Name: Mikrostrukturierung von Transmissionselektronenmikroskopie-Gittern zur direkten Zellpositionierung innerhalb von Ganzzell-Kryo-Elektronentomographie-Workflows (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Erfahren Sie die Mikrostrukturierung von TEM-Gittern zur direkten Zellpositionierung für Kryo-Elektronentomographie. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Bildgebung zellulärer Strukturen in nativem Zustand.

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Wir danken Dr. Jill Wildonger, Dr. Sihui Z. Yang und Frau Josephine W. Mitchell vom Department of Biochemistry, University of Wisconsin, Madison für die großzügige gemeinsame Nutzung der elav-Gal4, UAS-CD8::GFP Fly Strain (Bloomington Stock Center, #5146). Wir danken auch Dr. Aurélien Duboin, Herrn Laurent Siquier und Frau Marie-Charlotte Manus von Alvéole und Herrn Serge Kaddoura von Nanoscale Labs für ihre großzügige Unterstützung während dieses Projekts. Diese Arbeit wurde zum Teil von der University of Wisconsin, Madison, dem Department of Biochemistry an der University of Wisconsin, Madison, und den Zuschüssen des öffentlichen Gesundheitswesens R01 GM114561, R01 GM104540, R01 GM104540-03W1 und U24 GM139168 an E.R.W. und R01 AI150475 an P.W.S. vom NIH unterstützt. Ein Teil dieser Forschung wurde durch den NIH-Zuschuss U24 GM129547 unterstützt und am PNCC an der OHSU durchgeführt und über EMSL (grid.436923.9), eine vom Office of Biological and Environmental Research gesponserte DOE Office of Science User Facility, zugänglich gemacht. Wir sind auch dankbar für den Einsatz von Einrichtungen und Instrumenten am Cryo-EM Research Center in der Abteilung für Biochemie an der University of Wisconsin, Madison.

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Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Moderne, fortschrittliche Elektronenmikroskope und Softwarepakete unterstützen jetzt eine optimierte automatisierte Kryo-EM- und Kryo-ET-Datenerfassung, bei der Hunderte bis Tausende von Positionen innerhalb weniger Tage anvisiert und abgebildet werden können32,33,34,35. Ein wesentlicher limitierender Faktor für ganzzellige Kryo-ET-Workflows war die Erzielung einer ausreichenden Anzahl sammelbarer Ziele pro Raster. In jüngster Zeit haben eine Reihe von Gruppen Protokolle für Mikrostrukturierungsgitter für Kryo-EM entwickelt, wobei ein Vorteil eine verbesserte Datenerfassungseffizienz ist16,17,18. Hier wird ein Protokoll zur Verwendung eines kommerziell erhältlichen Mikrostrukturierungssystems zur Mikrostrukturierung von TEM-Gittern für Kryo-ET-Studien an primären Drosophila-Neuronen und kultivierten menschlichen Zelllinien (nicht infiziert oder RSV-infiziert) vorgestellt. Dieses Mikrostrukturierungssystem ist vielseitig und viele Schritte können optimiert und auf spezifische experimentelle Ziele zugeschnitten werden. Ein Benutzer mit Erfahrung in der TEM- und Fluoreszenzmikroskopie kann sich schnell mit der Netzvorbereitung und mikrostrukturierung vertraut machen. Bei sorgfältiger Übung sollten gute Ergebnisse nach einigen Iterationen erreichbar sein. Im Folgenden werden einige der verfügbaren Optionen, Benutzerüberlegungen, potenziellen Vorteile und zukünftigen Anwendungen der Mikrostrukturierung für Kryo-EM diskutiert.
Eine der wichtigen Überlegungen für die Kryo-ET der ganzen Zelle ist die Auswahl des EM-Gitters. EM-Gitter bestehen aus zwei Teilen: einem Netzrahmen (oder einer strukturellen Unterstützung) und der Folie (oder Folie), die die kontinuierliche oder löchrige Filmoberfläche ist, auf der Zellen wachsen. Kupfergeflechtgitter werden häufig für Kryo-EM von Proteinen und isolierten Komplexen verwendet. Sie sind jedoch aufgrund der Zytotoxizität von Kupfer für ganzzellige Kryo-ET ungeeignet. Stattdessen wird häufig ein Goldnetz für die Zelltomographie verwendet. Andere Optionen umfassen Nickel oder Titan, die Vorteile gegenüber Gold bieten können, wie z.B. erhöhte Steifigkeit16. EM-Gitter sind mit unterschiedlichen Maschenweiten erhältlich, um eine Reihe von Anwendungen zu unterstützen. Größere Maschenweiten bieten mehr Platz für Zellen, um zwischen Gitterstäben und mehr Bereichen zu wachsen, die für die Sammlung von Kippreihen zugänglich sind, wenn auch auf Kosten einer erhöhten Gesamtbrüchigkeit der Proben. Die am häufigsten verwendete Folie ist perforierter oder löchriger amorpher Kohlenstoff, wie Quantifoils oder C-Flat-Gitter. Biologische Ziele können entweder durch die Löcher im Kohlenstoff oder durch den elektronendurchscheinenden Kohlenstoff abgebildet werden. Gitter wie R 2/1 oder R 2/2, bei denen die Bohrungen 2 μm breit sind und 1 bzw. 2 μm voneinander entfernt sind, bieten eine große Anzahl von Löchern und damit eine große Anzahl potenzieller Bereiche für die Datenerfassung. Einige Zellen können jedoch auf gleichmäßigeren Oberflächen wie R 1,2/20-Gittern oder kontinuierlichem Kohlenstoff besser wachsen und sich ausdehnen. Bei der nachgeschalteten Probenbearbeitung durch fokussiertes Ionenstrahlfräsen (Cryo-FIB) wird die Folie durch Fräsen entfernt, wodurch Bedenken hinsichtlich des fortgesetzten Vorhandenseins der darunter liegenden Folie verringert werden. Wie beim Mesh sind auch Folien aus anderen Materialien erhältlich, wobei das hier vorgestellte Patterning-Protokoll auch für SiO2-Gitter geeignet ist. Zu den häufig verwendeten Gittern gehören Gold-Quantifoil-, kontinuierliche Kohlenstoff- oder SiO2-Film-200-Mesh-Gitter (~ 90 μm Abstand zwischen Gitterbalken) für Ganzzell-Kryo-ET.
Beim Entwerfen eines Musters gibt es eine Reihe von Überlegungen. Ein Großteil dieser Entscheidungen richtet sich nach dem Zelltyp und dem Zweck des Experiments. Ein guter Ausgangspunkt ist es, ein Muster zu wählen, das sich der Form und den Abmessungen der Zellen in Kultur annähert. Viele Studien haben signifikante Auswirkungen der Musterform auf das Zellwachstum und die Zytoskelettanordnung gezeigt13,36,37. Besondere Vorsicht ist bei der Mustergestaltung geboten, wenn dies das gewünschte Ziel verändern könnte. Mehrere Muster für jeden Zelltyp wurden getestet, um festzustellen, welche Muster die zelluläre Adhäsion und das Wachstum förderten. Die Flexibilität des Mikrostrukturierungssystems ermöglicht das Testen mehrerer Muster auf einem einzigen Raster und das Ändern von Mustern für verschiedene Gitter innerhalb eines einzigen Experiments. Größere Muster (~50-90 μm), wie sie hier verwendet werden, erhöhen die Wahrscheinlichkeit, dass mehrere Zellen an einem einzigen Bereich des Musters haften und es den Zellen ermöglichen, sich nach der Adhäsion auszudehnen und auszudehnen. Eingeschränktere Muster (20-30 μm) können in Experimenten geeignet sein, bei denen die Zellisolation kritischer ist als die Zellexpansion, z. B. für Experimente mit fokussiertem Ionenstrahlmahlen (Cryo-FIB). Für Tomographie-Anwendungen muss man möglicherweise den Einfluss der Neigungsachse berücksichtigen. Wenn ein Muster so positioniert ist, dass alle Zellen parallel zueinander in einer Richtung wachsen, ist es möglich, dass alle Zellen senkrecht zur Kippachse stehen, wenn sie auf das Mikroskoptisch geladen werden, was zu einer geringeren Datenqualität führt.
Auf ungemusterten Gittern haften Zellen oft bevorzugt an den Gitterbalken, wo sie von TEM nicht abgebildet werden können. Selbst auf gemusterten Gittern wird oft beobachtet, dass Zellen in den Ecken von Gitterquadraten positioniert sind, teilweise sowohl auf der gemusterten Kohlenstofffolie als auch auf dem Gitterbalken. Kürzlich wurde Mikrostrukturierung verwendet, um einen Teil der Zelle absichtlich über der Gitterleiste zu positionieren18. Dies könnte für Experimente in Betracht gezogen werden, bei denen es nicht entscheidend ist, die gesamte Zellperipherie auf der Folie zu haben. Dies kann besonders wichtig für Zellen sein, die größer als ein einzelnes Gitterquadrat wachsen können, wie z. B. primäre Neuronen, die über mehrere Tage wachsen.
Es gibt viele Werkzeuge, die verwendet werden können, um ein Muster zu entwerfen. Hier wurde das Muster auf weniger als 800 Pixel in jeder Dimension beschränkt, so dass das Muster in jeden Winkel gedreht werden kann und immer noch in den maximalen Bereich passt, der in einer einzigen Projektion durch dieses Mikrostrukturierungssystem gemustert werden kann. Dies ermöglicht es dem Benutzer, das Muster so zu drehen, dass es unabhängig von der Ausrichtung des Gitters auf dem Mikroskop richtig mit dem Gitter ausgerichtet ist. Hier wurde das Raster in sechs Musterbereiche unterteilt. In erster Linie ermöglicht dies eine Fokusanpassung zwischen verschiedenen Regionen des Rasters. Insbesondere Goldgitter sind sehr formbar und dürfen sich nicht ganz flach auf das Glas legen. Der richtige Fokus ist für saubere, verfeinerte Musterergebnisse unerlässlich. Durch die Verwendung von segmentierten Mustern müssen nur geringfügige Anpassungen an der Musterposition vorgenommen werden, wenn sich das Gitter während des Strukturierungsprozesses leicht verschiebt, obwohl dies bei der Verwendung des PLPP-Gels mit den PDMS-Schablonen normalerweise kein Problem darstellt. Schließlich blieben die zentralen vier Gitterquadrate des Rasters ungemustert. Dies unterstützt einen Benutzer in der Lage, die Mitte des Gitters eindeutig zu identifizieren, was für korrelative Bildgebungsexperimente sehr nützlich ist.
Die Strukturierungssoftware für dieses Mikrostrukturierungssystem, Leonardo, verfügt auch über erweiterte Funktionen wie Stitching und die Möglichkeit, Muster als PDFs zu importieren, die über den Rahmen dieses Protokolls hinausgehen. Diese Software umfasst auch die Erkennung von Mikrostrukturen und die automatisierte Musterpositionierung, die auf TEM-Gittern verwendet werden können. Diese Funktion ist am nützlichsten, wenn das Raster sehr flach ist und gemustert werden kann, ohne dass der Fokus zwischen verschiedenen Bereichen angepasst werden muss.
Die Auswahl eines ECM-Proteins kann einen signifikanten Einfluss auf die Zelladhäsion und -ausdehnung haben. Es ist bekannt, dass einige Zellen physiologische Veränderungen erfahren, wenn sie auf bestimmten Substraten gezüchtet werden38. Mehrere ECM-Proteine und -Konzentrationen wurden für jeden neuen Zelltyp getestet, basierend auf früheren Arbeiten, die in der Literatur berichtet wurden. Laminin, Fibrinogen, Fibronektin und Kollagen werden häufig für kultivierte Zellen verwendet und können als Ausgangspunkt verwendet werden, wenn keine anderen Daten verfügbar sind. Es müssen jedoch auch andere ECM-Proteine berücksichtigt werden, wenn die häufig verwendeten ECM-Proteine den Zellen keine angemessenen Adhärenzeigenschaften verleihen. Dies galt insbesondere für primäre Drosophila-Neuronen , da eine hohe Konzentration des pflanzlichen Lektins Concanavalin A für eine ordnungsgemäße zelluläre Adhärenz notwendig war. Die Kompatibilität der zellulären Adhäsion und des Wachstums mit dem ECM kann durch Musterung auf Glasschalen oder Objektträgern vor dem Übergang zu TEM-Gittern getestet werden. Dieser Pre-Screening-Ansatz ist zeit- und kosteneffizient, wenn eine große Anzahl von Kombinationen untersucht werden muss. Die Einbeziehung eines fluoreszenzkonjugierten ECM-Proteins ist wertvoll, um den Erfolg und die Qualität der Musterung zu beurteilen.
Cell Seeding ist einer der wichtigsten Schritte für ganzzellige Kryo-ET, entweder mit oder ohne Mikrostrukturierung6,16,39. Für primäre Drosophila oder andere Neuronen, die zerbrechlich, instabil in der Suspension und in der Menge begrenzt sein können, werden einzelne Seeding-Ansätze gegenüber überwachter, sequentieller Zellsaat bevorzugt. Ein einzelner Seeding-Schritt bei einer optimierten Zelldichte, wie im Protokoll für Drosophila-Neuronen beschrieben, ist für die meisten Zelltypen eine praktikable Option. Es ist aber auch möglich, Zellen in einer geringeren Ausgangskonzentration auf das Substrat zu säen und mehr Zellen überwacht hinzuzufügen, wie hier und in anderer Literatur18 beschrieben. Dieses sequenzielle Seeding kann in einigen Fällen konsistentere Ergebnisse liefern. Ähnlich wie bei der Standardzellkultur sollte immer darauf geachtet werden, die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten und die Zellverklumpung während der Isolierung zu minimieren.
Wenn Sie zum ersten Mal mit dem Mikromustern beginnen, gibt es einige potenzielle Fallstricke, die sich nachteilig auf das Endergebnis auswirken. Sorgfältige Gitterhandhabung und sterile Technik, eine gleichmäßige Verteilung des PLPP-Gels, die richtige Dosis und Fokussierung während der Strukturierung sowie die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit vor der Aussaat gehören zu den wichtigsten Überlegungen für den Erfolg. Eine Liste einiger der potenziellen Probleme sowie Lösungen wurde in Tabelle 1 zusammengestellt.
Mikrostrukturierte Gitter können verwendet werden, um Zellen zu positionieren, um eine konsistente Zelldichte über das Gitter hinweg herzustellen und interessante Bereiche in Bereichen zu positionieren, die für die Sammlung von Neigungsreihen geeignet sind16,18. Die Platzierung und Positionierung von Zellen kann als fiduziale Marker für die Korrelation in Kryo-CLEM-Experimenten verwendet werden, wodurch der Bedarf an fragilen Suchergittern und fluoreszierenden Fiducialmarkern reduziert wird. Es sollte jedoch beachtet werden, dass solche fiduzialen Marker für die Submikrometer-Genauigkeitskorrelation immer noch nützlich sein können29,40. Darüber hinaus ist eine gleichmäßige Verteilung isolierter Zellen auch für Kryo-FIB-Experimente (Focused-Ion Beam Milling) von großem Nutzen, um die Anzahl der Zellen zu maximieren, aus denen Lamellen geschnitten werden können16.
Die Hinzufügung von Mikromustern zu Kryo-EM-Workflows wird zu messbaren Verbesserungen des Datendurchsatzes führen und möglicherweise neue Experimente ermöglichen. Mit der weiteren Einführung und Entwicklung der Technik werden fortschrittlichere Anwendungen der Mikrostrukturierung, einschließlich ECM-Gradienten, mehrerer ECM-Ablagerungen und Mikrostrukturmontage, die Fähigkeiten von Kryo-ET zur Untersuchung biologischer Ziele und Prozesse im vollständigen zellulären Kontext weiter ausbauen.

Mit der Entwicklung, Erweiterung und Vielseitigkeit der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) haben Forscher eine breite Palette biologischer Proben in einem nahezu nativen Zustand von makromolekularer (~ 1 nm) bis hoher (~ 2 Å) Auflösung untersucht. Einzelpartikel-Kryo-EM- und Elektronenbeugungstechniken werden am besten auf gereinigte Makromoleküle in Lösung bzw. in kristallinem Zustand angewendet1,2. Während die Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) einzigartig für nahezu native strukturelle und ultrastrukturelle Untersuchungen großer, heterologer Objekte wie Bakterien, pleomorpher Viren und eukaryotischer Zellen3 geeignet ist. Bei kryo-ET werden dreidimensionale (3D) Informationen erhalten, indem die Probe physikalisch auf dem Mikroskoptisch geneigt und eine Reihe von Bildern durch die Probe in verschiedenen Winkeln aufgenommen wird. Diese Bilder oder Neigungsserien decken oft einen Bereich von +60/-60 Grad in Schritten von ein bis drei Grad ab. Die Neigungsreihe kann dann rechnerisch zu einem 3D-Volumen rekonstruiert werden, das auch als Tomogramm4 bezeichnet wird.
Alle Kryo-EM-Techniken erfordern, dass die Probe in eine dünne Schicht aus amorphem, nichtkristallinem Glaseis eingebettet wird. Eine der am häufigsten verwendeten Kryofixierungstechniken ist das Tauchgefrieren, bei dem die Probe auf das EM-Gitter aufgetragen, abgeschmolzen und schnell in flüssiges Ethan oder eine Mischung aus flüssigem Ethan und Propan getaucht wird. Diese Technik ist ausreichend für die Vitrifikation von Proben von <100 nm bis ~10 μm Dicke, einschließlich kultivierter menschlicher Zellen, wie HeLa-Zellen5,6. Dickere Proben wie Mini-Organoide oder Gewebebiopsien mit einer Dicke von bis zu 200 μm können durch Hochdruckgefrieren vitrifiziert werden7. Aufgrund der erhöhten Elektronenstreuung dickerer Proben ist die Proben- und Eisdicke für Kryo-ET jedoch in 300-kV-Transmissionselektronenmikroskopen auf ~ 0,5 - 1 μm begrenzt. Daher ist die Ganzzell-Kryo-ET vieler eukaryotischer Zellen auf die Zellperipherie oder Erweiterungen von Zellen beschränkt, es sei denn, es werden zusätzliche Probenvorbereitungsschritte wie Kryoschnitt8 oder fokussiertes Ionenstrahlfräsen9,10,11 verwendet.
Eine Einschränkung vieler Ganzzell-Kryo-ET-Bildgebungsexperimente ist der Datenerfassungsdurchsatz12. Im Gegensatz zu Einzelpartikel-Kryo-EM, bei dem Tausende von isolierten Partikeln oft von einem einzigen TEM-Gitterquadrat abgebildet werden können, sind Zellen groß, verteilt und müssen mit einer ausreichend niedrigen Dichte gezüchtet werden, damit die Zellen in einer dünnen Schicht glasartigen Eises konserviert werden können. Oft ist die Region von Interesse auf ein bestimmtes Merkmal oder einen Teilbereich der Zelle beschränkt. Eine weitere Einschränkung des Durchsatzes ist die Neigung von Zellen, auf Bereichen zu wachsen, die für die TEM-Bildgebung nicht zugänglich sind, z. B. auf oder in der Nähe von TEM-Gitterstäben. Aufgrund unvorhersehbarer Faktoren, die mit Zellkulturen auf TEM-Grids verbunden sind, sind technologische Entwicklungen erforderlich, um die Zugänglichkeit der Proben und den Durchsatz für die Datenerfassung zu verbessern.
Die Substratmikrostrukturierung mit adhärenten extrazellulären Matrixproteinen (ECM) ist eine etablierte Technik für die Lebendzell-Lichtmikroskopie, um das Wachstum von Zellen auf starre, langlebige und optisch transparente Oberflächen wie Glas und andere Gewebekultursubstrate zu lenken13,14. Mikrostrukturierung wurde auch auf weichen und/oder dreidimensionalen (3D) Oberflächen durchgeführt. Solche Techniken haben nicht nur die präzise Positionierung von Zellen ermöglicht; Sie haben auch die Schaffung multizellulärer Netzwerke unterstützt, wie z. B. gemusterte neuronale Zellschaltkreise15. Die Einführung von Mikrostrukturierung auf Kryo-ET wird nicht nur den Durchsatz erhöhen, sondern auch neue Studien für die Erforschung komplexer und dynamischer zellulärer Mikroumgebungen eröffnen.
In jüngster Zeit haben mehrere Gruppen begonnen, Mikrostrukturierungstechniken auf TEM-Gittern durch mehrere Ansätze zu verwenden16,17. Hier wird der Einsatz einer maskenlosen Photostrukturierungstechnik für TEM-Gitter mit dem Mikrostrukturierungssystem Alvéole PRIMO beschrieben, das über eine hochauflösende und kontaktlose Musterung verfügt. Bei diesem Mikrostrukturierungssystem wird eine Antifouling-Schicht auf die Oberseite des Substrats aufgetragen, gefolgt von der Anwendung eines Photokatalysators und der Ablation der Anti-Fouling-Schicht in benutzerdefinierten Mustern mit einem UV-Laser. ECM-Proteine können dann zu den Mustern für die entsprechende Zellkultur hinzugefügt werden. Diese Methode wurde von mehreren Gruppen für Kryo-ET-Studien an retinalen Pigmentepithel-1 (RPE1), Madin-Darby-Hundenieren-II (MDCKII), menschlichen Vorhautfibroblasten (HFF) und endothelialen Zelllinien verwendet16,17,18. Dieses Mikrostrukturierungssystem ist mit mehreren Antifouling-Schichtsubstraten sowie entweder einem flüssigen oder Gel-Photokatalysator-Reagenz kompatibel. Eine Vielzahl von ECM-Proteinen kann aus der Spezifität der Zelllinie ausgewählt und angepasst werden, was dem Benutzer Vielseitigkeit verleiht.
Mikrostrukturierung wurde erfolgreich auf eine Reihe von Projekten innerhalb des Labors angewendet19. Hier wird ein Mikrostrukturierungsprotokoll vorgestellt, einschließlich spezifischer Anpassungen zur Untersuchung kultivierter HeLa-Zellen, mit dem respiratorischen Synzytialvirus (RSV) infizierter BEAS-2B-Zellen und primärer Larven-Drosophila melanogaster-Neuronen20.

<table><tbody><tr><td>0,1 % (w/v) Poly-L-Lysin</td><td>Sigma</td><td>P8920-100ML</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &μ; m Spritzenvorsatzfilter PVDF-Membran</td><td>Genesee</td><td>25-240</td><td></td></tr><tr><td>22x60-1 Abdeckglas</td><td>Fisher</td><td>12545F</td><td></td></tr><tr><td>5/15 Pinzette</td><td>EMS (Dumont)</td><td>0203-5/15-PO</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotisch (100X)</td><td>ThermoFisher (Gibco)</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>BEAS-2B-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen I,</td><td>ThermoFisher für Rinder ( Gibco)</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Konjugat</td><td>ThermoFisher (Invitrogen)</td><td>C11254</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher (Lonza)</td><td>BW12-604F</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Fisher (Decon Labs)</td><td>22-032-600</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen aus menschlichem Plasma, Alexa Fluor 647 Konjugat</td><td>ThermoFisher ( Invitrogen)</td><td>F35200</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin Rinderprotein, Plasma</td><td>ThermoFisher (Gibco)</td><td>33010018</td><td></td></tr><tr><td>Glasbodenschale</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>VWR</td><td>0643-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Gittervorbereitungshalter</td><td>EMS</td><td>71175-01</td><td></td></tr><tr><td>HeLa-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Fischer (SKC, Inc.)</td><td></td><td></td>22600100</tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher (ACROS Organics)</td><td>AC172572500</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher (Invitrogen)</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Fisher (Sigma Aldrich)</td><td>NC0520015</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MP Bio</td><td>194844</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher (ACROS Organics)</td><td>AC212595000</td><td></td></tr><tr><td>Leica-DMi8</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Kann mit Kamera-, Tisch- und Objektivaufsätzen angepasst werden</td></tr><tr><td>Leonardo</td><td>Alv&eacute; </td><td></td> ole <td>https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/</td></tr> <tr><td>Liberase Research Grade</td><td>Fisher (Supply Solutions)</td><td>50-100-3280</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>ThermoFisher (Invitrogen)</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopkamera</td><td>Hammamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td></td></tr><tr><td>Motorisierter Tisch</td><td>M&auml; rzh&auml; Benutzer Wetzlar</td><td>00-24-599-0000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher (Fisher BioReagents)</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher (ACROS Organics)</td><td>AC207802500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher (Alfa Aesar)</td><td>AAA1603736</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>PDMS Schablonen</td><td>nanoscaleLABS</td><td>PDMS_STENCILS_EM</td><td>https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/</td></tr> <tr><td>PEG-SVA</td><td>nanoscaleLABS</td><td>PEG-SVA-1GR</td><td>mPEG-Succinimidylvalerate, MW 5.000</td></tr><tr><td>Penicillin</td><td>Fisher (Research Products International Corp)</td><td>50-213-641</td><td></td></tr><tr><td>pH-Streifen</td><td>Fisher (Millipore Sigma)</td><td>M1095350001</td><td>pH-Sonde kann auch verwendet werden</td></tr><tr><td>PLPP-Gel</td><td>nanoscaleLABS</td><td>PLPP-GEL-300UL</td><td>https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/</td></tr> <tr><td>PRIMO</td><td>Alv&eacute; </td><td></td> ole <td>https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/</td></tr> <tr><td>pSynkRSV-I19F (BAC mit RSV A2-mK+ antigenomer cDNA)</td><td>BEI Resources</td><td>NR-36460</td><td>https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx</td></tr><tr><td>Quantifoil</td><td>Grids EMS (Quantifoil)</td><td>Q2100AR1</td><td>2 &micro; m Löcher im Abstand von 1 &micro; m auseinander, andere Abmessungen sind verfügbar</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Fisher (Lonza)</td><td>BW12-702F</td><td></td></tr><tr><td>RSV A2-mK+</td><td>siehe Eintrag für pSynkRSV-19F-Beschrieben</td><td></td> <td>in Hotard et al. [22]. Kann generiert werden aus pSynkRSV-ll9F</td></tr><tr><td>Schneider's Media</td><td>ThermoFisher (Gibco)</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>SerialEM</td><td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ )</td><td></td><td>https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td></tr> <tr><td>Gerade Pinzette</td><td>EMS (Dumont)</td><td>72812-D</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Fisher (Fisher BioReagenzien)</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Avantor</td><td>4097-04</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclin</td><td>Sigma</td><td>T8032-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Titan Krios Elektronenmikroskop</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>300kV, mit direkter Elektronendetektorkamera und Energiefilter</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>ThermoFisher (Gibco)</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Tube Revolver/Rotator</td><td>Fisher (Thermo Scientific)</td><td>11676341</td><td></td></tr><tr><td>UAS:mcD8:GFP Drosophila Fliegenstamm</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>5146</td><td>http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html</td></tr></tbody></table>

mikrostrukturierung von transmissionselektronenmikroskopie-gittern zur direkten zellpositionierung innerhalb von ganzzell-kryo-elektronentomographie-workflows

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Die Ganzzell-Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) ist eine leistungsstarke Technologie, die verwendet wird, um Nanometer-Auflösungsstrukturen von Makromolekülen herzustellen, die im zellulären Kontext vorhanden sind und in einem nahezu nativen gefrorenen hydratisierten Zustand konserviert werden. Es gibt jedoch Herausforderungen, die mit der Kultivierung und / oder dem Verkleben von Zellen auf TEM-Gittern in einer Weise verbunden sind, die für die Tomographie geeignet ist, während die Zellen in ihrem physiologischen Zustand erhalten bleiben. Hier wird ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Verwendung von Mikrostrukturierung zur Steuerung und Förderung des eukaryotischen Zellwachstums auf TEM-Gittern vorgestellt. Während der Mikrostrukturierung wird das Zellwachstum gesteuert, indem extrazelluläre Matrixproteine (ECM) innerhalb bestimmter Muster und Positionen auf der Folie des TEM-Gitters abgelagert werden, während die anderen Bereiche mit einer Antifouling-Schicht bedeckt bleiben. Flexibilität bei der Wahl der Oberflächenbeschichtung und des Musterdesigns macht die Mikrostrukturierung für eine Vielzahl von Zelltypen breit anwendbar. Mikrostrukturierung ist nützlich für die Untersuchung von Strukturen innerhalb einzelner Zellen sowie komplexerer experimenteller Systeme wie Wirt-Pathogen-Interaktionen oder differenzierten mehrzelligen Gemeinschaften. Mikrostrukturierung kann auch in viele nachgelagerte Ganzzell-Kryo-ET-Workflows integriert werden, einschließlich korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie (Kryo-CLEM) und fokussiertem Ionenstrahlfräsen (Kryo-FIB).

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Zelladhäsion und das Wachstum auf gezielte Bereiche von Gittern für die Kryo-Elektronenmikroskopie zu lenken. Dies wird durch das Auftragen einer Antifouling-Schicht erreicht, die in benutzerdefinierten Mustern abgetragen wird, gefolgt von der Ablagerung von extrazellulären Matrixproteinen in den gemusterten Bereichen vor der Zellaussaat.

Mikrostrukturierung von Transmissionselektronenmikroskopie-Gittern zur direkten Zellpositionierung innerhalb von Ganzzell-Kryo-Elektronentomographie-Workflows

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Unser Forschungsteam entwickelt Technologien und Protokolle für die Kryo-Elektronenmikroskopie und Kryo-Elektronentomographie. Wir haben Protokolle für die Mikrostrukturierung von TEM-Gittern entwickelt, um das Zellwachstum und die Positionierung für Kryo-ET-Experimente zu steuern. Die Ganzzell-Kryo-Elektronentomographie wird verwendet, um Nanometer-Auflösungsstrukturen makromolekularer Komplexe in Zellen herzustellen, die in einem nativen gefrorenen hydratisierten Zustand konserviert sind.Mikrostrukturierung kann den Durchsatz von Ganzzell-Kryo-ET-, kryokorrelativen Lichtelektronenmikroskopie- und kryofokussierten Ionenstrahl-Fräsexperimenten erhöhen. Die Anzahl und Verteilung der Zellen auf EM-Gittern ist entscheidend für ganzzellige Kryo-ET-Studien. Dieses Protokoll bietet eine schnelle, reproduzierbare und weitgehend anpassbare Methode, um das Zellwachstum auf EM-Gittern durch Mikrostrukturierung zu steuern.Der Forscher sollte sich mit Pipetten, Pinzetten, grundlegenden Zellkulturtechniken sowie Fluoreszenz- und Transmissionselektronenmikroskopen wohl fühlen. Verwenden Sie beim erstmaligen Patterning eine bekannte Zelltyp- und ECM-Kombination und testen Sie diese auf Deckgläsern oder MatTek-Schalen. Mitglieder des Forschungsteams, die an dieser Protokollentwicklung beteiligt sind, sind:Dr.Brian Sibert, Herr Joseph Kim und Dr. Jae Yang. Um zu beginnen, übertragen Sie die Gitter auf einen Gittervorbereitungshalter und entlüften Sie die Gitter mit der Kohlenstoffseite nach oben. Als nächstes übertragen Sie die Gitter mit der Kohlenstoffseite bis zu einem sauberen Glasobjektträger oder Deckglas mit einem Abstand von mindestens einem Zentimeter zwischen den Gittern.10 Mikroliter 0,05 Poly-L-Lysin auf jedes Gitter pipettieren und die Gitter in einer feuchten Kammer für mindestens 30 Minuten inkubieren. Nach der Inkubation wird jedes Gitter dreimal mit 15 Mikrolitern 0,1 molarem HEPES bei pH 8,5 gewaschen. Inkubieren Sie das Gitter in jeder Wäsche für 30 Sekunden und entfernen Sie dann den größten Teil der Flüssigkeit mit einer Pipette aus dem Gitter, ohne das Gitter trocknen zu lassen.Nach der letzten Wäsche lassen Sie jedes Gitter in 15 Mikrolitern 0,1 molaren HEPES. Bereiten Sie als Nächstes die PEG-SVA-Lösung vor und ersetzen Sie sofort die HEPES-Lösung auf den Gittern durch 10 Mikroliter der PEG-SVA-Lösung, dann inkubieren Sie die Gitter in einer Feuchtkammer für mindestens eine Stunde. Waschen Sie nach der Inkubation jedes Gitter dreimal mit 15 Mikrolitern sterilem Wasser und inkubieren Sie das Gitter in jeder Wäsche für 30 Sekunden.Nach der letzten Wäsche lassen Sie jedes Gitter in 15 Mikroliter Wasser. Legen Sie einen Ein-Mikroliter-Tropfen Wasser auf die Mitte eines neuen sauberen Deckglases und übertragen Sie dann vorsichtig das Gitter vom 15-Mikroliter-Wassertropfen auf den Tropfen auf dem neuen Deckglas mit der Kohlenstoffseite nach oben. Als nächstes platzieren Sie die PDMS-Schablone vorsichtig über dem Gitter, halten Sie das Gitter zentriert und minimieren Sie den Schablonenkontakt mit der Kohlenstofffolie des Gitters.Dann fügen Sie einen Mikroliter PLPP-Gel auf das Gitter und pipettieren Sie vorsichtig, um es zu mischen. Bewegen Sie das Deckglas mit dem Gitter zum Trocknen an eine dunkle Stelle. Das Gel trocknet in 15 bis 30 Minuten.Öffnen Sie für die Mikrostrukturierung die Software mit einer Live-Hellfeldansicht vom Mikroskop aus. Um eine neue Vorlage für eine erste Ausführung zu entwerfen, wählen Sie ROI hinzufügen und dann einen Kreis von 3.000 Mikrometern aus. Positionieren Sie den Kreis-ROI über dem Raster, indem Sie das Brightfield-Bild auf dem Bildschirm als Richtlinie verwenden, und drücken Sie dann die Sperre, um den ROI zu sichern.Nachdem Sie den ROI gesperrt haben, wählen Sie Muster hinzufügen und wählen Sie das entsprechende Muster aus. Generieren Sie mithilfe der Replikationsoptionen Kopien des ursprünglichen Musters, um einen quadratischen Rasterbereich von acht mal acht zu erstellen. Passen Sie den Abstand und den Winkel nach Bedarf an, um die Muster an den Rasterquadraten auszurichten.Positionieren Sie das Muster in einer Ecke des Rasters. Duplizieren Sie als Nächstes das Muster und platzieren Sie eine Kopie in jeder der vier Ecken des Rasters, indem Sie die Mikroskopstufe nach Bedarf für jede Region bewegen. Verwenden Sie die Replikationsoptionen, um einen quadratischen Bereich mit acht mal acht Rastern in einen bereich mit zwei mal acht Rasterquadraten zu ändern, der auf beiden Seiten der Mitte platziert werden soll.Lassen Sie die mittleren vier Rasterquadrate ungemustert. Passen Sie bei Bedarf für jedes Muster die Gesamtdosis an. 30 Millijoule pro Quadratmillimeter sind ein guter Ausgangspunkt.Wiederholen Sie unter Expertenoptionen das Anpassen des Winkels, der Position, des Abstands zwischen und des Verhältnisses des Musters, um die Ausrichtung des Musters an den Rasterquadraten zu verfeinern. Bewegen Sie den Mikroskoptisch, um den Rasterbereich in der Brightfield-Anzeige zu ändern. Sobald die Vorlage und die Muster positioniert sind, deaktivieren Sie alle Bereiche bis auf einen im Aktionsbereich der Software.Verwenden Sie den Mikroskoptisch, um zu diesem Bereich zu navigieren und konzentrieren Sie sich auf die Kohlenstofffolie. Klicken Sie auf das Augapfelsymbol im Aktionsfenster, um die Muster-Overlay-Anzeige auszuschalten. Sobald das Raster scharf ist, schließen Sie den Brightfield-Verschluss und drücken Sie das Wiedergabesymbol in der unteren rechten Ecke der Software, um den Musterungsprozess zu starten, der live überwacht werden kann.Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Bereiche strukturiert sind. Zum Schluss den Deckglas mit dem Gitter aus dem Mikroskop entfernen und sofort 10 Mikroliter steriles PBS auf das Gitter geben. Nach 10 Minuten die Schablone mit einer Pinzette entfernen, dann das Gitter dreimal mit 15 Mikrolitern PBS waschen und jedes Gitter in PBS an einem dunklen Ort lassen.Bereiten Sie 15 Mikroliter der extrazellulären Matrix für jedes Gitter vor, ersetzen Sie dann das PBS aus jedem Gitter durch 15 Mikroliter der extrazellulären Matrix und inkubieren Sie das Gitter in einer feuchten Kammer für mindestens eine Stunde. Waschen Sie nach der Inkubation jedes Gitter fünfmal mit 15 Mikrolitern sterilem PBS, wie zuvor gezeigt. Lassen Sie nach der letzten Wäsche jedes Gitter in PBS.Mit einem Fluoreszenzmikroskop das Fluorophor in der extrazellulären Matrix nachweisen, um die Musterung zu bestätigen und dass die Kohlenstofffolie intakt bleibt. HeLa-Zellen, die auf mikrogemusterte und ungemusterte TEM-Gitter gesät werden, sind durch fluoreszierende Färbung mit einem Calcein AM- und Ethidium-Homodimer-1-basierten Zelllebensfähigkeitstest sichtbar. Unter Verwendung einer gemischten extrazellulären Kollagen- und Fibrinogenmatrix haften HeLa-Zellen leicht an Mustern im gesamten Gitter.Die Gesamtmorphologie von Zellen, die sich entlang des Musters ausdehnten, ähnelt der von Zellen, die auf ungemusterten Gittern gezüchtet wurden. Ein Hellfeldbild von RSV-infizierten BEAS-2B-Zellen 18 Stunden nach dem Seeding zeigt Zelladhäsion und -wachstum entlang der zentralen Region des Musters. Die meisten infizierten Zellen befinden sich entlang des zentralen Bereichs mit höherer Dichte des Gradientenmusters.Die RSV-Varianten befinden sich in der Nähe der Peripherie der infizierten BEAS-2B-Zellen, die auf mikrostrukturierten Gittern gezüchtet wurden. Viele RSV-Strukturproteine werden in den Tomogrammen identifiziert, einschließlich des Nukleokapsidsids und des viralen Fusionsproteins. Auf mikrostrukturierten Gittern können Drosophila-Neuronen mit pannononaler GFP-Expression aufgrund der fluoreszierenden Markierung und ihrer Lage innerhalb der Mikromuster leicht durch Lichtmikroskopie verfolgt werden.Neuronen auf ungemusterten Gittern können auch durch GFP-Signalisierung durch Lichtmikroskopie verfolgt werden. Die Lokalisierung in der Kryo-Elektronenmikroskopie wird jedoch aufgrund von Zelltrümmern und Verunreinigungen durch die Medien schwierig. Aufgrund der Abmessungen des Neuronenzellkörpers und der ausgedehnten Neuriten werden Kryo-Elektronentomographie-Neigungsreihen entlang dünnerer Regionen der Zellen mit höherer Vergrößerung gesammelt.Die neuronale Zellmembran, Mitochondrien, Mikrotubuli, Aktinfilamente, vesikuläre Strukturen und Makromoleküle wie Ribosomen sind in Bildmontagen mit höherer Vergrößerung gut aufgelöst und schneiden durch das 3D-Tomogramm. Ähnliche subzelluläre Merkmale werden aus 3D-Tomogrammen ungemusterter Neuronen beobachtet. Das Auftragen der Schablone auf das Gitter und das Hinzufügen des PLPP-Gels ist der empfindlichste Schritt, der die Musterungsergebnisse beeinflussen kann und mit Vorsicht erfolgen sollte.Cryo-CLEM kann verwendet werden, um interessante Ziele in Zellen für die Kryo-ET-Datenerfassung zu lokalisieren. Cryo-FIB-REM kann verwendet werden, um Zellen auf Bereichen zu verdünnen, die sonst zu dick für die Datenerfassung sind.

micropatterning-transmission-electron-microscopy-grids-to-direct-cell

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Wir zeigen hier, wie Elektronen cryotomography (ECT) zu verwenden, um auf die Ultrastruktur von Bakterienzellen in nahezu native Staaten zu studieren, "makromolekularen" (~ 4 nm) Auflösung.

Electron Cryotomography von Bakterienzellen

Wir beschreiben eine korrelative Mikroskopie-Methode, die High-Speed-3D-Live-cell Fluoreszenzlichtmikroskopie und hochauflösenden Kryo-Elektronen-Tomographie vereint. Wir demonstrieren die Fähigkeit des korrelativen Verfahren durch Abbilden dynamisch kleine HIV-1-Partikeln Interaktion mit dem Host-HeLa-Zellen.

Korrelative Mikroskopie für 3D-Strukturanalyse von dynamischen Wechselwirkungen

Wir präsentieren ein Protokoll, wie Hochdurchsatz-Kryo-Elektronentomographie zu nutzen, um hochauflösende in situ Strukturen der molekularen Maschinen zu bestimmen. Das Protokoll unterstützt große Datenmengen zu verarbeiten sind, vermeidet gemeinsame Engpässe reduziert Ressourcenstillstandszeit, so dass der Benutzer auf wichtige biologische Fragen zu konzentrieren.

Verwendung Tomoauto: Ein Protokoll für die Hochdurchsatz-Automated Kryo-Elektronentomographie

Instrument und Verfahren zur Herstellung von Nanoliter große Probenvolumina für Transmissions-Elektronenmikroskopie wird vorgestellt. Papier-Blot-Schritte sind nicht erforderlich, wodurch die nachteiligen Folgen, die dies für Proteine, deutlich reduziert Probenverlust und ermöglicht die Analyse der einzelnen Zelle lysate für visuelle Proteomics haben kann.

Miniaturisierte Probenvorbereitung für Transmissions-Elektronenmikroskopie

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, das die Probenvorbereitungs- und Datenerfassungsschritte beschreibt, die in der Kryo-Soft-Röntgentomographie (SXT) erforderlich sind, um die Ultrastruktur ganzer kryokonservierter Zellen mit einer Auflösung von 25 nm Halbtonhöhe abzubilden.

Eine kartographische 3D-Beschreibung der Zelle durch Kryo-Soft-Röntgentomographie

Die steigende Nachfrage nach großflächiger Datenerfassung in der kryogenen Elektronentomographie erfordert Bilderfassungsroutinen mit hohem Durchsatz. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das die jüngsten Entwicklungen fortschrittlicher Akquisitionsstrategien implementiert, die darauf abzielen, die Zeiteffizienz und den Durchsatz der tomographischen Datenerfassung zu maximieren.

Strategien zur Optimierung der Datenerfassung in der Kryoelektronentomographie

Hier stellen wir eine Pipeline für das 3D-korrelative fokussierte Ionenstrahlfräsen vor, um die Präparation zellulärer Proben für die Kryo-Elektronentomographie zu steuern. Die 3D-Position von fluoreszenzmarkierten Proteinen von Interesse wird zunächst durch Kryo-Fluoreszenzmikroskopie bestimmt und dann gezielt gemahlen. Das Protokoll eignet sich für Säugetier-, Hefe- und Bakterienzellen.

Probenvorbereitung durch 3D-korrelatives fokussiertes Ionenstrahlfräsen für die hochauflösende Kryo-Elektronentomographie

Das vorliegende Protokoll beschreibt die hochauflösende Kryo-Elektronentomographie-Ferndatenerfassung mit Tomo5 und die anschließende Datenverarbeitung und Subtomogramm-Mittelung mittels emClarity. Apoferritin wird als Beispiel verwendet, um detaillierte Schritt-für-Schritt-Prozesse zu veranschaulichen, um eine Kryo-ET-Struktur bei 2,86 Å Auflösung zu erreichen.

Kryo-Elektronen-Tomographie Ferndatenerfassung und Subtomogramm-Mittelwertbildung

Diese Methode bietet ein zugängliches und flexibles Protokoll für die Herstellung von Elektronenmikroskopie-Gittern (EM) für die zelluläre In-situ-Kryotomographie und die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM).

Probenvorbereitung für die In-situ-Kryotomographie von Säugetierzellen

Dieses Protokoll standardisiert die Kryo-Elektronen-Tomographie (Kryo-ET) für dickes Gewebe, indem es Hochdruck-Gefrieren (HPF) mit der Waffelmethode, kryogenen Fokusionenstrahl (Cryo-FIB) Lift-out und dosissymmetrische, parallele Aufnahme integriert, wodurch gleichmäßig dünne Lamellen und vitrifizierte Proben für eine reproduzierbare In-situ-Analyse im Maus-Hippocampus entstehen.

Kryo-Elektronen-Tomographie-Workflow für dickes Gewebe demonstriert im Maus-Hippocampus

Erfahren Sie die Mikrostrukturierung von TEM-Gittern zur direkten Zellpositionierung für Kryo-Elektronentomographie. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Bildgebung zellulärer Strukturen in nativem Zustand.

Mikrostrukturierung von Transmissionselektronenmikroskopie-Gittern zur direkten Zellpositionierung innerhalb von Ganzzell-Kryo-Elektronentomographie-Workflows (Video) | JoVE Journal

Mikrostrukturierung von Transmissionselektronenmikroskopie-Gittern zur direkten Zellpositionierung innerhalb von Ganzzell-Kryo-Elektronentomographie-Workflows

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