الحقن المجهري للأجنة وتحديد المتحورات بالضربة القاضية ل CRISPR / Cas9 Genome edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

دودة القطن هي واحدة من أكثر الآفات تدميرا في جميع أنحاء العالم. يتيح تحرير الجينوم باستخدام تقنية CRISPR / Cas9 إجراء مزيد من الأبحاث حول وظيفة الجينات والتفاعل بين الجينات المختلفة في هذا الكائن الحي. الميزتان الرئيسيتان لهذه التقنية هما أنها تتمتع بخصوصية عالية وقابلة للوراثة.

من أجل اختيار أهداف sgRNA ، انتقل إلى موقع CRISPR على الإنترنت للبحث عن مواقع الدليل المحتملة والإكسونات القريبة من المنطقة الخمسة الرئيسية غير المترجمة من الجين. أدخل تسلسل exon في مربع النص وحدد الجينوم المستهدف إلى Helicoverpa armigera. اختر خيار PAM ل 20 BPNGG واترك الإعدادات الأخرى على المعلمات الافتراضية ، وفقا لأدلة المستخدم الخاصة بموقع الويب.

قارن تسلسلات الدليل المتوقعة من البرنامج واختر تسلسل دليل من 20 زوجا أساسيا يحتوي على واحد أو اثنين من الأغوانيس بالقرب من المنطقة الخمسة الرئيسية غير المترجمة بأعلى كفاءة متوقعة وأقل عدد من عدم التطابق لتحسين كفاءة التحرير وتقليل التحرير خارج الهدف. لإعداد الأجنة ، اختر 50 فردا سليما من الذكور الذين يبلغون من العمر ثلاثة أيام والإناث في عمر يومين ، واخلطهم في قفص شبكي نظيف. ضع قطعة من القطن الرطب تحتوي على محلول سكر 10٪ في القفص.

قم بتغطية الأقفاص الصافية بالشاش وقم بإصلاح الشاش بشريط مطاطي. رش الماء على الشاش للحفاظ على رطوبةه. قطع قطعة قماش سوداء إلى حجم مناسب واستبدل الشاش الرطب بهذه القطعة السوداء لتمكين وضع البويضة مجانا لمدة 30 دقيقة.

الصق شريطا على الوجهين على شريحة المجهر. باستخدام الملقط ، الصق البقع بالبيض على التوالي على سطح الشريط على الوجهين. اضغط على هامش كل رقعة للتأكد من أنها تلتصق بإحكام بالشريط.

جمع 50 إلى 100 بيضة لكل شريحة مجهرية. قبل الحقن المجهري ، حافظ على انزلاق المجهر على الجليد لتأخير تطور الأجنة. قم بإعداد الإبرة عن طريق سحب زجاج شعري باستخدام مجتذب ماصة صغيرة كما هو موضح في مخطوطة النص.

طحن طرف الإبرة باستخدام مطحنة صغيرة إلى طرف حاد الحواف. قم بإعداد حلول الحقن عن طريق إضافة ميكرولترين من بروتين Cas9 التجاري و sgRNA إلى الماء الخالي من RNace في أنبوب PCR للحصول على خليط بحجم 10 ميكرولتر. تخلط جيدا عن طريق السحب ووضعها على الجليد.

تعيين معلمات الحاقن الإلكتروني الصغير. قم بتحميل ميكرولترين من الخليط في إبرة باستخدام طرف ماصة microloader ، مما يستنفد أكبر قدر ممكن من الهواء المتبقي في طرف الإبرة. قم بتوصيل إبرة الحقن بجهاز مناور دقيق وتأكد من وجود اتصال وثيق بين الجزأين.

ضع شريحة في طبق بتري وضعها على مسرح المجهر. أدخل طرف الإبرة بعناية في نصف الكرة العلوي للجنين بزاوية 45 درجة. اضغط على الدواسة لتوصيل الخليط إلى الجنين، مما يؤدي إلى توسع طفيف في الجنين.

اسحب الإبرة على الفور من الجنين وحرك طبق بتري بيد واحدة حتى يصبح الجنين التالي قريبا من الإبرة. حقن ما لا يقل عن 300 جنين باستخدام نفس الإجراء لضمان كمية كافية من الفقس. قم بتغطية غطاء أطباق بتري بعد الحقن.

عندما يصبح لون سطح الأجنة مظلما ، ضع نظاما غذائيا اصطناعيا في طبق بتري حول شريحة المجهر. قم بإعداد لوحات استزراع من 24 بئرا واملأ كل بئر إلى 1/3 من طاقتها الحجمية بنظام غذائي اصطناعي. اختر يرقة الفقس باستخدام فرشاة طلاء صغيرة وانقلها إلى لوحة الاستزراع المكونة من 24 بئرا ، بحيث تحتوي البئر الواحدة على يرقة واحدة.

عندما تنمو اليرقة إلى المرحلة الثالثة من instar ، قم بنقلها إلى إيثرا دكتايل زجاجي جديد. انقل البالغين الذكور G-zero المغلقين حديثا والإناث البالغات من النوع البري إلى قفص شبكي جديد بنسبة متساوية. تزويدهم بمحلول سكر بنسبة 10٪ يسقط في كرات قطنية.

الحشرات الخلفية باستخدام الطرق الروتينية حتى جرو G-one. استخدم الملقط لإزالة الساق الخلفية بعناية ووضع كل ساق في أنبوب مصفوفة Lysing Matrix. تجانس الساق الخلفية باستخدام مجانس الأنسجة.

استخراج الحمض النووي الجينومي للعينة المتجانسة باستخدام مجموعة استخراج gDNA التجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تضخيم الجزء الجيني باستخدام التمهيدي التنميط الجيني وظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل من مخطوطة النص. تأكد من النمط الوراثي من خلال خدمة التسلسل الجيني.

ضع أفراد G-one من نفس النمط الوراثي في قفص شبكي واحد ، وعبر ذرية G-one ذاتيا واستمر في الفحص باستخدام نفس الطرق. كان الموقع المستهدف للجين محل الاهتمام موجودا في إكسون الثاني. تم الحفاظ على هذا الموقع بشكل كبير وتم تأكيد جزء النطاق المستهدف من sgRNA المركب باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز.

تم إجراء الكشف عن الطفرات لهدف sgRNA واحد عن طريق تسلسل منتجات PCR من الوحدات الأبوية G-one. وقد أثبتت فعالية استخدام أزواج sgRNA غير المتداخلة عبر إكسونات مختلفة حيث تم تمييز الحذف الكبير للطفرات بسهولة عن المقالي من النوع البري. بعد الحصول على عدد معين من الأفراد المتحورين ، يمكن إجراء تجارب كهروفسيولوجية أو سلوكية لتوضيح وظيفة الجينات والتفاعل بين الجينات المختلفة.