할 수 있고 쉬운 분석법을 제시합니다. 이 과정은 침전, 선택 가능한 해중합 및 포도당 잔류 물의 검출을 수반한다. 이 방법은 야생형 및 유 전적으로 변형 된 균주 모두에 적합하며 시아 노 박테리아의 대사 공학을 촉진 할 수 있습니다.

시아 노 박테리아의 글리코겐 함량 측정

OrganoCat은 리그닌, 발효 설탕 및 셀룰로오스 펄프로 온화한 조건하에서 리뇨셀룰로오스의 전처리 및 분획을 위한 방법입니다. 2,5푸란카르복실산을 촉매로 적용한 생원성, 이중성 용매 시스템과 2-메틸테트라하이드로푸란에서 OrganoCat 제품은 간단한 제품 회복을 위해 시상화됩니다.

오가노캣 공정을 이용한 리뇨셀룰로오스 바이오매스의 분획

깊은 유텍 성 용매 기반, 마이크로 파 지원 전처리는 리그노 셀룰로오스 분획 및 고순도 리그닌 복구를위한 녹색, 빠르고 효율적인 공정입니다.

특이한 지중해 리그놀룰로오스 잔류물에서 초고속 리닌 추출

여기서, 우리는 초본 식물 바이오 매스에서 리그닌 함량의 추정을위한 수정 된 TGA 방법을 제시한다. 이 방법은 리그닌과 특정 티오에테르 결합을 형성하여 리그닌 함량을 추정하고, 리그닌 함량 추정을 위해 상대적으로 작은 샘플을 필요로 하기 때문에 클라슨 방법에 비해 이점을 제시한다.

티오글리콜산(TGA)을 이용한 식물바이오매스 리그닌 함량 추정

학습하세요 식물 바이오매스에서 크리스탈 셀룰로오스 함량을 추정하는 Updegraff 방법을. 아세트산과 질산 처리로 헤미셀룰로오스와 리그닌을 제거하고 안트론 분석으로 정량합니다. 이 프로토콜은 식물 세포벽 구성 연구에 필수적입니다.

Updegraff 방법을 사용하여 식물 바이오매스의 크리스탈 셀룰로오스 함량 추정

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