3D-картографическое описание клетки с помощью криомягтической рентгеновской томографии

Рентгеновская томография Cryo Soft может предоставить количественную ценную информацию на клеточном уровне, которая может быть использована как автономная или в сочетании с другими методами визуализации. Изображение датчика в замороженном гидратированном состоянии, которые необходимы для окрашивания или срезания. Кроме того, это высокопроизводительная техника, потому что каждая томограмма собирается всего за несколько минут.

Мягкая рентгеновская криотомография предлагает идеальную платформу для наблюдения за процессом восстановления клеток в инфицированных или дефектных клетках на одноклеточном уровне. Этот метод может сообщать об эффективности новых противовирусных препаратов или генной терапии для обращения вспять инфекции отредактированных фенотипов. Чтобы загрузить образцы в трансмиссионный рентгеновский микроскоп, охладите передаточную камеру жидким азотом до тех пор, пока она не достигнет менее 100 Кельвинов.

Заполните рабочее место дополнительным жидким азотом и включите нагреватель обода рабочей станции. Когда ободок рабочей станции перестанет кипеть, поместите криобокс, содержащий сетки, в соответствующие места на рабочем месте в условиях крио и загрузите сетки на ранее охлажденные держатели образцов. Загрузите держатели на шаттл и защитите их крышками.

Загрузите челнок в передаточную камеру при температуре менее 100 Кельвинов и откачайте камеру до низкого вакуума. Прикрепите передаточную камеру к микроскопу и следуйте вакуумной процедуре на экране, чтобы загрузить шаттл передаточной камеры в микроскоп. Как только шаттл окажется в микроскопе с образцами, используйте роботизированную руку микроскопа, чтобы перенести один держатель образца на стадию образца.

Для визуализации сетки с помощью онлайн-микроскопа видимого света выберите камеру микроскопа видимого света и включите светодиодный источник микроскопа видимого света для визуализации яркого поля. Щелкните Тета «Движение», «Управление», «Образец» и «Образец», чтобы повернуть образец на минус 60 градусов так, чтобы он был обращен к объективу микроскопа видимого света, а затем выберите «Управление движением» и «Образец» и измените образец X и образец Y, чтобы переместить образец в ожидаемые центрированные положения. Выберите «Микроскоп», «Сбор», «Настройки сбора», «Режимы сбора», «Непрерывный» и «Пуск» и нажмите «Управление движением» и «Образец», чтобы выбрать образец Z, чтобы уточнить фокус с меньшими шагами до пяти микрон, пока ячейки и /или отверстия углеродной поддерживающей пленки не окажутся в фокусе.

Затем выберите Микроскоп, Приобретение, Настройки получения, Режимы захвата, Мозаика и Начать, чтобы начать получение полной мозаичной карты сетки в режиме яркого поля, используя значения по умолчанию для мозаики. Для мозаичной визуализации в режиме флуоресценции выключите светодиодный источник микроскопа видимого света для визуализации яркого поля и выберите светодиодный источник света, соответствующий желаемой длине волны возбуждения и соответствующий оптический фильтр вручную на установке. Выберите «Микроскоп», «Сбор», «Настройки захвата», «Режимы захвата», «Непрерывный» и «Пуск» и нажмите «Управление движением» и «Образец», чтобы выбрать образец Z, чтобы уточнить фокус на флуоресцентном изображении.

Затем щелкните Микроскоп, Приобретение, Настройки получения, Режимы получения, Мозаика и Начать, чтобы получить мозаичную карту, сохраняющую позиционные параметры X и Y из мозаики яркого поля. Затем выключите светодиодный источник света. Для получения рентгеновской мозаики измените выходную щель на пять микрон и используйте односекундную экспозицию в MISTRAL.

Выберите «Микроскоп», «Сбор», «Настройки сбора», «Настройки камеры» и «Биннинг», чтобы настроить фокус с помощью примера Z-трансляции. Выберите Управление движением и Образец, чтобы выбрать образец Z.Начиная с шагов в пять микрон, уточните фокус до шагов 0,5 мкм, пока ячейка или отверстия из углеродной фольги не будут хорошо сфокусированы. Чтобы получить мозаичную карту квадрата сетки, щелкните Микроскоп, Приобретение, Настройки приобретения, Режим получения, Мозаика и Пуск.

После получения карты щелкните Управление движением и Образец и измените образец X и образец Y, чтобы переместить образец в положение плоского поля. Установите время экспозиции на одну секунду в MISTRAL. Затем нормализуйте полученную мозаику по изображению плоского поля, чтобы получить передачу и сохранить нормализованную мозаику.

Чтобы выровнять образец по оси вращения с поворотом на нулевые градусы, выберите Управление движением и Образец и измените образец X, образец Y и образец Z, чтобы сосредоточиться на объекте ячейки, помещенной на ось вращения. Чтобы повернуть образец в положительное тета-положение, выберите Управление движением и Образец и измените тета образца на положительную тету. Используйте инструмент «Линия», чтобы нарисовать линию на объекте ячейки, помещенной на ось поворота.

Чтобы повернуть образец в отрицательное тета-положение, выберите Управление движением и Образец и измените тета-образец на отрицательный тета. Используйте инструмент «Линия», чтобы нарисовать линию на объекте ячейки, помещенной на ось поворота. Находясь в положительном или отрицательном тета-положении, используйте Z-трансляцию образца для перемещения выбранного объекта в центральное положение между обеими линиями и повторяйте вращение образца до тех пор, пока не будет получено минимальное расстояние от строки до строки.

Когда тета образца равна нулю, переместите образец X на расстояние, в два раза превышающее расстояние, необходимое для размещения выбранного объекта в центре поля зрения, и переместите пластину зоны X, чтобы вернуть объект обратно в центр поля зрения. Чтобы повторно оптимизировать положение зональной пластины Z по отношению к новой оси вращения, выберите «Микроскоп», «Сбор», «Настройки сбора», «Режимы сбора» и «Focal Series» и нажмите кнопку «Пуск», чтобы записать зональную пластину Z-фокальной серии. Затем щелкните Управление движением и Пластина зоны и выберите пластину зоны Z, чтобы переместить пластину зоны Z в положение, в котором образец находится в фокусе.

Чтобы получить томограмму, щелкните Управление движением и Образец и выберите Образец тета, чтобы переместить отрицательный максимальный угол до плюс 0,1. Нажмите «Микроскоп», «Сбор», «Настройки захвата», «Режимы получения» и «Томография», чтобы установить количество изображений как общее количество углов с учетом изображения под нулем угла и угловым диапазоном, а также установить количество изображений. Выберите «Угол начала» и «Угол конца», щелкните «Микроскоп», «Приобретение», «Настройки сбора», «Настройки камеры» и установите время экспозиции.

Нажмите кнопку Пуск, чтобы начать сбор серии наклона томографии. Идеальный образец должен иметь одиночные ячейки в центре квадратной сетки, встроенные в тонкий слой льда и окруженные хорошо диспергированными золотыми фидуциальными маркерами. Многие различные органеллы, такие как митохондрии, эндоплазматические ретикулы, вакуоли и ядро, должны быть в состоянии быть различимы в окончательной реконструированной томограмме, благодаря количественной реконструкции линейных коэффициентов поглощения.

На этом изображении можно наблюдать квадрат с более высокой плотностью клеток. В этом примере пятно было менее эффективным, что привело к более толстому слою льда с трещинами. Несмотря на то, что некоторые более крупные структуры могут быть распознаны в этом препарате, мелкие детали были потеряны в шуме и зернистой текстуре из-за плохого качества витрификации толстого льда.

Крио-сохраненный образец должен быть минимально обработан, так как большинство артефактов индуцируются при образцах на этой стадии. Обычно, коррелятивную крио-видимую световую фотомикроскопию, вы используете предшествующую криострату томографию. Кроме того, спектральная микроскопия может быть выполнена на соответствующих химических элементах.

Этот протокол заполняет нишу, работая в режиме образца и разрешения, которые недоступны для любого другого метода прямой визуализации, допуская несколько микрон и 30-нанометровое разрешение половинного шага.