Name: מדידה של תוכן ברזל רקמות שאינן Heme באמצעות בדיקת צבע מבוססת Bathophenanthroline (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: למדו למדוד תוכן ברזל שאינו הם ברקמות בעלי חיים באמצעות בדיקת צבע מבוססת Bathophenanthroline. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח בקיבול גבוה וחקר מטבוליזם הברזל במודלים ניסויים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי קרנות לאומיות באמצעות FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., תחת הפרויקט UIDB/04293/2020.

עכברי C57BL/6 נרכשו מסחרית ועכברי hepcidin-null (Hamp1−/−) על רקע C57BL/68 היו מתנה חביבה מסופי ולונט (מכון קוצ'ין, צרפת). בעלי חיים שוכנו במתקן לבעלי חיים i3S בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים, בסביבה מבוקרת טמפרטורה ואור, עם גישה חופשית לצ'או ומים מכרסמים סטנדרטיים. בס ים אירופאי (Dicentrarchus labrax) נרכש מחוות דגים מסחרית ושוכנים במתקן החיות של ICBAS, בסביבה מבוקרת טמפרטורה ואור, והאכילו מדי יום ליביטום ad עם הזנת בס ים סטנדרטית. כל ההליכים הנוגעים לבעלי חוליות אושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים i3S והרשות הלאומית, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV). מידע על ריאגנטים מסחריים, ציוד ובעלי חיים מפורט בטבלת החומרים.
1. הכנת פתרון
הערה: יש לטפל ולהכין את כל הריאגנטים והפתרונות באמצעות כלי זכוכית ללא ברזל או כלי פלסטיק חד פעמיים. אין לאפשר לחומרי מעבדה מתכתיים (למשל, מריות נירוסטה) לבוא במגע עם כל ריאגנט או פתרון, בשל הסיכון לזיהום ברזל. ודא שכל כלי זכוכית לשימוש חוזר הם ללא ברזל. לשטוף את החומרים עם חומר ניקוי מעבדה מתאים במשך 30-60 דקות, לשטוף עם מים deionized, להשרות לילה בתמיסה 37% חומצה חנקתית מדולל 1:3 עם מים deionized, לשטוף שוב עם מים deionized, ולאפשר להתייבש.
<ol><li>תערובת חומצה: הוסיפו 10 גרם חומצה טריכלורואצטית ל-82.2 מ"ל של 37% חומצה הידרוכלורית בבקבוק זכוכית, התמוססו ביסודיות והתאמו את הנפח הסופי ל-100 מ"ל עם מים שעברו דה-יוניזציה. יש לנער לפני השימוש. לחלופין, יש להשתמש רק ב-37% חומצה הידרוכלורית לעיכול רקמות. הערה: הפתרון יציב למשך חודשיים לפחות כאשר הוא מאוחסן בבקבוקי ריאגנט מזכוכית חומה כהה. אזהרה: חומצה הידרוכלורית וחומצה טריכלורואצטית הן מאכלות, וצורות מרוכזות משחררות אדים חומציים רעילים. יש ללבוש בגדי מגן, כפפות עמידות בפני כימיקלים ומשקפי התזה כימיים בכל עת בעת טיפול בחומצות. הימנע לנשום אותם ותמיד לטפל בחומצות בזמן מתחת למכסה המנוע אדים.</li>
	<li>נתרן אצטט רווי: להוסיף 228 גרם של אצטט נתרן נטול מים ל 400 מ"ל של מים deionized בבקבוק זכוכית להתסיס לילה בטמפרטורת החדר. תן לפתרון לנוח ולזרז ליום אחד. אם לא מתרחשת משקעים, המשך להוסיף כמויות קטנות של נתרן אצטט. אחסנו את התמיסה בבקבוק זכוכית.</li>
	<li>כרומוגן ריאגנט: כדי להכין 1 מ"ל של ריאגנט כרומוגן, להוסיף 1 מ"ג של 4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline חומצה דיסולונית דיסודיום מלח ל 500 μL של מים deionized ו 10 μL של מרוכז (100%) חומצה תיוגליקולית, ולהתמוסס ביסודיות. הפוך את הנפח הסופי ל 1 מ"ל עם מים deionized. הערה: הכינו כמה ריאגנטים של כרומוגן לפי הצורך. הפתרון יציב למשך חודש אחד כאשר הוא מוגן מפני אור.</li>
	<li>ריאגנט כרומוגן עובד (WCR): הוסף נפח אחד של ריאגנט הכרומוגן ל -5 כרכים של נתרן אצטט רווי ו -5 כרכים של מים deionized. הערה: פתרון זה צריך להיות מוכן טרי ביום השימוש.</li>
	<li>פתרון סטנדרטי ברזל מלאי: כדי להכין פתרון ברזל 20m מלאי, למקם 111.5 מ"ג של אבקת ברזל קרבוניל בבקבוק נפח 250 מ"ל המכיל 5,480 μL של 37% חומצה הידרוכלורית. להשאיר להתמוסס לילה בטמפרטורת החדר (או לדגור באמבט מים רותחים). לאחר מכן, לפצות את הפתרון נפח סופי של 100 מ"ל עם מים deionized. הערה: הפתרון הסטנדרטי יכול להישמר ללא הגבלת זמן כאשר הוא מאוחסן בכלי אטום היטב.</li>
	<li>פתרון תקן ברזל עובד (WISS): להוסיף 13.5 μL של 37% חומצה הידרוכלורית ל 500 μL של מים deionized. הוסף 10 μL של פתרון תקן ברזל מלאי ולהרכיב את הנפח הסופי ל 1 מ"ל עם מים deionized (11.169 מיקרוגרם של Fe / mL, 200 μM; נמדד על ידי AAS). הערה: פתרון העבודה צריך להיות מוכן טרי ביום השימוש.</li>
</ol>2. ייבוש מדגם
<ol><li>חותכים דגימה של רקמה במשקל 10-100 מ"ג עם להב אזמל. שקול אותו במדויק באיזון אנליטי/מדויק על פיסת parafilm קטנה (משקל טרי).</li>
	<li>באמצעות פינצטה מפלסטיק, מניחים את חתיכת הרקמה בצלחת של 24 באר (ללא החלקה כדי לאפשר אידוי מים) ומניחים לה להתייבש על אינקובטור סטנדרטי ב 65 °C (65 °F) עבור 48 שעות.</li>
	<li>לחלופין, יש להשתמש בתנור עיכול מיקרוגל מעבדה לייבוש דגימות רקמות. בעזרת פינצטה מפלסטיק, מניחים את פיסת הרקמה השקולה בכוס טפלון נטולת ברזל ומייבשים אותה במיקרוגל. הגדר את פרמטרי ההפעלה בהתאם למדריך ההוראות של המכשיר. הערה: כהפניה, פרמטרי הפעלה לייבוש דגימות כבד באמצעות תנור העיכול הספציפי (ראה טבלת חומרים) מוצגים בטבלה 1.</li>
	<li>באמצעות פינצטה מפלסטיק, מניחים כל פיסת רקמה מיובשת על פיסת פרפילם קטנה בתוך איזון אנליטי/מדויק ושוקלים אותה במדויק (משקל יבש).</li>
</ol>3. דגימת עיכול חומצי
<ol><li>באמצעות פינצטה מפלסטיק, מעבירים כל פיסת רקמה מיובשת לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.</li>
	<li>מוסיפים 1 מ"ל מתערובת החומצה וסוגרים את צינור המיקרוצנטריפוגה. הכן חומצה ריקה באותו אופן, אלא שהרקמה מושמטת. אזהרה: תערובת החומצה מאכלת ומשחררת אדים רעילים. יש ללבוש בגדי מגן, כפפות עמידות בפני כימיקלים ומשקפי התזה כימיים בעת טיפול בתערובת החומצה. הימנע לנשום אותו ותמיד להתמודד עם זה בזמן מתחת למכסה המנוע אדים.</li>
	<li>לעכל את הרקמות על ידי הדגירה של צינורות microcentrifuge באינקובטור ב 65 °C (65 °F) עבור 20 שעות.</li>
	<li>לאחר קירור לטמפרטורת החדר, להעביר 500 μL של תמצית חומצה ברורה (צהובה) (supernatant) לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל באמצעות micropipette מצויד טיפים מפלסטיק. אם לא ניתן להשיג supernatant ברור, לבצע ספין צנטריפוגה קצרה. זהירות: הסופר-ננט הוא חומצי מאוד. יש ללבוש בגדי מגן, כפפות עמידות בפני כימיקלים ומשקפי התזה כימיים בעת טיפול בסופר-נתחים. תמיד להתמודד איתם תחת מכסה המנוע אדים. הערה: בשלב זה, תמציות חומצה ניתן להשתמש באופן מיידי עבור בדיקת צבע או קפוא ב -20 °C (50 °F) לשימוש מאוחר יותר. להפשיר לחלוטין דגימות קפואות לטמפרטורת החדר מערבולת אותם לפני השימוש.</li>
</ol>4. פיתוח צבע
<ol><li>הכן תגובות כרומוגניות כפי שצוין בטבלה 2 בצינורות microcentrifuge 1.5 מ"ל או, עבור תפוקה גבוהה יותר, ישירות לתוך החלק התחתון השטוח, 96-well, ברור, ברור, מיקרופלסטין פוליסטירן מטופל. הכן את כל התגובות (חומצה ריקה, סטנדרטית ודגימה) לפחות בכפילות.</li>
	<li>יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.</li>
</ol>5. קריאת ספיגה
<ol><li>מדוד ספיגת מדגם בספקטרופוטומטר או קורא לוחות באורך גל של 535 ננומטר כנגד הפניה למים שעברו דה-יוניזציה. ניתן לקרוא צלחות ללא החלקה או מכסה. במקרה המכסה, להסיר כל עיבוי שנוצר עקב שחרורו של אדי חומצה מהמכסה רק לפני המדידה, כדי למנוע הפרעה אפשרית עם קריאת הספיגה. הערה: הספיגה האופטית של חומצה ריקה לקרוא נגד מים deionized (הפניה) צריך להיות פחות מ 0.015; הספיגה האופטית של התקן והדגימות צריכה להיות בין 0.100 ל -1.000. עבור דגימות עם תכולת ברזל גבוהה מאוד או נמוכה מאוד, הנפחים של תמצית חומצה (supernatant) ו diH2O ייתכן שיהיה צורך להתאים (טבלה 2): אם הספיגה גדולה מ 1.0, להשתמש מדגם קטן יותר (supernatant) נפח; כאשר הספיגה נמוכה מ- 0.1, השתמש בנפח גבוה יותר של supernatant. נפח מדגם (VSmp) נלקח בחשבון בעת חישוב תוכן ברזל הרקמה של כל דגימה (ראה שלב 6).</li>
</ol>6. חישוב תכולת ברזל רקמות
<ol><li>חשב תוכן ברזל רקמות שאינו heme עם המשוואה הבאה: ברזל רקמות (מיקרוגרם / גרם רקמה יבשה) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63469/63469eq01v2.jpg"> AT = ספיגה של מדגם בדיקה AB = ספיגה של חומצה ריקה AS = ספיגה של תקן Fes = ריכוז ברזל של WISS (מיקרוגרם Fe /mL) W = משקל של רקמה יבשה (g) Vsmp = נפח מדגם (נפח משתנה של Supernatant בטבלה 2 מומר ל- mL) Vf = נפח סופי של תערובת חומצה לאחר דגירה לילית ב 65 °C (המקביל נפח חומצה בתוספת נפח רקמות יבשות ב- mL; אם משקלים מדגם אינם שונים באופן משמעותי, להניח נפח קבוע ≈ 1 מ"ל) Vstd = נפח סטנדרטי מברזל (נפח WISS בטבלה 2 מומר ל- mL) Vrv = נפח תגובה סופי (נפח כולל בטבלה 2 מומר ל- mL)</li>
</ol>

<ol><li>Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red+carpet+for+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A red carpet for iron metabolism.</a> Cell. 168, 344-361 (2017).</li>
<li>Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepcidin+and+anemia%3A+A+tight+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hepcidin and anemia: A tight relationship.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1294(2019).</li>
<li>Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anemia+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Anemia of inflammation.</a> Blood. 133 (1), 40-50 (2019).</li>
<li>Altamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+iron+homeostasis%3A+Lessons+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models.</a> Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872(2020).</li>
<li>Torrance, J. D., Bothwell, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+measuring+storage+iron+concentrations+in+formalinised+liver+samples%5BTitle%5D)+AND+%22South+African+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples.</a> South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).</li>
<li>Torrence, J. D., Bothwell, T. H. Tissue iron stores. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTorrence%2C+JD+%22Methods+in+Haematology%22">Methods in Haematology</a>. Cook, J. D. , Churchill Livingston Press. New York. 104-109 (1980).</li>
<li>Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microanalysis+of+non-heme+iron+in+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Microanalysis of non-heme iron in animal tissues.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).</li>
<li>Lesbordes-Brion, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+hepcidin+1+gene+results+in+severe+hemochromatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis.</a> Blood. 108, 1402-1405 (2006).</li>
<li>Jumbo-Lucioni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+genetics+analysis+of+body+weight+and+energy+metabolism+traits+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster.</a> BMC Genomics. 11, 297(2010).</li>
<li>Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+Absorption+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Iron Absorption in Drosophila melanogaster.</a> Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).</li>
<li>Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+non-heme+iron+assay+for+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput non-heme iron assay for animal tissues.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).</li>
<li>Adrian, W. J., Stevens, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wet+versus+dry+weights+for+heavy+metal+toxicity+determinations+in+duck+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver.</a> Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים.

פרוטוקול למדידת תכולת הברזל שאינה heme ברקמות בעלי חיים מסופק, באמצעות התאמה של בדיקת צבע מבוססת bathophenanthroline שתואר במקור על ידי טורנס ו Bothwell5,6. השלבים הקריטיים של השיטה הם ייבוש דגימת רקמות; denaturation חלבון ושחרור של ברזל אנאורגני על ידי הידרוליזה חומצה; הפחתה של ברזל ברזל (Fe3 +) למצב ברזלי (Fe2 +) בנוכחות חומצה תיוגליקולית סוכן הפחתת, ואת התגובה שלה עם ריאגנט bathophenanthroline (תגובת כרומוגן); קריאת ספיגה של יון ברזלי וכת...

ברזל הוא מיקרונוטריאנט חיוני, הנדרש לתפקוד חלבונים המעורבים בתהליכים ביולוגיים חיוניים כגון הובלת חמצן, ייצור אנרגיה או סינתזת DNA. חשוב לציין, הן עודף ברזל והן מחסור בברזל מזיקים מאוד לבריאות האדם, ורמות הברזל של הרקמות מוסדרות היטב. ספיגת ברזל תזונתית חריגה, דיאטות לקויות ברזל, עירויי דם חוזרים ונשנים ודלקת כרונית הם גורמים נפוצים להפרעות הקשורות לברזל המשפיעות על מיליארדי אנשים ברחבי העולם1,2,3.
מודלים בעלי חיים ניסיוניים של עומס יתר בברזל או מחסור היו אינסטרומנטליים כדי לקדם את הידע שלנו על המנגנונים המעורבים ברגולציה המערכתית והתאית של הומאוסטזיס ברזל4. למרות ההתקדמות המשמעותית שחלה בשני העשורים האחרונים, היבטים מרכזיים רבים נותרו חמקמקים. בשנים הקרובות, המדידה המדויקת של רמות הברזל הכוללות ברקמות בעלי חיים תישאר צעד קריטי לקידום המחקר בתחום הביולוגיה של הברזל.
רוב המעבדות מכמתות ברזל רקמה עם ספקטרוסקופיית ספיגה אטומית (AAS), ספקטרומטר מסה פלזמה מצמידה אינדוקטיבית (ICP-MS), או בדיקה צבעונית המבוססת על התגובה של ברזל שאינו heme עם ריאגנט רחצה-אנתרופתרולין. זה האחרון מבוסס על השיטה המקורית שתוארה על ידי טורנס ובותוול לפני יותר מ -50 שנה. בעוד וריאציה של שיטה זו פותחה לאחר מכן באמצעות פרוזין כחלופה bathophenanthroline7, האחרון נשאר ריאגנט הכרומוגני הנפוץ ביותר בספרות.
שיטת הבחירה תלויה לעתים קרובות במומחיות ובתשתית הזמינה. בעוד AAS ו- ICP-MS רגישים יותר, הבדיקה הצבעונית נשארת בשימוש נרחב מכיוון שהיא מציגה את היתרונות החשובים הבאים: i) היא אינה כוללת את תרומתו של ברזל heme הנגזר מהמוגלובין הכלול בתאי דם אדומים; ii) זה לא דורש מיומנויות אנליטיות מתוחכמות או ציוד יקר מאוד; ו-iii) ניתן להתאים את הבדיקה המקורית המבוססת על קוביט לפורמט מיקרו-לוחית, המאפשר תפוקת מדגם גבוהה יותר. הגישה הצבעונית המוצגת בעבודה זו משמשת באופן שגרתי לכימות שינויים ברמות הברזל של הרקמה שאינה heme במגוון מודלים ניסיוניים של בעלי חיים של עומס יתר בברזל או מחסור בברזל, מכרסמים לדגים ולעוף פירות. כאן, פרוטוקול למדידת התוכן ברזל שאינו heme ברקמות בעלי חיים מסופק, באמצעות בדיקה פשוטה, מבוססת היטב, צבעונית כי רוב המעבדות צריך למצוא קל ליישם.

<table><tbody><tr><td>96 באר UV צלחת שקופה</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>איזון אנליטי</td><td>קרן</td><td>ABJ 220-4M</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט נטול מים</td><td>Merck</td><td>106268</td><td></td></tr><tr><td>Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1375</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 עכברים (Mus musculus)</td> מעבדות <td></td><td></td><td>צ'ארלס ריבר</td></tr><tr><td>אבקת ברזל קרבוניל, &ge; 99.5%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>44890</td><td></td></tr><tr><td>קובטות חד פעמיות בפולימתיל מתקרילט (PMMA)</td> <td>VWR</td><td>634-0678P</td><td></td></tr><tr><td>מים סטריליים מזוקקים כפולים</td><td>B. Braun</td><td>0082479E</td><td></td></tr><tr><td>קורא מיקרו-פלטות פלואורסצנטיות</td><td>BioTek Instruments</td><td>FLx800</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית, 37%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>תנור עיכול מיקרוגל וכוסות טפלון לבן</td><td>CEM</td><td>MDS-2000</td><td></td></tr><tr><td>חומצה חנקתית</td><td>פישר</td><td>15687290</td><td></td></tr><tr><td>מדעי תנור</td><td>קלסר</td><td>ED115</td><td></td></tr><tr><td>צ'או מכרסמים</td><td>Harlan Laboratories</td><td>2014S</td><td>Teklad Global 14% חלבון דיאטת תחזוקת מכרסמים המכילה 175 מ"ג/ק"ג ברזל</td></tr><tr><td>בס ים (Dicentrarchus labrax)</td><td>Sonrionansa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>הזנת בס ים</td><td>Skretting</td><td>L-2 Alterna 1P</td><td></td></tr><tr><td>קרן אחת ספקטרופוטומטר UV-Vis</td><td>Shimadzu</td><td>UV mini 1240</td><td></td></tr><tr><td>חומצה תיוגליקולית</td><td>Merck</td><td>100700</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טריכלורואצטית</td><td>Merck</td><td>100807</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידה של תוכן ברזל רקמות שאינן heme באמצעות בדיקת צבע מבוססת bathophenanthroline

Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay

ברזל הוא מיקרו-תזונה חיונית. הן עומס יתר בברזל והן מחסור מזיקים מאוד לבני אדם, ורמות הברזל של הרקמות מוסדרות היטב. השימוש במודלים ניסיוניים של בעלי חיים של עומס יתר או מחסור בברזל היה אינסטרומנטלי לקידום הידע של המנגנונים המעורבים בוויסות המערכתי והתאי של הומאוסטזיס ברזל. המדידה של רמות הברזל הכוללות ברקמות בעלי חיים מבוצעת בדרך כלל עם ספקטרוסקופיית ספיגה אטומית או עם בדיקה צבעונית המבוססת על התגובה של ברזל שאינו heme עם ריאגנט bathophenanthroline. במשך שנים רבות, הבדיקה הצבעונית שימשה למדידת תכולת הברזל שאינה heme במגוון רחב של רקמות בעלי חיים. שלא כמו ספקטרוסקופיית ספיגה אטומית, זה לא כולל את התרומה של ברזל heme נגזר המוגלובין הכלול בתאי דם אדומים. יתר על כן, זה לא דורש מיומנויות אנליטיות מתוחכמות או ציוד יקר מאוד, ולכן ניתן ליישם בקלות ברוב המעבדות. לבסוף, הבדיקה הצבעונית יכולה להיות מבוססת קוביט או מותאמת לתבנית מיקרו-לוחית, המאפשרת תפוקת דגימה גבוהה יותר. העבודה הנוכחית מספקת פרוטוקול מבוסס היטב המתאים לגילוי שינויים ברמות הברזל ברקמות במגוון מודלים ניסיוניים של בעלי חיים של עומס יתר בברזל או מחסור בברזל.

קובט לעומת השוואת מיקרו-לוחית של 96 well המדידה של רקמה שאינה ברזל heme על ידי תגובה עם ריאגנט bathophenanthroline שתואר במקור על ידי טורנס ו Bothwell5,6 מסתמך על השימוש ספקטרופוטומטר לקריאת ספיגה. לפיכך, הנפחים המועסקים בתגובת הכרומוגן תואמים לגודל של קובט ספקטרופוטומטר רגיל. העבודה הנוכחית מתארת הסתגלות לשיטה שבה תגובות הכרומוגן מוכנות ישירות במיקרו-לוחית של 96 באר למדידת ספיגה בקורא מיקרופלט, הדורשת נפחי ריאגנט קטנים יותר ומאפשרת תפוקה גבוה...

כאן, פרוטוקול למדידת התוכן ברזל שאינו heme ברקמות בעלי חיים מסופק, באמצעות בדיקה צבעונית פשוטה ומבוססת היטב שניתן ליישם בקלות ברוב המעבדות.

מדידה של תוכן ברזל רקמות שאינן Heme באמצעות בדיקת צבע מבוססת Bathophenanthroline

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The ...

כאן סיפקנו פרוטוקול למדידת התוכן שאינו Heme ברקמות בעלי חיים. באמצעות בדיקה צבעונית פשוטה ומבוססת שניתן ליישם בקלות ברוב המעבדות. ה-Bathophenanthroline מבוסס Colorimetric Assay אינו דורש מיומנויות מתוחכמות או ציוד יקר מאוד וניתן להתאים אותו לפורמט מיקרו-לוחית לתפוקת מדגם גבוהה יותר ויעילות עלות.פרוטוקול זה מתאים לגילוי שינויים ברמות הברזל ברקמות במגוון מודלים ניסיוניים של בעלי חיים של עומסי ברזל או יעילות ברזל. התחל על ידי חיתוך דגימת רקמה במשקל 10 עד 100 גרם עם להב אזמל. שקול את זה במדויק באיזון אנליטי על חתיכה קטנה של parafilm.השתמש פינצטה פלסטיק למקם את חתיכת הרקמה בצלחת 24 באר. תן לו להתייבש על אינקובטור סטנדרטי ב 65 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. לחלופין, מניחים את חתיכת הרקמה באמצעות פינצטה מקל בכוס טפלון ללא ברזל ומייבשים אותה בתנור העיכול של מיקרוגל המעבדה.מניחים כל פיסת רקמה מיובשת על פיסת פרפורם קטנה בתוך איזון אנליטי ושוקלים אותה במדויק. מעבירים כל פיסת רקמה מיובשת לצינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר. מוסיפים ליטר מתערובת החומצה לצינור וסוגרים אותו.הכן חומצה ריקה באותו אופן אלא שהרקמה מושמטת כאן. לדגור את הצינורות ב 65 מעלות צלזיוס במשך 20 שעות כדי לעכל את הרקמה. לאחר הקירור לטמפרטורת החדר השתמש במיקרו פיפטה המצוידת בעצות פלסטיק כדי להעביר 500 מיקרוליטרים של תמצית החומצה הברורה לצינור צנטריפוגה מיקרו חדש של 1.5 מיליליטר.הכן תגובות כרומוגן ישירות לתוך התחתון השטוח 96-well, ברור פוליסטירן מיקרו לוחות מיקרו מטופלים. טמפרטורת חדר דגירה במשך 15 דקות. מדוד ספיגת מדגם בקורא לוחות באורך גל של 535 ננומטר כנגד התייחסות למים שעברו דה-יוניזציה.קביעה של ברזל שאינו heme על ידי cuvette ו 96-well microplate מבוסס בדיקות צבעוניות מוצגות כאן. המתאם בין רמות ברזל מבוססות cuvette ומיקרו צלחת המבוססת על חצי ליטר ב -55 דגימות רקמה משחור זכר בן שישה חודשים, שישה עכברים, כולל כבד, טחול, לב, ריאות ומח עצם מוצגים כאן. המתאם הגבוה בין שתי המתודולוגיות מציין כי השיטה המבוססת על צלחת מיקרו היא חלופה חוקית לשיטה המקורית המבוססת על קובט.לבסוף, רמות ברזל שאינן heme היו מכמתים בשיטה המבוססת על צלחת מיקרו לאחר עיכול חומצי של מדגם נגזר מאותן רקמות עם תערובת של חומצה הידרוכלורית וחומצה טריכלורואצטית או חומצה הידרוכלורית בלבד. המתאם הגבוה מראה כי חומצה טריכלורואצטית יכולה להיפלט מעיכול החומצה. התמונה הייצוגית מציגה את רמות הברזל שאינן heme בכבד, בטחול, בלב ובלבלב של עכברי בר שחורים זכרים שישה עכברי בר ועכברי נוקאאוט hepcidin זכר על רקע גנטי שש שחור נמדד עם בדיקת צבע מבוסס Bathophenanthroline.ההפרעה של hepcidin מוביל hemochromatosis כמו פנוטיפ תצהיר ברזל עם כבד חמור, הצטברות ברזל הלבלב והלב דלדול ברזל טחול. רמות ברזל כבדיות שאינן heme בבס ים אירופאי נקבה לנוער בעקבות אפנון ברזל ניסיוני מוצגים כאן. רמות הברזל בכבד עלו באופן מאסיבי בבעלי חיים שטופלו בברזל.בעוד אנמיה גרמה לירידה קלה בחנויות הברזל בכבד. התמונות הייצוגיות מראות את רמות הברזל שאינן heme ב Drosophila בן חודש אחד נמדד עם בדיקת צבע מבוסס Bathophenanthroline. התוצאות מראות את תכולת הברזל שאינה heme בכל בריכה של 20 זבובים או את תכולת הברזל המשוערת של כל זבוב.בהתחשב במשקל ממוצע של 0.64 מיליגרם לזבוב. בעת ניסיון הליך זה יש לזכור לנקות ביסודיות את כל בלאי הזכוכית ולא לאפשר לחומרי המעבדה המתכתיים לבוא במגע עם כל ריאגנט או פתרון בשל הסיכון לזיהום.

measurement-tissue-non-heme-iron-content-using-bathophenanthroline

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

בסרטון זה, אנו מתארים שיטה מבוססת קולורימטריה לקביעת תכולת ברזל שאינה הם ברקמת כבד עכבר. Bathophenanthroline sulfonate משמש כמצע כרומוגני בנוכחות סוכן חיזור, אשר ממיר ברזל ברזל ברזל ברזל chelatable.

בדיקת Colorimetric מבוססת Bathophenanthroline Sulfonate: שיטה פשוטה ומהירה לכימות ברזל שאינו הם ברקמת כבד עכבר

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה להערכת זמינות ביולוגית של ברזל במקורות מזון מורכבים. הטכניקה משלבת סימולציה של עיכול אנושי יחד עם ספיגת ברזל על ידי תאי Caco-2 ממוינים. היווצרות פריטין תוך תאי פועלת כסמן לספיגת ברזל תאי.

Caco-2 cell bioassay: שיטה חוץ גופית למדידת זמינות ביולוגית של ברזל במקורות מזון מורכבים

רמות heme תוך-תאיות משתנות קשורות למחלות נפוצות כגון סרטן. לפיכך, יש צורך למדוד את רמות הביוסינתזה של הם בתאים מגוונים. מטרת פרוטוקול זה היא לספק שיטה מהירה ורגישה למדידה והשוואה של רמות סינתזת הם בתאים שונים.

מדידה של רמות הרן סינתזה בתאי יונקים

אנו מציגים פרוטוקול פשוטה ואמינה למדידת תוכן ברזל ברקמות הצמח באמצעות השיטה כחול פרוסי ערכי צבע מוחלטים.

שיטה ערכי צבע מוחלטים למדידת תכולת ברזל צמחים

אנו מציגים שיטת כימות קלה של מתכות הציגו דגימות שהוכנו באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה מתכת ללא קיבוע. השיטה משתמשת הידרוקסילנול כחול מחוון הצבע מתכת וספקטרוסקופיה UV-Vis כמו הגלאי.

קוונפיקציה של מתכת Leaching ב קיבוע מתכת זיקה כרומטוגרפיה

שיטת הדגימה של רדוקס ברזל מבוססת על ספקטרומטריה של מסת פלזמה בשילוב עם דגימה בשילוב עם ניתוח קצר בריצה אחת. השיטה מנתחת במהירות ומספקת מגבלות נמוכות של כימות עבור מיני רדוקס ברזל על פני מגוון רחב של רקמות ודגימות נוזל ביולוגי.

התקנה של ספקטרומטריה של מסת פלזמה (CE-ICP-MS) לכמת את מיני ברזל רדוקס (Fe(II), Fe(III)

מאמר זה מדגים כיצד להכין ולנהל ברזל איזוטופי לא-רדיואקטיבי הקשור לטרנספרין למחקרים על הובלת ברזל בהריון עכבר. כמו כן מתוארת הגישה לכימות ברזל איזוטופי בתאי fetoplacental.

הובלת ברזל כמותית על פני שליבת העכבר In Vivo באמצעות איזוטופים של ברזל לא רדיואקטיבי

הבדיקה הביולוגית של תאי Caco-2 לזמינות ביולוגית של ברזל (Fe) מייצגת גישה חסכונית ורב-תכליתית להערכת הזמינות הביולוגית של Fe ממזונות, מוצרי מזון, תוספי מזון, ארוחות ואפילו משטרי תזונה. הוא מאומת ביסודיות למחקרים בבני אדם, ומייצג את מצב האמנות למחקרים על זמינות ביולוגית של Fe.

הבדיקה הביולוגית של תאי Caco-2 למדידת זמינות ביולוגית של ברזל במזון

אנו מתארים בדיקה פלואורסצנטית שיכולה לאשר במהירות ובזול את היכולת של תרכובות חדשות לכלאט ברזל. הבדיקה מודדת את יכולתן של תרכובות להתחרות בפעילות קשירת הברזל של הגשושית הפלואורסצנטית החלשה Calcein, וכתוצאה מכך עלייה ניתנת לכימות בפלואורסצנטיות כאשר מתרחשת כלציה.

שיטה פלואורסצנטית ניתנת לכימות וזולה ללא תאים כדי לאשר את היכולת של תרכובות חדשות לכלאט ברזל 

פרוטוקול זה מציג שיטות להערכת התפלגות וכמות שקיעת הברזל ברקמות, במיוחד במוח. הפרוטוקול מפרט את הנהלים להכנת דגימה, צביעת Perls/DAB, לכידת תמונה וניתוח נתונים.

הערכת שקיעת ברזל במוחם של עכברי 5xFAD על ידי צביעת Perls/DAB

עבודה זו דנה בפרוטוקול לתכנון ופיתוח מכשיר E-Eye-Enable POCT לזיהוי Fe, Cr, As ו-F בדגימות סביבתיות, דגימות ביולוגיות ומזון ומשקאות. כמעט 2000 דגימות נבדקו, והתוצאות תואמות את טכניקת תקן הזהב.

טכניקת חישת עין אלקטרונית מתקדמת מונחית TD-DFT לכימות באתר של Fe, Cr, F ו-AS בדגימות סביבתיות, ביולוגיות ומזון

למדו למדוד תוכן ברזל שאינו הם ברקמות בעלי חיים באמצעות בדיקת צבע מבוססת Bathophenanthroline. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח בקיבול גבוה וחקר מטבוליזם הברזל במודלים ניסויים שונים.

מדידה של תוכן ברזל רקמות שאינן Heme באמצעות בדיקת צבע מבוססת Bathophenanthroline

גלה סרטונים נוספים