Detectie van glycosaminoglycanen door polyacrylamide gel-elektroforese en zilverkleuring

Dit protocol beschrijft een eenvoudige techniek die kan worden gebruikt om de aanwezigheid te detecteren en de lengte van glycosaminoglycanen te meten, moleculen van steeds meer erkende betekenis voor veel biologische processen. Deze techniek is gemakkelijk aan te passen aan de meeste life science laboratoria. Vergelijkbare glycomische technieken vereisen vaak apparatuur en expertise die alleen te vinden zijn in glycochemische onderzoekslaboratoria.

Deze techniek kan vooral nuttig zijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van de glycocalyx, een polysaccharidelaag die de endotheel- en epitheliale oppervlakken van het menselijk lichaam bekleedt. Begin met het plaatsen van een lege cassette in de PAGE-tank. Giet een oplossende gel door 10 milliliter oplossende geloplossing te mengen met 60 microliter vers bereid met 10% ammoniumperssulfaat in een buis van 15 milliliter.

Voeg vervolgens 10 microliter TEMED toe. Keer de buis twee tot drie keer voorzichtig om. Voeg snel 10 milliliter van de geactiveerde polyacrylamide-geloplossing toe aan de cassette met behulp van een pipet.

Overlay met twee milliliter gedeioniseerd gefilterd water en laat de oplossende gel gedurende 30 minuten polymeriseren. Nadat de oplossende gel volledig is gepolymeriseerd, gooit u het bedekte water weg. Giet de stapelgel door drie milliliter stapelgeloplossing te mengen met 90 microliter vers bereid 10% ammoniumpersulfaat in een buis van 15 milliliter.

Voeg vervolgens drie microliter TEMED toe en keer de buis twee tot drie keer voorzichtig om. Gebruik een pipet om snel de stapelgeloplossing over de gestolde oplossende gel toe te voegen totdat de cassette tot de rand gevuld is. Plaats de kam die bij de lege polyacrylamide-gelcassette is meegeleverd volledig en laat de stapelgel gedurende 30 minuten polymeriseren.

Zodra de gel is gepolymeriseerd, verwijdert u de tapestrip van de onderkant van de cassette en plaatst u de cassette terug in de PAGE-tankassemblage. Vul de bovenste en onderste kamers met de respectieve bufferoplossingen. Los gedroogde glycosaminoglycaanmonsters op in het minimaal noodzakelijke volume gedeïoniseerd gefilterd water en meng met monsterbelastingsbuffer in een één-op-één-verhouding.

Laad de monsters en de HS oligosaccharide ladders in de gel. Laat de gel vijf minuten voorlopen op 100 volt en laat hem vervolgens 20 tot 100 minuten op 200 volt lopen, afhankelijk van het acrylamidepercentage van de oplossende geloplossing. Zodra de run is voltooid, demonteer je de cassette en haal je de gel voorzichtig uit in een grote schone container gevuld met gedeïoniseerd gefilterd water.

Gooi vervolgens het water weg en kleur de gel gedurende vijf minuten in Alcian blue staining solution. Gooi de Alcian blauwe vlek weg en was snel twee tot drie keer met gedeioniseerd gefilterd water totdat het grootste deel van de Alcian blauwe kleuroplossing is verwijderd. Kleur de gel in zilvernitraatkleuringsoplossing in een verse schone container gedurende 30 minuten.

Was vervolgens twee tot drie keer gedurende 30 minuten elk in gedeioniseerd gefilterd water om de zilverkleuringsoplossing volledig te verwijderen. Gooi het water weg en voeg de ontwikkelingsoplossing toe. Observeer de gel zorgvuldig voor het verschijnen van banden.

Afhankelijk van de kwaliteit van de vlek en de massa van het geladen monster, kan de ontwikkeling enkele seconden tot enkele minuten duren. Zodra de gewenste banden zichtbaar zijn, gooit u de ontwikkelende oplossing onmiddellijk weg en wast u de gel kort met STOP-oplossing. De geïsoleerde en gezuiverde glycosaminoglycanen werden gevisualiseerd met behulp van Alcian blauwe en zilveren kleuringstechniek na dichtheidsafhankelijke resolutie door een polyacrylamidegelelektroforese.

Zoals te zien is in deze figuur, waren heparansulfaat oligosacchariden van verschillende polymeerlengtes gemakkelijk detecteerbaar met behulp van deze op PAGE gebaseerde benadering. De detectiegrens van deze methode, zo laag als 0,5 microgram, laat zien dat de techniek zeer gevoelig is bij het detecteren van glycosaminoglycanen geïsoleerd en gezuiverd uit biologische monsters. Van de vier verschillende heparinesulfaat oligosacchariden die met deze methode werden gevisualiseerd, was ongefractioneerde heparine het minst gemakkelijk detecteerbaar.

Vanwege de polydispersiteit van ongefractioneerde heparine is de dichtheid van elke individuele band uit dit monster lager dan de banden die worden geproduceerd door een gelijke massa gezuiverde heparine oligosacchariden. De efficiëntie van glycosaminoglycaanzuivering uit vloeibare biologische monsters werd beoordeeld met behulp van bronchoalveolaire lavagemonsters verzameld van muizen, die oorspronkelijk relatief lage concentraties glycosaminoglycanen bevatten. Bovendien werd het succes van deze techniek aangetoond met behulp van heparinesulfaat geïsoleerd uit hele longhomogenaat, wat een ruime hoeveelheid geïsoleerd heparinesulfaat opleverde, waarbij de kleinste fragmenten gelijk waren aan ongeveer 10 disacharide subeenheden in massa.

Het is erg belangrijk om vers bereide reagentia te gebruiken en elk reagens dat in dit protocol wordt gebruikt te filteren. Het is van cruciaal belang om reagentia van de hoogste zuiverheid en kwaliteit te gebruiken om deze techniek met succes uit te voeren.