Name: Tinción de inmunofluorescencia de montaje completo, imágenes confocales y reconstrucción 3D del nódulo sinoauricular y auriculoventricular en el ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Aprende a realizar tinción de inmunofluorescencia de montaje completo en corazones de ratón para visualizar el nódulo sinoauricular y auriculoventricular. Este protocolo permite el análisis 3D de la morfología cardíaca.

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Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Becas de China (CSC, a R. Xia), el Centro Alemán de Investigación Cardiovascular (DZHK; 81X2600255 a S. Clauss, 81Z0600206 a S. Kääb), la Fundación Corona (S199/10079/2019 a S. Clauss), el SFB 914 (proyecto Z01 a H. Ishikawa-Ankerhold y S. Massberg y proyecto A10 a C. Schulz), el ERA-NET sobre Enfermedades Cardiovasculares (ERA-CVD; 01KL1910 a S. Clauss) y la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (a S. Clauss). Los financiadores no tuvieron ningún papel en la preparación del manuscrito.

El cuidado de los animales y todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado y Ética Animal de la Universidad de Munich, y todos los procedimientos realizados en ratones fueron aprobados por el Gobierno de Baviera, Munich, Alemania (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). Los ratones C57BL6/J fueron comprados en el Laboratorio Jackson.
NOTA: La figura 1 muestra los instrumentos necesarios para el experimento. La figura 2 muestra una ilustración de la anatomía cardíaca macroscópica. La Figura 3 muestra la ubicación de SAN y AVN en un corazón de ratón adulto. La figura 4 muestra la muestra preparada cargada en la microscopía confocal.
1. Preparativos
<ol><li>Prepare una solución de formaldehído al 4% (PFA al 4%) diluyendo 10 ml de solución de formaldehído al 16% en 30 ml de PBS.</li>
	<li>Prepare una solución de sacarosa al 15% y una solución de sacarosa al 30% disolviendo 15 g y 30 g de sacarosa en polvo en 100 ml de PBS, respectivamente. Una vez disuelto completamente el polvo de sacarosa, filtrar la solución con un filtro de jeringa de 0,2 μm antes de conservarla a 4 °C.</li>
	<li>Prepare un gel de agarosa al 3% -4%, agregue 3 g o 4 g de polvo de agarosa y 100 ml de 1x TAE (diluido de una solución madre de 50x TAE) en un vaso de precipitados. Coloque el vaso de precipitados en un agitador magnético y hiérvalo hasta que la agarosa se disuelva por completo.</li>
	<li>Prepare el plato de disección vertiendo suavemente 30 ml de gel de agarosa (3% -4%) en una placa de Petri de 100 mm de diámetro. Deje la placa de Petri en el banco a temperatura ambiente para que se enfríe y se endurezca.</li>
	<li>Prepare la solución de bloqueo y la solución de lavado de acuerdo con las recetas proporcionadas en la Tabla 1. Prepare todas las soluciones preparadas el día de su uso. No se recomienda el almacenamiento a largo plazo.</li>
	<li>Preparar las soluciones de anticuerpos diluyéndolas en frío (4 °C) 1x PBS, proteger la dilución de la luz (por ejemplo, envolviendo papel de aluminio alrededor) y mantener las diluciones en hielo hasta que se utilicen. Diluir los anticuerpos poco antes de la incubación. Evite dejar los anticuerpos diluidos a temperatura ambiente. NOTA: La dilución de anticuerpos apropiada debe probarse con muestras de tejido comparables mediante la realización de una tinción inmunofluorescente convencional. Aquí, probamos los anticuerpos teñiendo secciones congeladas cortadas a un espesor de 10 μm.</li>
</ol>2. Sustracción de órganos y preparación de tejidos
<ol><li>Anestesia al ratón colocándolo en una cámara de incubación conectada a un vaporizador de isoflurano. Ajuste el vaporizador para que entregue 4-5% de isoflurano (96-95% de oxígeno, respectivamente). NOTA: La anestesia completa se confirma por la pérdida de la reacción postural y el reflejo de enderezamiento al hacer rodar suavemente la cámara hasta que el ratón se coloca sobre su espalda.</li>
	<li>Coloque el ratón en posición supina sobre la mesa quirúrgica. Coloque la nariz del ratón en una máscara de anestesia conectada a un circuito Bain modificado con su tubo interior conectado al vaporizador de isoflurano. Para mantener la anestesia, use isoflurano al 1-2% en oxígeno a una velocidad de flujo de 1 L / min. Elimine el exceso de vapor anestésico del ratón a través del tubo exterior de la máscara y extraiga a través de un recipiente de carbón activado, que absorbe el exceso de gas anestésico.</li>
	<li>Cuando se logre la anestesia completa, inyecte fentanilo para analgesia (0,1 μg/25 g de peso corporal i.p.).</li>
	<li>Cuando el reflejo de pellizco del dedo del pie es indetectable, haga un corte claro desde la yugula hasta la sínfisis usando tijeras de iris para eliminar el pelaje y la piel. Haga otro corte de izquierda a derecha debajo de las costillas usando tijeras de iris para abrir cuidadosamente el abdomen.</li>
	<li>Vive un poco el xifoide usando pinzas curvas para permitir cortar el diafragma de izquierda a derecha sin lesionar ningún órgano. Corte la caja torácica en una línea axilar medial en ambos lados usando tijeras de iris para voltearla cranealmente y permitir el acceso al corazón.</li>
	<li>Cortar la vena cava inferior y la aorta torácica descendente a nivel del diafragma con tijeras de iris. Perfore el corazón con una aguja de 27 G en el área del ápice y luego empuje cuidadosamente la aguja hacia el ventrículo izquierdo (VI). Inyecte suavemente 5-10 ml de PBS helado en el VI para perfundir el corazón. NOTA: El color del corazón debe cambiar de rojo a gris, lo que indica una perfusión exitosa con PBS.</li>
	<li>Levante con cuidado el ápice del corazón con una pinza que permita cortar los vasos grandes y extraer el corazón.</li>
	<li>Extirpe el corazón cortando las arterias y venas grandes lo más lejos posible del corazón para evitar cualquier daño a la vena cava superior (SVC). Conserve el SVC, ya que servirá como hito importante durante el procesamiento posterior.</li>
	<li>Después de la extracción del corazón, apague el vaporizador de isoflurano.</li>
	<li>Coloque el corazón en un plato de disección lleno de PBS helado bajo el microscopio de disección. Después de determinar la izquierda / derecha y la parte frontal / posterior del corazón, gire el corazón con la parte frontal del corazón en la parte inferior del plato (para exponer los vasos grandes que se encuentran en la parte posterior).</li>
	<li>Inmovilizar el corazón colocando pequeños alfileres a través del ápice y el apéndice auricular izquierdo (LAA) en la agarosa en la parte inferior de la placa de disección (Figura 2A). Usando pinzas finas y tijeras, retire cuidadosamente el tejido no cardíaco alrededor de la VCS y la vena cava inferior (VCI) (p. ej., pulmones, grasa, pericardio) para exponer la región intercava (Figura 3A).</li>
	<li>Retire la mayoría de los ventrículos cortando paralelo el surco entre los ventrículos y las aurículas con la microtijera. Preservar una pequeña parte del tejido ventricular para la carga posterior en el anillo de plexiglás.</li>
	<li>Para la fijación y deshidratación, poner la muestra (que contiene las aurículas, SVC y IVC) en PFA al 4% durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Al día siguiente, transfiera el corazón a una solución de sacarosa al 15% durante 24 horas a 4 °C.</li>
	<li>Al día siguiente, transfiera el corazón a una solución de sacarosa al 30% durante 24 horas a 4 °C. NOTA: Para la fijación y deshidratación en los pasos 2.13, 2.14 y 2.15, las muestras se dejan a 4°C sin agitación ni balanceo.</li>
</ol>3. Tinción de inmunofluorescencia de montaje completo
<ol><li>Lavar el corazón en Triton X-100 al 1% diluido en PBS y bloquear y permeabilizar en solución de bloqueo (Tabla 1) durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Colocar el corazón en un tubo de 1,5 ml e incubar con conexina-43 de conejo anti-ratón (dilución de 1:200) y anticuerpos anti-ratón HCN4 de rata (dilución de 1:200) diluidos con solución bloqueante durante 7 días a 4 °C. NOTA: La concentración óptima de anticuerpos primarios debe probarse antes de utilizar las hojas de datos como orientación. Otros antígenos de interés también podrían teñirse en este paso, siempre y cuando la especie huésped del antígeno primario sea diferente de las demás. Una mayor concentración de Triton X-100 puede ayudar a obtener una tinción de anticuerpos más eficiente como se demostró antes de10, pero la concentración puede determinarse individualmente.</li>
	<li>Después de 7 días, retire la solución que contiene anticuerpos primarios con una pipeta y lave el corazón con una solución Triton X-100 al 1% 3 veces (cada vez durante 1 h a temperatura ambiente en el agitador orbital).</li>
	<li>Después del lavado, incubar el corazón = con Alexa Fluor 488 cabra anti-rata IgG (dilución de 1:200) y Alexa Fluor 647 cabra anti-conejo IgG (dilución de 1:200) durante 7 días a 4 °C.</li>
	<li>Después de 7 días, retire toda la solución que contiene los anticuerpos secundarios con una pipeta. Luego lave el corazón con solución de lavado (Tabla 1) 3 veces (cada vez durante 1 h a temperatura ambiente en el agitador orbital).</li>
	<li>Para teñir los núcleos, incubar el corazón en solución DAPI (10 μg/ml) durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Al día siguiente, lave el corazón con solución de lavado 3 veces (cada vez durante 1 h a temperatura ambiente en el agitador orbital). NOTA: Para el bloqueo, permeabilización, incubación de anticuerpos y tinción DAPI en los pasos 3.1, 3.2, 3.4 y 3.6, dejar las muestras en estado estacionario a 4 °C, no es necesario agitar. El tejido teñido podría conservarse completamente cubierto con solución de lavado a 4 °C y protegido de la luz durante unos días hasta obtener imágenes en el microscopio confocal.</li>
</ol>4. Microscopía confocal
<ol><li>Prepare los anillos de plexiglás y llénelos con plastilina (Figura 1). En el centro de la plastilina se forma un pequeño surco en el centro para cargar el corazón. Haga una ranura poco profunda, ya que sería más fácil adquirir un plano de imagen plana, y ajustar el espacio y evitar burbujas de aire entre la muestra y los cubreobjetos en el paso 4.4.</li>
	<li>Utilice la misma muestra de corazón para obtener imágenes de SAN y AVN secuencialmente. Para las imágenes SAN, cargue directamente el corazón, mientras que para las imágenes AVN, realice la microdisección antes.<ol><li>Imágenes del SAN<ol><li>Identificar la RAS por puntos de referencia anatómicos: se encuentra en el lado dorsal del corazón dentro de la región intercava (la región entre la vena cava superior e inferior). La crista terminalis (CT) es la raya muscular entre la RAS y la RAA.</li>
			<li>Coloque el corazón en la ranura de plastilina con la parte posterior del corazón hacia arriba. Agregue PBS al corazón para desplazar todo el aire dentro de la cavidad hasta que el corazón esté completamente cubierto con PBS (generalmente unas pocas gotas de PBS son suficientes).</li>
			<li>Bajo el microscopio de disección, presione suavemente el RAA, la LAA y las partes restantes del ventrículo izquierdo en la plastilina para fijar el corazón. Asegúrese de que toda la región intercaval y la crista terminalis puedan verse claramente (no cubiertas por plastilina). El área que se visualizará se muestra en la Figura 3A.</li>
		</ol></li>
		<li>Imágenes AVN<ol><li>Después de terminar la obtención de imágenes de SAN, recoja la misma muestra y posteriormente utilícela para la imagen AVN. Para la microdisección AVN, coloque el corazón = en una placa de disección bajo el microscopio de disección.</li>
			<li>Orientar el corazón con el lado derecho hacia arriba (incluidas las partes restantes del ventrículo derecho). Coloque clavos a través de la parte restante de la pared libre del VI (que ahora está en la parte inferior) para inmovilizar el tejido (Figura 2B).</li>
			<li>Corte la pared libre de RV restante hacia arriba a través de la válvula tricúspide y la vena cava superior. Luego voltee el RV y la AR para exponer el tabique interventricular e interauricular. (Figura 3B) NOTA: Preste atención a no dañar el seno coronario (CS), ya que es un hito anatómico importante para encontrar el triángulo de Koch que luego permite localizar el AVN. El SC corre transversalmente en el surco auriculoventricular izquierdo en el lado posterior del corazón, y la abertura del orificio CS se encuentra entre la VCI y la válvula tricúspide en la parte inferior del tabique interauricular (Figura 3A y B).</li>
			<li>Identificar el triángulo de Koch que se puede encontrar en la superficie endocárdica de la aurícula derecha, bordeado anteriormente por la línea de bisagra de la valva septal de la válvula tricúspide (TV), y posteriormente por el tendón de Todaro. La base está formada por el orificio del seno coronario (Figura 3B). Dado que esta es la región objetivo para las imágenes AVN, debe ser claramente visible.</li>
			<li>Transfiera el corazón a la ranura de plastilina dentro del anillo de plexiglás con el triángulo de Koch claramente expuesto (es decir, no cubierto por plastilina). Presione suavemente el tejido alrededor del triángulo de Koch en la plastilina para fijar la muestra. Agregue PBS al corazón para desplazar todo el aire dentro de la cavidad hasta que el corazón esté completamente cubierto con PBS (generalmente unas pocas gotas de PBS son suficientes).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Aplique silicona en los bordes de los anillos de plexiglás para permitir cubrir los corazones cargados dentro de los anillos de plexiglás llenos de plastilina con cubreobjetos.</li>
	<li>Presione suavemente la parte posterior de la plastilina para exprimir partes del PBS y para unir el corazón al cubreobjetos, evitando cualquier burbuja de aire dentro del área de imágenes. NOTA: Asegúrese de que las regiones de interés no estén dobladas y cubiertas durante el prensado de la parte posterior de la plastilina. Un plano plano de imagen sin sobrecompresión de la muestra es necesario para conservar la anatomía y para obtener imágenes confocales adecuadas de las muestras. Para la RAS, es importante asegurarse de que la región intercava esté claramente expuesta. Para AVN, el triángulo de Koch debe estar completamente expuesto.</li>
	<li>Coloque las muestras de tinción de montaje completo boca abajo en la plataforma del microscopio confocal. El SAN/AVN expuesto unido al cubreobjetos está ahora en la parte inferior de la plataforma del microscopio (Figura 4). NOTA: Para tomar imágenes, utilizamos el Carl Zeiss LSM800 con Airyscan Unit y el software ZEN 2.3 SP1 negro.</li>
	<li>Elija la placa "BP420-480 + LP605" para la excitación de Alexa Fluor 647 conjugado anti-HCN4. Varíe la ganancia maestra de 650-750.</li>
	<li>Tome una imagen general de toda la región SAN y AVN mediante la función Tile Scan . A continuación, seleccione la región positiva para HCN4 haciendo clic y agregando un cuadrado en la imagen general alrededor del área de interés que se escaneará.</li>
	<li>Compruebe los parámetros, incluidas las placas y la ganancia maestra para los canales restantes (Alexa Fluor 488 y DAPI) del microscopio confocal y configúrelos como se describe en el paso 4.6.</li>
	<li>Ajuste lentamente el enfoque de arriba a abajo de la muestra para obtener una vista previa de toda la muestra y establecer el primero y el último para el rango de pila Z. Establezca un intervalo óptimo para la pila Z en función del grosor de la muestra óptica. Usamos un objetivo de 20x y 0.8-1 μm como intervalo para la pila Z.</li>
	<li>Después de que todos los parámetros estén configurados correctamente, analice toda el área de la SAN y AVN.</li>
	<li>Realice la reconstrucción 3D de las imágenes utilizando software (por ejemplo, Imaris versión 8.4.2).<ol><li>Seleccionar procesamiento de imágenes | Resta basal para eliminar las manchas de fondo.</li>
		<li>Seleccione la creación de superficie en la configuración para el canal seleccionado y la región de interés para el procesamiento.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

La anatomía cardíaca ha sido tradicionalmente estudiada utilizando secciones histológicas delgadas11. Sin embargo, estos métodos no preservan la estructura tridimensional del sistema de conducción y, por lo tanto, solo proporcionan información 2D. El protocolo de tinción de inmunofluorescencia de montaje completo descrito aquí permite superar estas limitaciones y se puede usar de forma rutinaria para imágenes SAN y AVN.
En comparación con los métodos estándar, como la i...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62058">Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse</a>. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3 
Julia Vlcek1,2 
Julia Bauer1,2,3 
Stefan K&#228;&#228;b1,3 
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2 
Dominic Adam van den Heuvel1,2 
Christian Schulz1,2,3 
Steffen Massberg1,2,3 
Sebastian Clauss1,2,3 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich 
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3 
Julia Vlcek1,2 
Julia Bauer1,2,3 
Stefan K&#228;&#228;b1,3 
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2 
Dominic Adam van den Heuvel1,2 
Christian Schulz1,2,3 
Steffen Massberg1,2,3 
Sebastian Clauss1,2,3 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich 
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62058">Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

Las arritmias son enfermedades comunes que afectan a millones de personas y son la causa de una morbilidad y mortalidad significativas en todo el mundo. A pesar de los enormes avances en el tratamiento y la prevención, como el desarrollo de marcapasos cardíacos, el tratamiento de las arritmias sigue siendo un desafío, principalmente debido al conocimiento muy limitado sobre los mecanismos subyacentes de la enfermedad 1,2,3. Una mejor comprensión tanto de la electrofisiología normal como de la fisiopatología de las arritmias puede ayudar a desarrollar estrategias de tratamiento novedosas, innovadoras y causales en el futuro. Además, para estudiar exhaustivamente la arritmogénesis, es importante localizar y visualizar el sistema de conducción cardíaca específico en modelos animales como el ratón, ya que los ratones son ampliamente utilizados en la investigación electrofisiológica.
Las partes principales del sistema de conducción cardíaca son el nódulo sinoauricular (SAN), donde el impulso eléctrico se genera en células marcapasos especializadas, y el nódulo auriculoventricular (AVN), que es la única conexión eléctrica entre las aurículas y los ventrículos4. Siempre que se alteran las propiedades electrofisiológicas de la RAS y la AVN, pueden ocurrir arritmias como el síndrome del seno enfermo o el bloqueo auriculoventricular que pueden conducir a deterioro hemodinámico, síncope e incluso la muerte, y así subrayar el papel esencial de la RAS y la NVA en electrofisiología y arritmogénesis5.
Los estudios exhaustivos sobre SAN o AVN requieren una localización y visualización precisas de ambas estructuras, idealmente dentro de su entorno fisiológico. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño y ubicación dentro del miocardio de trabajo, sin establecer una estructura macroscópicamente visible clara, estudiar la anatomía y electrofisiología de SAN y AVN es un desafío. Los puntos de referencia anatómicos se pueden usar para identificar aproximadamente la región que contiene SAN y AVN 6,7,8. En resumen, la RAS se encuentra en la región intercava de la aurícula derecha adyacente a la crista terminal muscular (TC), la AVN se encuentra dentro del triángulo de Koch establecido por la válvula tricúspide, el ostium del seno coronario y el tendón de Todaro. Hasta ahora, estos puntos de referencia anatómicos se utilizaron principalmente para localizar, eliminar y luego estudiar SAN y AVN como estructuras individuales (por ejemplo, por histología convencional). Sin embargo, para comprender mejor la compleja electrofisiología de SAN y AVN (por ejemplo, los efectos reguladores de las células adyacentes del miocardio de trabajo), es necesario estudiar los sistemas de conducción dentro del entorno fisiológico 3D.
La tinción de inmunofluorescencia de montaje completo es un método que se utiliza para estudiar las estructuras anatómicas in situ , preservando la integridad del tejido circundante9. Aprovechando el software de microscopía confocal y análisis de imágenes, SAN y AVN se pueden visualizar con anticuerpos marcados con fluorescencia dirigidos a canales iónicos expresados específicamente en estas regiones.
El siguiente protocolo explica los pasos necesarios para realizar un método de tinción de montaje completo bien establecido para la localización y visualización de microscopios SAN y AVN. Específicamente, este protocolo describe cómo (1) localizar SAN y AVN por puntos de referencia anatómicos para preparar estas muestras para tinción y análisis de microscopía (2) realizar tinción de inmunofluorescencia de montaje completo de los marcadores de referencia HCN4 y Cx43 (3) para preparar muestras SAN y AVN para microscopía confocal (4) para realizar imágenes confocales de SAN y AVN. También describimos cómo se puede modificar este protocolo para incluir tinción adicional de miocardio circundante o células no miocitos que funcionan, como fibras nerviosas autónomas, lo que permite una investigación exhaustiva del sistema de conducción cardíaca dentro del corazón.

<table><tbody><tr><td><sistema de vaporizador >anestesia fuerte< / fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>isoflurano&nbsp;</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910</td><td>Incluye una cámara de inducción, una unidad de evacuación de gases y filtros de carbón</td></tr><tr><td>vegetal Circuito Bain modificado</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>73-4860</td><td>Incluye una máscara de anestesia para ratones</td></tr><tr><td>Plataforma quirúrgica</td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI-M</td><td></td></tr><tr><td>In vivo instrumentación</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iris</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de tejido</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Alfileres de pañuelo</td><td>Fine Science Tools</td><td>26007-01</td><td>Podría usar agujas de 27G como sustituto</td></tr><tr><td>General lab instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital agitador Sunlab</td><td></td><td>D-8040</td><td></td></tr><tr><td>Agitador magnético</td><td>IKA&nbsp;</td>Pipeta <td>básica</td><td></td>RH</tr><tr><td>, volumen 10 y micro; L, 100 y micro; L, 1000 y micro; L</td><td>Microscopios Eppendorf</td><td>Z683884-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>estereoscópico de disección con zoom&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10836-004</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal de barrido láser</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 8.4.2</td><td>Oxford instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN 2.3 SP1 negro</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>General Lab Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 y micro; m filtro de jeringa</td><td>Sartorius</td><td>17597</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri de 100 mm</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>27G aguja</td><td>BD Microlance 3</td><td>300635</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubo cónico de polipropileno</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>5ml Jeringa</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Cubrecubreobjetos</td><td>Thermo Scientific</td><td>7632160</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>30121872</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Sigma</td><td>20-158</td><td>Componentes de la solución de</td></tr><tr><td>formaldehído al 16%</td> de TEA <td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>28908</td><td>uso como solución al 4%&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Merck</td><td>100063</td><td>Componentes del TÉ</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Biozym</td><td>850070</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1X) Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Sigma</td><td>NS02L</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S1888-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Roche</td><td>TRIS-RO</td><td>Componentes de TEA</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ml</td><td>diluido al 1% en PBS</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Drugs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fentanyl 0.5&nbsp; mg/10 y nbsp; mL</td><td>Braun Melsungen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano 1 mL/mL</td><td>Cp-pharma</td><td>31303</td><td></td></tr><tr><td>Oxígeno 5 L</td><td>Linde</td><td>2020175</td><td>Incluye un regulador</td></tr> <tr><td>de presión<fuerte>Anticuerpos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-Conejo IgG Alexa Fluor&nbsp; 488 y semejanzas;</td><td>Tecnología de Señalización Celular</td><td>#4412</td><td>diluido a 1:200</td></tr><tr><td>IgG anti-Rata de cabra Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>#A-21247</td><td>diluido a 1:200</td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Triclorhidrato, Trihidrato (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>diluido a 1:1000</td></tr><tr><td>Conejo Anti-Connexina-43</td><td>Sigma</td><td>C6219</td><td>diluido a 1:200</td></tr><tr><td>Rata anti-HCN4 (SHG 1E5)</td><td>Invitrogen</td><td>MA3-903</td><td>diluido a 1:200</td></tr><tr><td><fuerte>Otro</fuerte></td>Anillo <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> de <td>plexiglás</td><td></td></tr><tr><td>Plastilina</td><td>Cernit</td><td>49655005</td><td></td></tr> Silikonpasten de diseño propio e impresa en 3D<tr><td>, Baysilone</td><td>VWR</td><td>291-1220</td><td></td></tr><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse, C57BL/6</td><td>El Laboratorio</td><td></td><td></td> Jackson</tr></tbody></table>

tinción de inmunofluorescencia de montaje completo, imágenes confocales y reconstrucción 3d del nódulo sinoauricular y auriculoventricular en el ratón

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

La señal eléctrica generada fisiológicamente por las células marcapasos en el nódulo sinoauricular (SAN) se conduce a través del sistema de conducción, que incluye el nódulo auriculoventricular (AVN), para permitir la excitación y contracción de todo el corazón. Cualquier disfunción de SAN o AVN resulta en arritmias, lo que indica su papel fundamental en la electrofisiología y la arritmogénesis. Los modelos de ratón son ampliamente utilizados en la investigación de arritmias, pero la investigación específica de SAN y AVN sigue siendo un desafío.
La RAS se encuentra en la unión de la crista terminal con la vena cava superior y la AVN se encuentra en el vértice del triángulo de Koch, formado por el orificio del seno coronario, el anillo tricúspide y el tendón de Todaro. Sin embargo, debido al pequeño tamaño, la visualización por histología convencional sigue siendo un desafío y no permite el estudio de SAN y AVN dentro de su entorno 3D.
Aquí describimos un enfoque de inmunofluorescencia de montaje completo que permite la visualización local de SAN y AVN de ratón marcados. La tinción de inmunofluorescencia de montaje completo está diseñada para secciones más pequeñas de tejido sin necesidad de seccionamiento manual. Para este propósito, se disecciona el corazón del ratón, se elimina el tejido no deseado, seguido de fijación, permeabilización y bloqueo. Las células del sistema de conducción dentro de SAN y AVN se tiñen con un anticuerpo anti-HCN4. La microscopía de barrido láser confocal y el procesamiento de imágenes permiten diferenciar entre las células ganglionares y los cardiomiocitos que funcionan, y localizar claramente SAN y AVN. Además, se pueden combinar anticuerpos adicionales para etiquetar otros tipos de células, como las fibras nerviosas.
En comparación con la inmunohistología convencional, la tinción de inmunofluorescencia de montaje completo preserva la integridad anatómica del sistema de conducción cardíaca, lo que permite la investigación de AVN; especialmente en su anatomía e interacciones con el miocardio circundante y las células no miocitarias.

Mediante el uso del protocolo descrito anteriormente, se pueden realizar imágenes de microscopía confocal de SAN y AVN de manera confiable. La tinción específica del sistema de conducción utilizando anticuerpos fluorescentes dirigidos a HCN4 y la tinción del miocardio de trabajo utilizando anticuerpos fluorescentes dirigidos a Cx43 permite la identificación clara de SAN (Figura 5, Video 1) y AVN (Figura 6, Video 2</strong...

Proporcionamos un protocolo paso a paso para la tinción de inmunofluorescencia de montaje completo del nódulo sinoauricular (SAN) y el nódulo auriculoventricular (AVN) en corazones murinos.

Tinción de inmunofluorescencia de montaje completo, imágenes confocales y reconstrucción 3D del nódulo sinoauricular y auriculoventricular en el ratón

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

Este protocolo explica los pasos necesarios para realizar microdisección, inmunofluorescencia de montaje completo, tinción y microscopía específicamente para el nódulo sinusal y el nódulo AV en el ratón. La metodología de montaje completo es ventajosa para abordar la localización y morfología 3D exactas del seno y el nódulo AV y para examinar la relación con el tejido circundante. La morfología del tejido se conserva considerablemente, con una mínima deshidratación tisular y rotura física.Para comenzar, perfore el corazón con una aguja de calibre 27 en el área del ápice empujando cuidadosamente la aguja hacia el ventrículo izquierdo e inyectando suavemente de cinco a 10 mililitros de PBS helado para profusar el corazón. Levante con cuidado el corazón con una pinza y corte los vasos grandes para extraer el corazón. Coloque el corazón en una placa de disección llena de PBS helado bajo el microscopio de disección.Después de determinar la orientación del corazón, gire el corazón para que la parte delantera del corazón quede en el fondo del plato. Inmovilice el corazón colocando pequeños alfileres a través del ápice y el apéndice auricular en la agarosa en el fondo de la placa de disección. Con pinzas finas y tijeras, retire cuidadosamente el tejido no cardíaco alrededor de la vena cava superior e inferior.Para exponer la región intercava, extirpe la mayoría de los ventrículos cortando paralelos al surco entre los ventrículos y las aurículas con unas microtijeras. Para la fijación y deshidratación, coloque la muestra en paraformaldehído al 4% durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, transfiera el corazón a una solución de sacarosa al 15% y cobrólelo durante 24 horas a cuatro grados centígrados.Después de la incubación, transfiera el corazón a una solución de sacarosa al 30% durante otras 24 horas a cuatro grados centígrados. Lavar el corazón en 1%Triton X-100 diluido en PBS. Luego bloquee y permeabilice en solución de bloqueo durante la noche a cuatro grados centígrados.Coloque el corazón en un tubo de 1,5 mililitros e incube con anticuerpos Connexin 43 anti-ratón de conejo y anti-ratón HTN4 de rata diluidos con solución bloqueante durante siete días a cuatro grados centígrados. Después de siete días, retire la solución que contiene anticuerpos primarios con una pipeta. Lave el corazón con la solución 1%Triton X-100 tres veces durante una hora por lavado en el agitador orbital.Repita los pasos de lavado después de la incubación con anticuerpos secundarios y DAPI. Después de preparar los anillos de plástico y llenarlos con plastilina, coloque el corazón en la ranura de plastilina con la parte posterior del corazón hacia arriba. Identifique la SAN, que se encuentra en el lado dorsal del corazón con la región intercaval.Agregue PBS al corazón para desplazar todo el aire dentro de la cavidad hasta que el corazón esté completamente cubierto con PBS. Aplica silicona en los bordes del anillo de plástico. Presione suavemente la parte circundante de la muestra en la plastilina para fijar el corazón y cubrir el corazón con un cubreobjetos.A continuación, presione suavemente la parte posterior de la plastilina para exprimir un poco de PBS y sujetar el corazón a la cubierta con cuidado de evitar burbujas de aire dentro del área de la imagen. Coloque las muestras de tinción de montaje completo boca abajo en la plataforma del microscopio confocal y proceda con la obtención de imágenes como se describe en el manuscrito de texto. Los parámetros para cada canal del microscopio confocal se ajustan mediante el software correspondiente.Este protocolo se utilizó para realizar imágenes de microscopía confocal tanto del ganglio sinoauricular como del ganglio auriculoventricular en corazones murinos. La tinción específica del sistema de conducción y del miocardio de trabajo con anticuerpos fluorescentes, dirigidos a HCN4 y Connexin 43 respectivamente, permite identificar el nódulo sinoauricular y el ganglio auriculoventricular dentro de la anatomía intacta. Este protocolo de tinción de montaje completo permite estudiar la interacción de diferentes tipos de células mediante el uso de varios anticuerpos.

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JoVE Journal

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Este video muestra el procedimiento para aislar el nodo sinoauricular o SAN del corazón del ratón. La SAN alberga las células sinoauriculares que inician los latidos del corazón mediante la generación de potenciales de acción espontáneos.

Aislamiento de nodo sinoauricular a partir de un modelo de ratón: un procedimiento para recolectar un nodo SA del corazón murino

Utilizando resonancias magnéticas (humanas), software de imágenes 3D y análisis inmunohistológicos, documentamos los cambios en los ventrículos laterales del cerebro. El mapeo longitudinal en 3D de los cambios en el volumen del ventrículo lateral y la caracterización de los cambios celulares periventriculares que ocurren en el cerebro humano debido al envejecimiento o la enfermedad se modelan en ratones.

Modelado 3D del lateral Ventrículos y histológico Caracterización de Tejidos periventricular en los seres humanos y de ratón

Métodos se demuestran para el aislamiento de miocitos nódulo sinoauricular (SAMs) de ratones adultos para estudios de electrofisiología de pinzamiento zonal o de formación de imágenes. Las células aisladas se pueden utilizar directamente o se pueden mantener en cultivo para permitir la expresión de proteínas de interés, tales como la prensa codificados genéticamente.

Los métodos para el aislamiento, cultivo y caracterización funcional de los miocitos del nodo sinusal ratones adultos

A continuación, se presenta un protocolo para el mapeo óptico de la actividad eléctrica de la aurícula derecha del ratón y, especialmente, el nodo sinoauricular, con una resolución espacial y temporal alta.

-Alta resolución de mapeo óptico del nodo sinoauricular Ratón

Aquí, describimos un protocolo para montaje entero de la inmunofluorescencia y análisis volumétrico cuantitativo basado en imágenes de embriones de ratón de etapa temprana. Presentamos esta técnica como un potente enfoque cualitativa y cuantitativamente evaluar estructuras cardiacas durante el desarrollo, y proponer que sea ampliamente adaptable a otros sistemas del órgano.

Análisis de la inmunofluorescencia de Whole-mount cuantitativa de las poblaciones progenitoras cardiacas en embriones de ratón

Este protocolo describe la evaluación electrofisiológica de atria murino utilizando un sistema de mapeo óptico con una alta resolución espacial y temporal, incluyendo grabaciones duales de la tensión de la membrana y Ca2 + transitoria bajo programado estimulación a través de un catéter electrodo especializados.

Evaluación electrofisiológica de Atria murino con mapeo óptico alta resolución

Este estudio utiliza una técnica de microscopía (LSFM) de hoja de luz fluorescencia iluminación doble cara combinada con la compensación óptica para estudiar el corazón murino.

Hoja de luz fluorescencia microscopía para el estudio del corazón murino

Este protocolo tiene como objetivo describir una nueva metodología para medir la velocidad de disparo cardíaco intrínseca utilizando el registro de la matriz de microelectrodos de todo el tejido del ganglio sinoauricular para identificar defectos de marcapasos en ratones. Los agentes farmacológicos también se pueden introducir en este método para estudiar sus efectos sobre el marcapasos intrínseco.

Registro de la matriz de microelectrodos de la tasa de disparo del nódulo sinoauricular para identificar defectos intrínsecos de marcapasos cardíacos en ratones

Presentamos un método para la reconstrucción mesoscópica de todo el corazón del ratón mediante la combinación de nuevos avances en la transformación de tejidos y la tinción con el desarrollo de un microscopio de hoja de luz escaneado axialmente.

Imágenes ópticas mesoscópicas del corazón de todo el ratón

Este protocolo demuestra el aislamiento guiado por microscopía y la tinción por inmunofluorescencia de las venas pulmonares murinas. Preparamos muestras de tejido que contienen la aurícula izquierda, las venas pulmonares y los pulmones correspondientes y las teñimos para troponina T cardíaca y conexina 43.

Microdisección y tinción con inmunofluorescencia de mangas miocárdicas en venas pulmonares murinas

El protocolo utiliza microscopía avanzada de lámina de luz junto con métodos de limpieza de tejidos adaptados para investigar estructuras cardíacas intrincadas en corazones de roedores, con un gran potencial para la comprensión de la morfogénesis y la remodelación cardíaca.

Imágenes con lámina de luz para revelar la estructura cardíaca en corazones de roedores

Aprende a realizar tinción de inmunofluorescencia de montaje completo en corazones de ratón para visualizar el nódulo sinoauricular y auriculoventricular. Este protocolo permite el análisis 3D de la morfología cardíaca.

Tinción de inmunofluorescencia de montaje completo, imágenes confocales y reconstrucción 3D del nódulo sinoauricular y auriculoventricular en el ratón (Video) | JoVE Journal

Tinción de inmunofluorescencia de montaje completo, imágenes confocales y reconstrucción 3D del nódulo sinoauricular y auriculoventricular en el ratón

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