バソフェナントロリンベースの比色アッセイを用いた組織非ヘム鉄含有量の測定

ここでは、動物組織中の非ヘム含有量を測定するためのプロトコールを提供した。ほとんどの研究室で簡単に実装できるシンプルで確立された比色アッセイを使用します。バソフェナントロリンベースの比色アッセイは、高度なスキルや非常に高価な装置を必要とせず、マイクロプレート形式に適合させてサンプルスループットと費用対効果を高めることができます。

このプロトコルは、鉄過負荷または鉄効率の様々な実験動物モデルにおける組織鉄レベルの変化を検出するのに適している。メスの刃で10〜100グラムの重さの組織サンプルを切ることから始めます。パラフィルムの小さな部分の上に分析天秤で正確に計量してください。

プラスチックピンセットを使用して、組織片を24ウェルプレートに配置します。65°Cの標準的なインキュベーターで48時間乾燥させます。あるいは、スティックピンセットを使用してウェイド組織片を鉄を含まないテフロンカップに入れ、実験室の電子レンジ消化オーブンで乾燥させる。

各乾燥した組織片を分析天秤内のパラフォームの小さな部分の上に置き、正確に計量します。各乾燥組織片を1.5ミリリットルのマイクロ遠心管に移す。酸混合物の照明をチューブに追加し、それを閉じる。

ここで組織を省略した以外は同様にして酸ブランクを作製した。チューブを摂氏65度で20時間インキュベートして組織を消化する。室温まで冷却した後、プラスチックチップを取り付けたマイクロピペットを使用して、500マイクロリットルの透明酸抽出物を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心管に移した。

色原体反応を平底96ウェルの透明な未処理ポリスチレンマイクロプレートに直接調製する。室温で15分間インキュベートした。サンプル吸光度をプレートリーダーで波長535ナノメートルで脱イオン水基準に対して測定します。

キュベットおよび96ウェルマイクロプレートベースの比色アッセイによる非ヘム鉄の決定がここに示されている。生後6ヶ月の雄の黒人、肝臓、脾臓、心臓、肺および骨髄を含む6匹のマウスからの55の組織サンプルにおけるキュベットベースのおよびマイクロプレートベースの非ヘム鉄レベルとの間の相関をここに示す。2つの方法論間の高い相関関係は、マイクロプレートベースの方法が元のキュベットベースの方法の有効な代替手段であることを示しています。

最後に、非ヘム鉄レベルを、塩酸とトリクロロ酢酸の混合物または塩酸単独のいずれかを用いて同じ組織に由来する試料を酸性消化した後、マイクロプレートベースの方法で定量した。高い相関関係は、トリクロロ酢酸が酸消化から放出され得ることを示している。代表的な画像は、バソフェナントロリンベースの比色アッセイで測定された黒6匹の遺伝的背景上の雄の黒6匹野生型マウスおよび雄ヘプシジンノックアウトマウスの肝臓、脾臓、心臓および膵臓における非ヘム鉄レベルを示す。

ヘプシジンの破壊は、重度の肝臓、膵臓および心臓の鉄蓄積および脾臓鉄枯渇を伴う鉄沈着表現型のようなヘモクロマトーシスをもたらす。実験的な鉄変調に続く幼い雌のヨーロッパスズキにおける肝臓非ヘム鉄レベルがここに示されている。肝臓の鉄レベルは、鉄処理された動物において大幅に増加した。

一方、貧血は肝臓の鉄貯蔵に軽度の減少を引き起こした。代表的な画像は、バソフェナントロリンベースの比色アッセイで測定された生後1ヶ月のショウジョウバエの非ヘム鉄レベルを示す。結果は、20匹のハエの各プールにおける非ヘム鉄含有量または各ハエの推定鉄含有量を示す。

フライあたり0.64ミリグラムの平均重量を考慮すると。この手順を試みている間は、すべてのガラスの摩耗を完全にきれいにし、汚染の危険性があるため、金属実験材料が試薬または溶液と接触しないようにすることを忘れないでください。