Name: Erzeugung und Expansion menschlicher Kardiomyozyten aus mononukleären Zellen des patientenperipheren Blutes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Erfahren Sie die Reprogrammierung peripherer Blutmononuklearzellen zu patientenspezifischen Kardiomyozyten mittels Stammzelltechniken. Dieses reproduzierbare Protokoll ermöglicht Krankheitsmodellierung und Arzneimitteltests für Herz-Kreislauf-Forschung.

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Diese Studie wurde durch den Career Development Award 18CDA34110293 (M-T.Z.), die Additional Ventures AVIF und SVRF Awards (M-T.Z.), die National Institutes of Health (NIH/NHLBI) 1R01HL124245, 1R01HL132520 und R01HL096962 (I.D.) unterstützt. Dr. Ming-Tao Zhao wurde auch durch Startkapital des Abigail Wexner Research Institute am Nationwide Children's Hospital unterstützt.

Die experimentellen Protokolle und die Einverständniserklärung für menschliche Probanden wurden vom Institutional Review Board (IRB) des Nationwide Children's Hospital genehmigt.
1. Herstellung von Zellkulturmedien, Lösungen und Reagenzien
<ol><li>Vorbereiten von PBMC-Medien<ol>
<li>Mischen Sie 20 ml basale PBMC-Kulturmedien (1x) und 0,52 ml Nahrungsergänzungsmittel. Fügen Sie jeweils 20 μL SCF und FLT3 (Stammkonzentration: 100 μg/ml), je 4 μL IL3, IL6 und EPO (Stammkonzentration: 100 μg/ml) und 200 μL L-Glutamin-Alternative (100x) hinzu. Mischen Sie sie gründlich. Filtern Sie in einer sterilen Haube mit einer 0,22-μm-Filtereinheit. Nennen Sie dies als Complete Blood Media.</li>
		<li>Mischen Sie 20 ml basale PBMC-Kulturmedien (1x) und 0,52 ml des Supplements. Fügen Sie 200 μL L-Glutamin-Alternative (100x) hinzu. Mischen Sie sie gründlich. Filtern Sie mit einer 0,22-μm-Filtereinheit. Nennen Sie dies als Supplement Blood Media.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereiten kompletter E8-Medien<ol>
<li>Mischen Sie 500 ml E8-Basalmedien und 10 ml E8-Präparat (über Nacht bei 4 ° C aufgetaut), um vollständige E8-Medien herzustellen. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur (RT) ausgleichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereiten von iPSC-Passaging-Medien<ol>
<li>40 μL Y-27632 Gesteinsinhibitor (1:5.000 Verdünnung, Stammkonzentration: 10 mM) zu 200 ml vollständigem E8-Medium geben. Mischen Sie es gründlich. Vor Gebrauch auf RT ausbalancieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kardiomyozyten-Differenzierungsmedien vorbereiten<ol>
<li>Medium I: Mischen Sie 500 ml RPMI1640 mit 10 ml B27 abzüglich Insulinergänzung (50x).</li>
		<li>Medium II: Fügen Sie ein geeignetes Volumen der CHIR99021 (GSK3-Inhibitor) Brühe zu Medium I (CHIR99021 Endkonzentration von 6 μM) hinzu. Gründlich mischen.</li>
		<li>Medium III: Zu Medium I (IWR-1 Endkonzentration von 5 μM) wird ein geeignetes Volumen IWR-1 (Wnt-Inhibitor) gegeben. Gründlich mischen.</li>
		<li>Medium IV: Mischen Sie 500 ml RPMI1640 mit 10 ml B27-Ergänzung (50x). Gründlich mischen.</li>
		<li>Medium V: Mischen Sie 500 ml RPMI1640 (keine Glukose) mit 10 ml B27-Präparat (50x). Gründlich mischen.</li>
		<li>Medium VI: Fügen Sie ein entsprechendes Volumen der CHIR99021-Brühe zu Medium IV hinzu (CHIR99021-Endkonzentration von 2 μM). Gründlich mischen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereiten von iPSC-CM-Passaging-Medien<ol>
<li>Fügen Sie 10 ml Knockout Serum Replacement (KSR) zu 90 mL Media IV hinzu (KSR-Endkonzentration: 10%). Gut mischen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereiten von iPSC-CM-Gefriermedien<ol>
<li>1 ml DMSO auf 9 ml KSR (Endkonzentrationen: 10 % DMSO/90 % KSR) geben und gut mischen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie mittelbeschichtete Platten für die Basalmembranmatrix vor<ol>
<li>Auftauen des Basalmembranmatrixmediums bei 4 °C über Nacht und aliquot in 1,5 ml Röhrchen. 1 mL dieses Mediums zu 250 mL DMEM/F12-Medien (1:250 Verdünnung) geben und gründlich mischen. 2 ml der verdünnten Lösung pro Vertiefung in eine 6-Well-Platte auftragen und vor Gebrauch 30 min lang in 5 %CO2 bei 37 °C inkubieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. iPSC-Neuprogrammierung von PBMCs
<ol><li>Trennen Sie PBMCs von Blutproben.<ol>
<li>Sammeln Sie Patientenblutproben (~ 5 ml) und übertragen Sie sie in Blutzelltrennröhrchen (siehe Materialtabelle). Mischen Sie, indem Sie 10x invertieren.</li>
		<li>Zentrifuge bei 1.500 x g für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Die Röhrchen vorsichtig herausnehmen und mit 70% Ethanol besprühen. Entfernen Sie unter einer Biosicherheitshaube die Kappen, ohne die mononukleären Zellen (Buffy-Schicht) zu stören. PBMCs befinden sich in einer weißlichen Schicht direkt unter der Plasmaschicht (Abbildung 1A). Sammeln Sie die gesamte Buffy-Schicht mit einer 1000 μL Pipette und geben Sie sie in ein 15 mL konisches Rohr.</li>
		<li>Zählen Sie die Zellnummer mithilfe eines automatisierten Zellzählers. Drehen Sie die Röhre bei 300 x g für 25 min bei RT.</li>
		<li>Verwerfen Sie den Überstand. Waschen Sie mit 10 ml DPBS (Ca2+/ Mg2+ frei).</li>
		<li>Drehen Sie die Röhre bei 300 x g für 15 min bei RT.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand. Resuspend Zellpellets in 1 ml des Gefriermediums (KSR plus 10% DMSO). Passen Sie die Zelldichte an, um 1 x 106 Zellen pro Durchstechflasche zu erhalten.</li>
		<li>PBMC-Kryovolen in einen Zellgefrierbehälter geben und über Nacht bei -80 °C aufbewahren. Am nächsten Tag zur Langzeitlagerung in einen Flüssigstickstofftank geben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>iPSC-Neuprogrammierung.<ol>
<li>Fügen Sie 3 ml Supplement Blood Media in ein 15 ml konisches Röhrchen hinzu. PBMCs im 37 °C Wasserbad auftauen und in ein konisches Rohr geben. Drehen Sie bei 300 x g für 7 min bei RT.</li>
		<li>Verwerfen Sie den Überstand. Resuspend PBMCs mit vollständigen Blutmedien. Säen Sie sie in zwei Vertiefungen einer 24-Well-Gewebekulturplatte (keine Basalmembranmatrix).</li>
		<li>5%CO2 bei 37 °C über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag entfernen Sie vorsichtig die Hälfte der alten Medien (0,5 ml) und fügen Sie 0,5 ml frische Complete Blood Media hinzu.</li>
		<li>Wechseln Sie die Medien jeden zweiten Tag, indem Sie die Hälfte der alten Medien aktualisieren.</li>
		<li>Nach einer Woche waschen Sie den Brunnen aggressiv mit 1 ml Supplement Blood Media und übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Zählen Sie die Zellennummer. Nehmen Sie 2 x 105 Zellen und zentrifugieren Sie bei 300 x g für 7 min.</li>
		<li>Verwerfen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie Zellen mit 300 μL vollständigen Blutmedien. Führen Sie eine Transfektion durch, indem Sie ein geeignetes Volumen an Sendai-Virus-Reprogrammierungsvektoren gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzufügen. Übertragen Sie sie in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte (keine Basalmembranmatrix). 5%CO2 bei 37 °C über Nacht inkubieren.</li>
		<li>Am nächsten Tag bei 300 x g für 7 min drehen. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie in 2 ml Complete Blood Media. In eine Vertiefung einer mit Kellermembranmatrix vorbeschichteten 6-Well-Platte überführen. Dies ist Tag 1 (D1).</li>
		<li>Berühren Sie den Teller nicht am nächsten Tag.</li>
		<li>Entfernen Sie auf D3 1 ml des alten Mediums. Fügen Sie 1 ml Supplement Blood Media hinzu.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.2.10 auf D5.</li>
		<li>Entfernen Sie auf D7 1 ml des alten Mediums. Fügen Sie 1 ml komplette E8-Medien hinzu.</li>
		<li>Wiederholen Sie auf D8 Schritt 2.2.12.</li>
		<li>Entfernen Sie auf D9 die alten Medien. Fügen Sie 2 ml komplette E8-Medien hinzu. Von vollständig reprogrammierten Zellen wird erwartet, dass sie sich anheften und beginnen, Kolonien zu bilden.</li>
		<li>Aktualisieren Sie täglich mit 2 ml kompletten E8-Medien.</li>
		<li>Etwa 2 Wochen nach der Übertragung des Sendai-Virus erscheinen große iPSC-Kolonien und sind bereit für die Ernte.</li>
		<li>Schneiden Sie iPSC-Kolonien unter ein Stereomikroskop in der Haube und übertragen Sie die einzelnen Kolonien auf eine mit einer Basalmembranmatrix beschichtete 24-Well-Platte, die mit 0,5 ml iPSC-Passaging-Medien vorgeladen ist.</li>
		<li>Täglich mit 0,5 ml komplettem E8-Medium erfrischen, bis die iPSC-Kolonien groß genug werden, um in eine neue, mit Basalmembran-Matrix beschichtete 6-Well-Platte überzugehen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Wartung und Weitergabe menschlicher iPSC
<ol><li>Wenn menschliche iPS-Zellen eine Konfluenz von über 90% erreichen, entfernen Sie alte Medien. Einmal mit 3 ml DPBS abspülen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml 0,5 mM EDTA in DPBS-Lösung hinzu. 5%CO2 bei 37 °C für 5-8 min inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie EDTA durch Aspiration. Fügen Sie 1 ml iPSC-Passaging-Medien hinzu. Entfernen Sie iPSCs manuell.</li>
	<li>Nehmen Sie 600-900 μL Einzelzellsuspension und schichten Sie sie auf eine matrixbeschichtete 6-Well-Platte der Kellermembran auf (Verdünnung: 1:6 bis 1:10). 5%CO2 bei 37 °C über Nacht inkubieren.</li>
	<li>Aktualisieren Sie täglich mit 2 ml kompletten E8-Medien. Die iPSC-Kulturen erreichen in der Regel nach 3-4 Tagen eine Konfluenz.</li>
</ol>4. Chemisch definierte Kardiomyozytendifferenzierung
<ol><li>Kultivieren Sie menschliche iPS-Zellen in vollständigen E8-Medien bis zu 95% konfluent (3-4 Tage).</li>
	<li>Entfernen Sie die alten Medien. Fügen Sie 2 ml CM-Differenzierungsmedium II (6 μM CHIR in RPMI1640 plus B27 minus Insulinergänzung) zu jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte hinzu. Dies ist D0. Berühren Sie D1 nicht.</li>
	<li>Auf D2 durch 2 ml CM-Differenzierungsmedium I (RPMI1640 plus B27 minus Insulinergänzung) ersetzen.</li>
	<li>Auf D3 durch 2 ml CM Differenzierung Media III (5 μM IWR-1 in RPMI1640 plus B27 minus Insulinergänzung) ersetzen. Berühren Sie D4 nicht.</li>
	<li>Ersetzen Sie auf D5 durch 2 ml CM-Differenzierungsmedium I.</li>
	<li>Ersetzen Sie auf D7 durch 2 ml CM-Differenzierungsmedium IV (RPMI1640 plus B27-Ergänzung). Danach aktualisieren Sie die Medien jeden zweiten Tag.</li>
	<li>Auf D11, wenn kontrahierende Zellen beobachtet werden, ersetzen Sie durch 2 ml CM-Differenzierung Media V (keine Glukose).</li>
	<li>Ersetzen Sie auf D13 durch 2 ml CM-Differenzierungsmedium V.</li>
	<li>Ersetzen Sie bei D15 durch 2 ml CM-Differenzierungsmedium IV.</li>
	<li>Ersetzen Sie bei D17-D21 jeden zweiten Tag durch 2 ml CM-Differenzierungsmedium IV.</li>
</ol>5. Passage menschliche iPSC-CMs
<ol><li>Entfernen Sie alte Medien und spülen Sie die Zellen einmal mit 3 ml DPBS aus.</li>
	<li>Tragen Sie 1 ml CM-Dissoziationslösung (siehe Materialtabelle)auf jede Vertiefung einer 6-Well-Platte auf. 5%CO2 bei 37 °C für 5-8 min inkubieren.</li>
	<li>Mechanisch dissoziieren Sie iPSC-CMs durch kräftiges Pipettieren in einzelne Zellen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 15-ml-Rohr. Fügen Sie 2 ml CM-Passaging-Medien (10% KSR in RMPI1640 plus B27-Ergänzung) hinzu, um die CM-Dissoziationslösung zu neutralisieren.</li>
	<li>Drehen Sie bei 300 x g für 5 min bei RT.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie Zellen mit einem gewünschten Volumen an CM-Passageing-Medien. Säen Sie sie in eine mit Basalmembranmatrix beschichtete Platte / Schüssel. Menschliche iPSC-CMs schlagen 1-3 Tage nach dem Passieren wieder.</li>
</ol>6. Ausbau menschlicher iPSC-CMs
<ol><li>Spülen Sie D10-12 schlagende iPSC-CMs mit 3 ml DPBS für jede Vertiefung einer 6-Well-Platte einmal ab. Fügen Sie 1 ml CM-Dissoziationslösung hinzu (Schritt 5.2). Inkubieren sie in 5%CO2 bei 37 °C für 7-10 min.</li>
	<li>Mechanisch dissoziieren Sie iPSC-CMs durch kräftiges Pipettieren in einzelne Zellen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 15-ml-Rohr. Fügen Sie 2 ml CM-Überlaufmedien hinzu, um die CM-Dissoziationslösung zu neutralisieren.</li>
	<li>Drehen Sie bei 300 x g für 5 min bei RT.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie Zellen mit einem geeigneten Volumen an CM-Passaging-Medien. Pipetten Sie auf und ab, um eine Einzelzellensuspension herzustellen. Säen Sie eine Million iPSC-CMs in eine mit Basalmembranmatrix beschichtete 10-cm-Schüssel.</li>
	<li>Am nächsten Tag alte Medien entfernen. Fügen Sie 10 ml Kardiomyozyten-Proliferationsmedien hinzu (Media VI: 2 μM CHIR99021). Wechseln Sie die Medien jeden zweiten Tag.</li>
	<li>Wenn iPSC-CMs nach 7-9 Tagen Kultur zusammenfließen, wiederholen Sie den Passaging-Schritt für den weiteren Ausbau von iPSC-CMs.</li>
</ol>7. Immunfluoreszenz
<ol><li>Vor der Immunfluoreszenzfärbung werden iPSC-CMs auf mit Basalmembranmatrix beschichtete Deckgläser gesät, die in eine 24-Well-Platte (Aussaatdichte: 0,5-1 x 106 Zellen/ml) eingebracht werden. Pflegen Sie iPSC-CMs mindestens 4 Tage lang in Kultur.</li>
	<li>Zellen einmal mit 1 ml DPBS waschen.</li>
	<li>0,5 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) zugeben und 15 min bei RT inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen mit 1 ml DPBS. Wiederholen Sie den Vorgang einmal.</li>
	<li>0,5 ml 0,1% Triton X-100 zugeben und 20 min bei RT inkubieren.</li>
	<li>Zweimal mit 1 ml DPBS waschen.</li>
	<li>Fügen Sie 0,5 ml 0,2% BSA in DPBS (Blockierlösung) hinzu. Inkubieren Sie bei RT für 1 h.</li>
	<li>Fügen Sie 200 μL primären Antikörper hinzu, der mit Blockierlösung verdünnt ist (Verdünnung: 1:400-1:1000). Über Nacht bei 4 °C inkubieren.</li>
	<li>Zellen mit 0,5 ml Blocklösung für 3 min mit Schütteln waschen. Wiederholen Sie dies zweimal.</li>
	<li>Fügen Sie 200 μL sekundären Antikörper hinzu, der in der Blockierungslösung verdünnt ist. Inkubieren Sie bei RT für 1 h.</li>
	<li>Spülen Sie die Zellen dreimal mit 0,5 ml DPBS, jeweils für 3 min unter Schütteln.</li>
	<li>Enthaltekerne mit DAPI (1:2000 Verdünnung) und inkubieren sie für 5 min bei RT.</li>
	<li>Spülen Sie die Zellen dreimal mit 0,5 ml DPBS.</li>
	<li>Montieren Sie Zellen auf den Deckgläsern auf einem Objektträger mit 5 μl Montagemedien. Bei 4 °C lagern und vor Licht schützen.</li>
</ol>8. Durchflusszytometrie Probenvorbereitung
<ol><li>Menschliche iPSC-CMs einmal mit 3 ml DPBS waschen.</li>
	<li>1 mL CM-Dissoziationslösung zugeben und 5%CO2 bei 37 °C für 7-10 min inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie Zellen mit einer 1.000-μL-Pipette. Die Zellsuspension wird durch eine Siebkappe in ein rundes FACS-Rohr übertragen. Das FACS-Röhrchen ist mit 1 ml iPSC-CM-Passagiermedium (10% KSR) vorgefüllt, um die Enzymaktivität zu neutralisieren.</li>
	<li>Bei 300 x g für 5 min drehen.</li>
	<li>Überstand entfernen, ohne das Zellpellet zu stören. Fügen Sie 250 μL Fixations-/Permeabilisierungslösung hinzu (siehe Tabelle der Materialien). 20 min bei 4 °C inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml Dauerwelle / Waschpuffer hinzu. Kurz wirbeln und 4 min mit 300 x g drehen.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand. 100 μL verdünnte Primärantikörper (1:200-1:500) in 1x Perm/Wash-Puffer geben. Kurz wirbeln und über Nacht bei 4 °C inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml Dauerwelle / Waschpuffer. Kurz wirbeln und 4 min mit 300 x g drehen.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand. Fügen Sie 100 μL verdünnte sekundäre Antikörper (1:500-1:1.000) hinzu. Kurz wirbeln und bei RT 1 h inkubieren. Vor Licht schützen, wenn sekundäre Antikörper mit lichtempfindlicher Fluoreszenz konjugiert werden.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml Dauerwelle / Waschpuffer. Kurz wirbeln und 4 min bei 300g drehen.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie Zellen mit 400 μL FACS-Färbepuffer (PBS/4% FBS). Bei 4 °C lagern bis zum Laden auf ein FACS-Gerät.</li>
</ol>9. Echtzeit-qPCR
<ol><li>Entfernen Sie alte Medien in der menschlichen iPSC-CM-Kultur. Fügen Sie 500-700 μL Lysepuffer hinzu, um Zellen zu lysatieren. Scape-Zelllysat 3 min inkubieren und in ein 1,5-ml-RNase-freies Röhrchen geben. Fahren Sie sofort mit der Gesamt-RNA-Extraktion fort oder lagern Sie sie bei -80 °C.</li>
	<li>Isolieren Sie die Gesamt-RNA mit einem RNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Messen Sie die RNA-Konzentration und beurteilen Sie die Qualität der Gesamt-RNA mit einem Spektralphotometer.</li>
	<li>Führen Sie eine umgekehrte Transkriptionsreaktion mit einem cDNA-Synthesekit durch. Das Gesamtvolumen der RT-Reaktion beträgt 20 μL einschließlich 4 μL Reaktionsmischung (5x), 1 μL Reverse Transkriptase, 1 μg Gesamt-RNA und RNase-freiem Wasser.</li>
	<li>Inkubieren Sie das komplette RT-Reaktionsgemisch in einem Thermocycler nach folgendem Protokoll: 25 °C für 5 min; 46 °C für 20 min; 95 °C für 1 min; bei 4 °C halten.</li>
	<li>cDNA mit nukleasefreiem Wasser um 1:10 verdünnen. Richten Sie eine Echtzeit-qPCR-Reaktion ein, indem Sie 1 μL cDNA-Template, 1 μL Primer/Sonde, 10 μL qPCR-Master-Mix und 8 μL nukleasefreies Wasser mischen.</li>
	<li>Ausführung in einem Real-Time-PCR-System. Das Zyklusprotokoll beträgt 50 °C 2 min (Hold), 95 °C 10 min (Hold), 95 °C 15 Sec, 60 °C 1 min, Wiederholung für 40 Zyklen.</li>
	<li>Sammeln Sie CT-Werte für jedes Gen in jeder Probe. Die relative mRNA-Häufigkeit wird berechnet, indem derC-T-Wert des Zielgens vomC-T-Wert eines Housekeeping-Gens subtrahiert wird. Die relative Genexpression wird mit der2-ΔΔCT-Methode analysiert.</li>
</ol>10. Aufzeichnung der Patch-Clamp-Klemme für die ganze Zelle
<ol><li>Dissoziieren Sie iPSC-CMs in einzelne Zellen unter Verwendung der CM-Dissoziationslösung, wie zuvor beschrieben.</li>
	<li>Samenzellen mit geringer Dichte auf mit Basalmembranen beschichteten Deckgläsern. Kulturieren Sie sie für 3-4 Tage in Media IV.</li>
	<li>Ziehen Sie Pipetten (Widerstand 0,9-1,5 MΩ) aus Borosilikatglaskapillaren mit einem horizontalen Mikroelektrodenzieher.</li>
	<li>Inkubieren sie Zellen in Tyrodes Lösung (pH=7,35).</li>
	<li>Füllen Sie Pipetten mit Elektrodenlösung (pH=7,3), die aus folgenden Chemikalien besteht: 120 mM Asparaginsäure, 20 mM KCl, 2 mMMgCl2,5 mM HEPES, 10 mM NaCl, 5 mM EGTA, 0,3 mM Na-GTP, 14 mM Phosphokreatin, 4 mM K-ATP und 2mM Kreatinphosphokinase.</li>
	<li>Platzieren Sie die Zellen im Stromzangemodus mit einem diastolischen Schwellenwert von 1,5-2 und einem Stromimpuls von 5 ms bei 1 Hz.</li>
	<li>Erfassen Sie Aktionspotentiale (APs) mit einem Mikroelektrodenverstärker und einer softwaregesteuerten Erfassungskarte.</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
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<li>Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+notch+signaling+promotes+cardiomyocyte+proliferation+in+the+regenerating+zebrafish+heart+through+Wnt+pathway+antagonism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism.</a> Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).</li>
<li>Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+cardiac+growth+and+size%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Determinants of cardiac growth and size.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150(2020).</li>
<li>Campa, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+activates+cell+cycle+reentry+and+progression+in+quiescent+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes.</a> Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).</li>
<li>Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1+signaling+stimulates+proliferation+of+immature+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes.</a> Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).</li>
<li>Heallen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway+inhibits+Wnt+signaling+to+restrain+cardiomyocyte+proliferation+and+heart+size%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size.</a> Science. 332 (6028), 458-461 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Während der iPSC-Reprogrammierung ist es entscheidend, PBMCs für 1 Woche zu kultivieren, bis sie mit klaren Kernen und Zytoplasma vergrößert werden. Da sich PBMCs nicht vermehren, ist eine geeignete Zellzahl für die virale Transduktion wichtig für eine erfolgreiche iPSC-Reprogrammierung. Die Zellzahl der PBMCs, die Vielzahl der Infektionen (MOI) und der Titer des Virus sollten berücksichtigt und angepasst werden, um die optimalen Transduktionsergebnisse zu erreichen. Für die kardiale Differenzierung ist die anfängliche S...

Die Entdeckung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen hat die moderne kardiovaskuläre Medizin revolutioniert1,2. Menschliche iPS-Zellen sind in der Lage, sich selbst zu erneuern und alle Zelltypen im Herzen zu erzeugen, einschließlich Kardiomyozyten, Endothelzellen, glatte Muskelzellen und kardiale Fibroblasten. Patienten-iPSC-abgeleitete Kardiomyozyten (iPSC-CMs) können als unbestimmte Ressourcen für die Modellierung genetisch vererbbarer Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVDs) und die Prüfung der kardialen Sicherheit für neue Medikamente dienen3. Insbesondere sind die iPSC-CMs der Patienten gut aufgestellt, um genetische und molekulare Ätiologien von CVDs zu untersuchen, die von Defekten in Kardiomyozyten wie dem long QT-Syndrom4 und der dilatativen Kardiomyopathie (DCM)5abgeleitet sind. In Kombination mit DER CRISPR/Cas9-vermittelten Genom-Editierung haben patienteneigene iPSC-CMs einen beispiellosen Weg eröffnet, um die komplexe genetische Basis von CVDs einschließlich angeborener Herzfehler (KHK) zu verstehen6,7,8. Menschliche iPSC-CMs haben auch das Potenzial gezeigt, als autologe Zellquellen für die Auffüllung des beschädigten Myokards während eines Herzinfarkts zu dienen9. In den letzten Jahren ist es von größter Bedeutung, qualitativ hochwertige humane iPSC-CMs mit definierten Subtypen (Atrial, Ventrikel und Knoten) für die Herzregeneration und Drogentests zu generieren10.
Die kardiale Differenzierung von humanen iPS-Zellen wurde in den letzten zehn Jahren stark vorangetrieben. Differenzierungsmethoden sind von der embryoiden Körper (EB)-basierten spontanen Differenzierung zur chemisch definierten und gerichteten Herzdifferenzierung übergegangen11. Wichtige Signalmoleküle, die für die embryonale Herzentwicklung unerlässlich sind, wie Wnt, BMP, Nodal und FGF, werden manipuliert, um die Differenzierung von Kardiomyozyten aus menschlichen iPS-Zellen zu verbessern10,12. Zu den signifikanten Fortschritten gehören die sequentielle Modulation der Wnt-Signalgebung (Aktivierung gefolgt von Inhibition) für eine robuste Erzeugung von Kardiomyozyten aus menschlichen iPS-Zellen13,14. Chemisch definierte kardiale Differenzierungsrezepte wurden untersucht, um die großtechnische Produktion von schlagenden Kardiomyozyten15,16zuerleichtern,die das Potenzial haben, auf industrielle und klinische Ebene aufgerüstet zu werden. Darüber hinaus wird eine robuste Expansion von frühen humanen iPSC-CMs durch die Exposition gegenüber konstitutiver Wnt-Aktivierung unter Verwendung einer kleinen Chemikalie (CHIR99021)17erreicht. In jüngster Zeit werden subtypspezifische Kardiomyozyten durch Manipulation von Retinsäure (RA) und Wnt-Signalwegen an spezifischen Differenzierungsfenstern während der Kardiomyozyten-Linienverpflichtung von menschlichen iPS-Zellenerzeugt 18,19,20,21,22.
In diesem Protokoll beschreiben wir ein Arbeitsverfahren für die robuste Erzeugung und Proliferation menschlicher CMs, die aus mononukleären Zellen des patienten peripheren Blutes stammen. Wir präsentieren Protokolle für 1) die Reprogrammierung menschlicher PBMCs in iPS-Zellen, 2) die robuste Erzeugung von schlagenden Kardiomyozyten aus menschlichen iPS-Zellen, 3) die schnelle Expansion früher iPSC-CMs, 4) die molekulare Charakterisierung menschlicher iPSC-CMs und 5) die elektrophysiologische Messung menschlicher iPSC-CMs auf Einzelzellebene per Patch clamp. Dieses Protokoll deckt die detaillierten experimentellen Verfahren zur Umwandlung von Patientenblutzellen in schlagende Kardiomyozyten ab.

<table><tbody><tr><td>ABI 7300 Schnelles Echtzeit-PCR-System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axon Axopatch 200B Mikroelektrodenverstärker</td><td>Molekulare Geräte</td><td></td><td>Mikroelektrodenverstärker</td></tr><tr><td>B27 Ergänzung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>B27 Ergänzung minus Insulin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Fixations-/Permeabilisierungskit</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>Fixierungs-/Permeabilisierungslösung, Perm/Waschpuffer</td></tr><tr><td>BD Vacutainer CPT-Röhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td>362753</td><td>Blutzelltrennröhrchen</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleck</td><td>Chemicals S2924</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogrammierungskit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16517</td><td>Sendai Virus-Reprogrammierungskit</td></tr><tr><td>Digidata 1200B</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Acquisition Board</td></tr><tr><td>Direct-Zol RNA Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>R2050</td><td>RNA-Extraktionskit</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>E8 Medium für iPSC-Kultur</td></tr><tr><td>GlutaMAX Ergänzung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>L-Glutamin-Alternative</td></tr><tr><td>Wachstumsfaktor reduziert Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Basalmembran-Matrix</td></tr><tr><td>iScript cDNA Snythesis Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>cDNA-Synthese</td></tr><tr><td>IWR-1-endo</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S7086</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement (KSR)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 7.0</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Software zur Erfassung und Analyse von Daten für die Elektrophysiologie</td></tr><tr><td>Rekombinanter Mensch EPO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHC9631</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinanter Mensch FLT3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHC9414</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinanter Mensch IL3</td><td>Peprotech</td><td>200-03</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinanter Mensch IL6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>PHC0065</tr><tr><td>Rekombinant human SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium, ohne Glukose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11879020</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Gold Antifade Eindeckmittel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S36936</td><td>Eindeckmittel</td></tr><tr><td>StemPro-34 SFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10639011</td><td>PBMC-Nährmedien</td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master</td><td>Mix Thermo Fisher Scientific</td><td>4444964</td><td>qPCR Master Mix</td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme 10x, ohne Phenolrot</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific A1217703</td><td>CM Dissoziationslösung</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>iPSC Dissoziationslösung</td></tr><tr><td>Y-27632 2HCl</td><td>Selleck Chemie</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

erzeugung und expansion menschlicher kardiomyozyten aus mononukleären zellen des patientenperipheren blutes

Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells

Die Generierung patientenspezifischer Kardiomyozyten aus einer einzigen Blutentnahme hat ein enormes Interesse an der Präzisionsmedizin bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen geweckt. Die kardiale Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) wird durch definierte Signalwege moduliert, die für die embryonale Herzentwicklung essentiell sind. Zahlreiche kardiale Differenzierungsmethoden auf 2-D- und 3D-Plattformen wurden mit unterschiedlichen Wirkungsgraden und Kardiomyozytenausbeute entwickelt. Dies hat Ermittler außerhalb des Feldes verwirrt, da die Vielfalt dieser Methoden schwer zu verfolgen sein kann. Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll vor, das eine robuste Erzeugung und Erweiterung von patientenspezifischen Kardiomyozyten aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) ausarbeitet. Wir beschreiben zunächst ein hocheffizientes iPSC-Reprogrammierungsprotokoll aus der Blutprobe eines Patienten unter Verwendung von Sendai-Virusvektoren ohne Integration. Wir beschreiben dann eine kleinmolekülvermittelte Monolayer-Differenzierungsmethode, die aus den meisten menschlichen iPSC-Linien robust schlagende Kardiomyozyten herstellen kann. Darüber hinaus wird ein skalierbares Kardiomyozyten-Expansionsprotokoll unter Verwendung eines kleinen Moleküls (CHIR99021) eingeführt, das von Patienten abgeleitete Kardiomyozyten für industrielle und klinische Anwendungen schnell erweitern könnte. Am Ende werden detaillierte Protokolle zur molekularen Identifizierung und elektrophysiologischen Charakterisierung dieser iPSC-CMs dargestellt. Wir erwarten, dass dieses Protokoll für Anfänger mit begrenztem Wissen über kardiovaskuläre Entwicklung und Stammzellbiologie pragmatisch ist.

Menschliche iPSC-Reprogrammierung von PBMCs Nach der Vorkultur mit vollständigen Blutmedien für 7 Tage werden PBMCs groß mit sichtbaren Kernen und Zytoplasma (Abbildung 1B), was darauf hinweist, dass sie für die Virustransfektion bereit sind. Nach der Transfektion mit den Sendai-Virus-Reprogrammierungsfaktoren werden PBMCs für eine weitere Woche einem epigenetischen Reprogrammierungsprozess unterzogen. Typischerweise erhalten wir 30-50 iPS...

Hier stellen wir ein Protokoll zur robusten Erzeugung und Erweiterung menschlicher Kardiomyozyten aus mononukleären Zellen des patienteneigenen peripheren Blutes vor.

Erzeugung und Expansion menschlicher Kardiomyozyten aus mononukleären Zellen des patientenperipheren Blutes

Generating patient-specific cardiomyocytes from a single blood draw has attracted tremendous interest in precision medicine on cardiovascular disease. ...

Dies sind umfassende Protokolleinrichtungen, rohe Steigerungen der Erzeugung und die Verwendung von patientenspezifischen Kulturen aus peripheren mononukleären Blutzellen. Diese Taktik ist reproduzierbar und leicht zu befolgen, besonders für Anfänger. Und benötigen Sie keine spezielle Fachkompetenz in Stammzellballaden oder Herz-Kreislauf-Medizin.Unser Protokoll kann verwendet werden, um patientenspezifische Kardiomyozyten aus einer einzigen Blutentnahme zu generieren, die zur Modellierung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und zum Testen der Herztoxizität neuartiger Medikamente verwendet werden können. Dieses Protokoll erfordert ein langes Engagement für die Aufrechterhaltung der Stammzellreprogrammierung und die gerichtete Differenzierung. Sie schätzen Ihre Bemühungen jedoch sehr.Wenn Sie sehen, wie Kardiomyozyten in der Schale geschlagen werden. Wenn die menschlichen iPSC-Kolonien eine Konfluenz von über 90% erreichen, spülen Sie jede Vertiefung mit drei Millilitern DPBS aus, bevor Sie die Zellen mit einem Milliliter 0,5 Millimol EDTA in DPBS pro Vertiefung bei 37 Grad Celsius behandeln. Nach fünf bis acht Minuten fügen Sie jedem Bohrloch einen Milliliter iPSC-Passaging-Medium hinzu und entfernen die Zellen manuell.Übertragen Sie 600 bis 900 Mikroliter der Zellen auf einzelne Brunnen haben eine Basalmembran beschichtete sechs Well-Platten für eine nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Anschließend erfrischen Sie die Kulturen mit zwei Millilitern komplettem E8-Medium täglich für drei bis vier Tage. Wenn die Kultur die Konfluenz erreicht hat, ersetzen Sie das Medium durch zwei Milliliter Kardiomyozyten-Differenzierungsmedium, zwei pro Vertiefung.Ersetzen Sie am zweiten Tag die Überstände durch zwei Milliliter Kardiomyozyten-Differenzierungsmedium eins. Ersetzen Sie am dritten Tag die Überstände durch zwei Milliliter Kardiomyozyten-Differenzierungsmedium drei. Am fünften Tag.Ersetzen Sie den Überstand durch zwei Milliliter Kardiomyozyten-Differenzierungsmedium eins. Ersetzen Sie am siebten bis 10. Tag den Überstand durch zwei Milliliter Kardiomyozyten-Differenzierungsmedium vier. An den Tagen 11 und 13.Wenn kontrahierende Zellen beobachtet werden, ersetzen Sie den Überstand durch zwei Milliliter Kardiomyozyten-Differenzierungsmedium fünf. An den Tagen 15, 17, 19 und 21. Ersetzen Sie den Überstand durch zwei Milliliter Kardiomyozyten-Differenzierungsmedium vier.Nach der Präkultur mit vollständigem Blutmedium pro sieben Tage werden PBMCs groß mit sichtbaren Kernen und Zytoplasma, was darauf hindeutet, dass sie für die Transfektion mit Sendai-Virus-Reprogrammierungsfaktoren bereit sind. Bei der Einführung in das komplette E8-Medium. Die vollständig umprogrammierten Zellen werden sich anheften und beginnen, Kolonien zu bilden.Nach vier bis fünf Passagen bilden sich aus den reprogrammierten Zellen hochreine iPSC-Kolonien, wobei nur sehr wenige differenzierte Zellen beobachtet werden. In diesem Stadium sind die meisten Zellen OCT4- und NANOG-positiv, was auf ihre Pluripotenie hinweist. Schlagende Kardiomyozyten werden normalerweise nach 12 Tagen der Differenzierung beobachtet.Nach Glukosemangel und Neuplattierung zeigen iPSC-Kardiomyozyten spontane Schläge und eine ausgerichtete Sarkomerstruktur mit interkalierter kardialer Troponin-T- und Alpha-Actinin-Expression. Die Kolonien behalten ihre Reinheit, wie ihr Troponin T-Ausdruck beweist. Obwohl iPSC-Kardiomyozyten im Vergleich zu erwachsenen Kardiomyozyten relativ unreif sind.Sie demonstrieren ventrikuläre und atriale Aktionspotentiale, gemessen durch Großhandelspflaster, Klemme. Ventrikuläre Kardiomyozyten exprimieren Myosin-Leichtkette zwei, während atrielle iPSC-Kardiomyozyten durch NR2F2-Expression gekennzeichnet sind. Die Wnt-Aktivierung stimuliert die Zellteilung und fördert die Expression von Zellzyklusregulatoren.Interessanterweise induziert die Wnt-Aktivierung auch die robuste Proliferation von frühen iPSC-Kardiomyozyten für zwei Passagen im Vergleich zu Kontrollen, obwohl diese proliferative Fähigkeit im Laufe der Zeit abnimmt. Stellen Sie sicher, dass die PBMS mit dem klaren Kern- und Zytoplasma vergrößert werden, bevor die iPSC-Reprogrammierungsvektoren eingeführt werden, da der Zustand der PBMs für die iPSC-Reprogrammierung entscheidend ist. Patientenspezifische Kardiomyozyten sind wertvoll für die Modellierung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen in vitro und für die Bereitstellung einer Tonne Spenderzellen für die kardiale Stammzelltherapie.

generation-expansion-human-cardiomyocytes-from-patient-peripheral

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Kardioblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen kardialen Vorläuferzellen und funktionelle Kardiomyozyten für Herz-Kreislauf-Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Die Erzeugung von ausgerichteten Myokardgewebe ist eine wesentliche Voraussetzung für die Anpassung der jüngsten Fortschritte in der Stammzellbiologie, um klinisch nützliche Zwecke. Hier beschreiben wir einen Mikrokontaktdruck Ansatz für die präzise Steuerung der Zelle Form und Funktion. Mit hoch gereinigte Populationen von embryonalen Stammzellen abgeleitete kardiale Vorläuferzellen, wir erzeugen dann anisotropen funktionale Herzmuskelgewebe.

Generation Ausgerichtet Functional Myokardgewebe Durch Mikrokontaktdrucken

Pluripotenten Stammzellen, entweder embryonale oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen), eine wertvolle Quelle der menschlichen differenzierten Zellen, einschließlich Herzmuskelzellen. Hier werden wir auf die kardiale Induktion der iPS-Zellen zu konzentrieren, die zeigen, wie man sie benutzt, um funktionelle menschliche Herzmuskelzellen durch eine Embryoidkörpern-basiertes Protokoll zu erhalten.

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Dieses Manuskript beschreibt die Erstellung von definiertem manipuliertem Herzgewebe unter Verwendung von Oberflächenmarker-Expression und Zellsortierung. Die definierten Gewebe können dann in einem Multigewebe-Bioreaktor verwendet werden, um Mechanismen der kardialen Zelltherapie zu untersuchen, um ein funktionsfähiges, aber dennoch kontrolliertes Modellsystem des menschlichen Herzens bereitzustellen.

Bau von Defined Menschen Engineered Herzgewebe zur Untersuchung Mechanismen der Herzzelltherapie

Menschliche Herzgewebe birgt multi perivaskuläre Vorläuferzellpopulationen, die für myokardiale Regeneration geeignet sein können. Die hier beschriebene Technik ermöglicht die gleichzeitige Isolierung und Reinigung von zwei multi stromalen Zellpopulationen , die mit nativem Blutgefäße, dh CD146 + CD34 - Perizyten und CD34 + CD146 - Adventitia - Zellen aus dem menschlichen Herzmuskel.

Isolierung von Perivaskuläre multipotenten Vorläuferzellpopulationen aus menschlichem Herzgewebe

Wir präsentieren drei neue und effizientere Protokolle für den menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen in Kardiomyozyten, Endothelzellen differenzieren und glatten Muskelzellen und eine Fördermethode, die das Einwachsen von transplantierten Zellen verbessert durch Zellinjektion mit Patch-vermittelten Cytokin-Lieferung zu kombinieren.

Pluripotente Stammzellen Herzzellen für Myocardial Repair Abgeleitet

Hier präsentieren wir eine Methode, um effizient die kardialen Differenzierung junge Quellen humaner mesenchymaler Stammzellen um funktionelle, Auftraggeber, Cardiomyocyte-wie Zellen erzeugen Potenzial in-vitro-.

In-vitro- Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in funktionellen Cardiomyocyte-ähnlichen Zellen

Hier beschreiben wir eine skalierbare Methode mit einer einfachen Kombination von Activin A und Lentivirus-vermittelten Id1-Überexpression, erste Herz Bereich-wie kardiale Stammväter und ventrikuläre wie Herzzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen zu generieren.

Generation der ersten Herz Bereich-wie kardiale Stammväter und ventrikuläre wie Herzzellen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen

Hier bieten wir eine ausführliche Beschreibung des Versuchsaufbaus für eine Analyse der Bewertung der DNA-Integrität in Stammzellen vor Stammzelltransplantation.

Beurteilung Stem Cell DNA-Integrität für kardiale Zelltherapie

Hier beschreiben wir eine einfach zu bedienende Methodik zur Erzeugung von 3D-selbstorganisierten kardialen Mikrogewebe-Arrays, die aus vordifferenzierten humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten, Herzfibroblasten und Endothelzellen bestehen. Diese benutzerfreundliche und zellarme Technik zur Erzeugung kardialer Mikrogewebe kann für die Krankheitsmodellierung und frühe Stadien der Arzneimittelentwicklung implementiert werden.

Herstellung von 3D-Cardiac Microtissue Arrays unter Verwendung von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten, kardialen Fibroblasten und Endothelzellen

Hier wird eine Reihe von Protokollen für die Erzeugung und Kryokonservierung von kardialen Sphäroiden (CSs) aus humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten vorgestellt, die in einem multidimensionalen Hochdurchsatzformat kultiviert wurden. Dieses dreidimensionale Modell fungiert als robuste Plattform für die Modellierung von Krankheiten, Hochdurchsatz-Screenings und behält seine Funktionalität nach der Kryokonservierung bei.

Generierung, Hochdurchsatz-Screening und Biobanking von human-induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Herzsphäroiden

Erfahren Sie die Reprogrammierung peripherer Blutmononuklearzellen zu patientenspezifischen Kardiomyozyten mittels Stammzelltechniken. Dieses reproduzierbare Protokoll ermöglicht Krankheitsmodellierung und Arzneimitteltests für Herz-Kreislauf-Forschung.

Erzeugung und Expansion menschlicher Kardiomyozyten aus mononukleären Zellen des patientenperipheren Blutes

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