Name: 질량 분광법에 앞서 강력한 프로테옴 정제를 위한 유기 용매 기반 단백질 침전 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 배우세요 유기 용매 기반 단백질 침전법을 활용한 질량 분광법 전 프로테옴 정제 기술입니다. 빠른 수행 시간과 높은 회수율로 단백질 샘플 준비의 효율성을 극대화합니다.

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이 연구는 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회 (Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada)가 자금을 지원했습니다. 저자들은 MS 데이터 수집에 기여한 Bioinformatics Solutions Inc. (캐나다 워털루)와 SPARC BioCentre (Molecular Analysis)에게 아픈 어린이 병원 (캐나다 토론토)에 감사드립니다.

1. 재료 고려 사항 및 샘플 사전 준비
<ol><li>과도한 수분이없는 고순도 용매 (아세톤, 클로로포름, 메탄올) (>99.5 %)와 화학 물질 만 사용하십시오.</li>
	<li>물에 염화나트륨과 황산아연 용액 (1 M)을 준비하십시오. 참고: 소금 용액은 오염물질이나 미생물 성장이 없는 한 실온에서 무기한으로 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>침전을 유도하기 위해 필요한 부피의 샘플 및 용매를 보유하기에 충분한 가장 작은 폴리프로필렌(PP) 마이크로원심분리 바이알을 사용하십시오.</li>
	<li>침전될 샘플의 SDS 농도가 2%(w/v)를 넘지 않는지 확인하십시오. SDS가 더 높으면 샘플을 물로 희석하십시오.</li>
	<li>최적의 침전 효율을 위해 단백질 농도를 0.01 ~ 10 g/L 사이로 유지하십시오. 참고: 침전에 대한 최적의 질량은 단백질의 1-100 μg 사이입니다.</li>
	<li>사용하기 전에 모든 용매와 용액에 미립자 물질이 없는지 확인하십시오. 여과 (<0.5 μm) 또는 원심분리 단계 (실온에서 1 분 동안 10,000 x g )를 수행하여 용해되지 않은 미립자를 제거하십시오.</li>
	<li>디술피드 결합 환원 및 알킬화가 필요한 경우, 단백질 침전 전에 이러한 단계를 수행하십시오. 과량의 환원 및 알킬화 시약은 침전 과정을 통해 제거될 것이다.</li>
	<li>프로토콜 중 하나를 선택하고 수행하여 단백질을 침전시킨다(단계 2, 3, 4, 또는 5).</li>
</ol>2. 아세톤을 이용한 신속한 (바이알 기반) 단백질 침전
<ol><li>90 μL의 (미립자 프리) 단백질 또는 프로테옴 용액을 PP 마이크로원심분리 튜브에 피펫팅한다. 이어서, 10 μL의 1 M 수성 NaCl을 첨가한다. 참고: 프로테옴 추출물의 이온 강도가 이미 100mM을 초과하는 경우, 추가적인 염은 필요하지 않습니다.</li>
	<li>아세톤 400 μL를 피펫팅하여 시료에 넣었다. 바이알을 캡하고 바이알을 부드럽게 두드려 용매를 결합합니다. 격렬한 혼합은 필요하지 않습니다. 참고 : 단백질, 소금 및 아세톤의 부피는 각각의 상대 비율이 유지되는 한 증가 할 수 있습니다.</li>
	<li>바이알을 최소 2 분 동안 방해받지 않고 실온에서 배양하도록하십시오. 참고: 감소된 온도에서의 것들을 포함하는 더 긴 인큐베이션(예를 들어, 종래의 아세톤 침전은 냉동실에서 하룻밤 침전을 이용함), 더 큰(가시적인) 응집된 단백질 미립자의 형성을 초래할 수 있으며(도 1A), 이는 일반적으로 총 단백질 회수를 개선하지 않는다.</li>
	<li>인큐베이션 후, 샘플을 원심분리기에 넣고 바이알의 방향을 확인합니다. 실온에서 10,000 x g 이상에서 최소 2 분 동안 회전하십시오.</li>
	<li>바이알의 뚜껑을 풀고 바이알을 폐기물 용기에 천천히 뒤집어 상청액을 부드럽게 데시닝하십시오. 거꾸로 된 바이알을 종이 타월에 대고 바이알에서 잔류 용매를 뽑습니다. 주의: 폐기물 용제는 적절한 프로토콜에 따라 보관하고 폐기해야 합니다.</li>
	<li>SDS 함유 샘플의 경우, 400 μL의 신선한 아세톤을 분주하고, 펠렛을 방해하지 않도록 주의한다. 참고: 2.6단계는 선택 사항입니다.<ol><li>샘플을 즉시 원심분리하고(실온에서 1분 동안 10,000 x g 이상), 바이알을 초기 스핀과 동일한 배향의 로터 내로 위치시킨다. 세척 용매를 데칸트는 단계 2.5에 기재된 바와 같다.</li>
	</ol></li>
	<li>뚜껑을 연 상태에서 샘플을 완전히 말리십시오 (~ 1 분). 바이알을 요약하고 펠릿 가용화를 진행한다(단계 6).</li>
</ol>3. 저분자량(LMW) 펩타이드(ZnSO4 + 아세톤)의 침전
<ol><li>54 μL의 프로테옴 추출물을 2 mL PP 바이알에 분주하고, 이어서 6 μL의 1 MZnSO4를 첨가한다. 참고: LMW 펩티드 (≤5 kDa)의 최적 회수는 아세톤을 최종 97 부피%에 첨가함으로써 얻어진다. 2 mL PP 바이알을 가정하면, 최대 초기 샘플 부피는 54 μL이다.</li>
	<li>1940 μL의 아세톤을 최종 97 부피%에 첨가한다. 부드럽게 소용돌이 치며 섞어서 벤치 탑에 최소 2 분 동안 방해받지 않고 서있게하십시오.</li>
	<li>원심분리기(실온에서 1분 동안 10,000 x g )하고, 바이알을 뒤집고, 이어서 바이알을 종이 타월에 만짐으로써 상층액을 제거하였다.</li>
	<li>SDS 함유 샘플의 경우, 400 μL의 신선한 아세톤을 분주하고, 펠렛을 방해하지 않도록 주의한다. 참고: 3.4단계는 선택 사항입니다.<ol><li>단계 3.3에 따라 샘플을 즉시 원심분리하고, 바이알을 초기 스핀과 동일한 배향으로 로터 내로 배치한다. 세척 용매를 데칸트는 단계 3.3에 기재된 바와 같다.</li>
	</ol></li>
	<li>생성된 건조 펠렛을 간단한 볼텍싱 또는 초음파 처리 (~ 5 분)로 수성 용매에 다시 가용화하십시오.</li>
</ol>4. 클로로포름/메탄올/물 (CMW)에 의한 단백질 침전
<ol><li>단백질 또는 프로테옴 용액 100 μL를 PP 바이알에 분주한다. 메탄올 400 μL를 첨가하고, 이어서 클로로포름 100 μL를 첨가하였다. 바이알과 와류를 잠깐 섞어서 섞는다. 참고: CMW 강수량의 경우 바닥이 좁은 1.5mL 바이알이 선호됩니다(그림 2A). 주의: 클로로포름 용제는 적절한 환기 후드에서 취급해야 합니다. 클로로포름과 접촉하는 모든 용매는 폐기 시 할로겐화 폐기물로 취급되어야 합니다.</li>
	<li>300μL의 물을 바이알 중앙에 직접 빠르게 분주하십시오. 바이알을 뚜껑을 덮으십시오. 샘플이 1 분 동안 방해받지 않고 벤치 탑에 앉을 수 있도록하십시오. 참고: 솔루션은 즉시 흐린 흰색으로 나타납니다. 물을 첨가 한 후 바이알을 혼합하지 마십시오.</li>
	<li>PP 바이알을 원심분리기에 넣고 최소 5분 동안 회전시킨다(실온에서 10,000 x g 이상). 참고 : 원심분리되면 두 개의 보이는 용매 층이 형성됩니다 (최상층 = 메탄올 / 물, 하단 = 클로로포름). 고체 단백질 펠릿은 용매 계면에서 형성된다(도 2A).</li>
	<li>큰 (1 mL) 마이크로피펫 팁을 사용하여, 바이알을 ∼45°에서 유지하고, 균일한 속도로 상층으로부터 ∼700 μL의 용매를 제거하였다.</li>
	<li>더 작은(200μL) 마이크로피펫 팁을 사용하여 ~45° 기울어진 바이알에서 상부 용매층을 계속 제거한다. 상부 용매층이 바이알 내에 비드를 형성할 때까지 하나의 연속 운동으로 피펫.</li>
	<li>400 μL의 신선한 메탄올을 샘플 바이알에 첨가하고, 펠렛을 교란시키지 않고, 용매를 바이알의 측면 아래로 분주한다.</li>
	<li>바이알을 뚜껑을 덮으십시오. 바이알을 부드럽게 흔들어 용매를 함께 소용돌이 치면서 용매 층을 결합하십시오. 참고 : 펠릿을 방해하지 않도록하는 것이 중요합니다. 바이알을 와류하지 마십시오.</li>
	<li>로터에서 바이알의 배향을 주목하고, 최소 10 분 동안 원심 분리하십시오 (실온에서 10,000 x g ). 단백질 펠릿은 바이알의 바닥에 부착된다(도 2B).</li>
	<li>펠릿을 아래로 향하게 하여 바이알을 45°로 향하게 합니다. 바이알의 상단 가장자리를 따라 피펫 팁을 놓고 느리지만 연속적인 속도로 1 mL 마이크로피펫 팁으로 상청액을 제거한다. 바이알에 ~20 μL의 용매를 보관한다.</li>
	<li>SDS 함유 샘플에 대한 단백질 펠릿을 400 μL의 신선한 메탄올을 천천히 분주하여 세척한다. 바이알을 와류하지 마십시오.<ol><li>원심분리 (온도에서 2 분 동안 10,000 x g )로 직접 진행하고, 바이알을 초기 스핀과 동일한 배향으로 로터 내로 놓습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>단계 4.9에 따라 용매를 제거한다. 잔류 용매가 증발할 때까지 샘플을 흄후드에서 공기 건조시키도록 허용한다.</li>
	<li>6단계에서 권장하는 가용화 절차를 참조하십시오.</li>
</ol>5. 일회용 여과 카트리지를 사용한 단백질 침전
참고: 단계 2-5에 설명된 각 용매 기반 침전 프로토콜은 2단계 여과 및 추출 카트리지에서 수행될 수 있다( 표 참조).
<ol><li>상부 여과 카트리지에 플러그를 부착한 상태(도 3A)로, 아래의 세 가지 옵션 중 하나에 요약된 대로 추출된 프로테옴, 염 및 용매의 원하는 부피를 분배한다.<ol><li>(옵션 1) 아세톤을 사용한 단백질 침전을 위해, 90 μL의 단백질 또는 프로테옴 용액, 10 μL의 1 M 수성 NaCl 및 400 μL의 아세톤을 결합한다. 벤치 탑에서 최소 2 분 동안 배양하십시오. 참고: 농축된 단백질 샘플(1g/L)에 대해 가시적인 침전물이 발생합니다(그림 3B).</li>
		<li>(옵션 2) LMW 펩티드 침전을 위해, 15 μL의 샘플, 1.5 μL의 1 M ZnSO4, 및485 μL의 아세톤을 조합한다. 벤치 탑에서 최소 2 분 동안 배양하십시오. 참고: 수성 샘플에서 90mM의 염 농도는 단계 3에서 권장하는 100mM에 비해 회복에 영향을 미치지 않습니다.</li>
		<li>(옵션 3) CMW 침전을 위해, 50 μL의 프로테옴 추출물, 200 μL의 메탄올 및 50 μL의 클로로포름을 첨가한다. 바이알을 뚜껑을 덮고 간단히 와류하여 결합하십시오.<ol><li>150μL의 물을 바이알 중앙에 직접 빠르게 분주하십시오. 벤치 탑에서 1 분 동안 배양하십시오.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>플러그가 여과 카트리지에 여전히 부착된 상태에서 실온에서 2,500 x g 에서 2분 동안 원심분리한다.</li>
	<li>카트리지를 반전시킨 다음 나사를 풀고 카트리지 받침대에서 플러그를 분리합니다.</li>
	<li>여과 카트리지를 깨끗한 바이알에 넣고 원심분리기로 돌아갑니다. 실온에서 500 x g 에서 3 분 동안 회전하십시오. 유동 관통 용매를 하부 바이알에서 버리십시오. 참고: 상부 여과 카트리지에 용매가 남아 있으면 원심분리기로 돌아가서 추가 스핀을 수행하십시오.</li>
	<li>400 μL의 아세톤을 여과 카트리지에 첨가하여 단백질 펠릿을 세척한다(CMW 침전을 위해, 단계 5.1.3, 메탄올 400 μL를 첨가).</li>
	<li>실온에서 500 x g 에서 3분 동안 또는 상부 카트리지에 용매가 남아 있지 않을 때까지 원심분리한다.</li>
	<li>단계 6에 기재된 바와 같이 침전 펠릿을 재가용화한다.</li>
</ol>6. 단백질 펠릿의 재가용화
<ol><li>2-5 μL의 이소프로판올을 후술하는 재가용화 프로토콜 직전에 멤브레인에 직접 분주함으로써 여과 카트리지의 기저부에 멤브레인을 적셔라.</li>
	<li>다음 재가용화 방법 중 하나를 따르십시오.<ol><li>(옵션 1) ≥2% SDS를 함유하는 최소 20 μL의 수성 완충액을 여과 카트리지에 첨가한다. 뚜껑과 소용돌이가 격렬하게 (~ 1 분). 대안적으로, 초음파 처리 (>10 분)는 단백질 펠릿을 분산시킨다.<ol><li>샘플을 95°C에서 5분 동안 가열한다). 가열 후 혼합 단계를 반복하십시오. 참고: Laemmli 겔 로딩 완충액은 단백질 펠릿을 재가용화할 수 있다. 그러나, SDS 함유 샘플은 트립신 소화 및 역상 LC 및 MS와 양립할 수 없다.</li>
		</ol></li>
		<li>(옵션 2) 물에 80 % (v / v) 포름산 용액을 준비하십시오. 산 용액(-20°C)을 예냉하고, 침전된 단백질을 함유하는 여과 카트리지를 포함한다.<ol><li>50 μL의 차가운 포름산을 카트리지에 분배하십시오; 캡과 와류는 30 초입니다. 10분 동안 냉동고(-20°C)로 복귀시킨다.</li>
			<li>카트리지를 30초 동안 다시 소용돌이치십시오. 이어서, 냉장 및 혼합 사이클을 한 번 더 반복한다(10분, -20°C, 30s 와류).</li>
			<li>최종 500 μL에 물을 첨가하고, 포름산을 8%로 희석한다. 참고: 차가운 포름산 프로토콜은 후속 트립신 소화와 호환되지 않지만 LC-MS와 호환됩니다.</li>
		</ol></li>
		<li>(옵션 3) 물에 새로 준비된 8 M 요소 50 μL를 여과 카트리지에 첨가한다. 30 분 동안 초음파 처리.<ol><li>카트리지가 벤치탑에서 1시간 동안(최대 하룻밤까지) 인큐베이션되도록 합니다.</li>
			<li>8 M 우레아를 물 또는 적절한 완충액으로 최소 5 배 희석하십시오. 참고: 일단 희석되면, 우레아 가용화 프로토콜은 LC-MS뿐만 아니라 후속 트립신 소화와 호환된다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>7. 단백질 소화
<ol><li>상향식 MS 분석을 위해, 재가용화된 단백질을 효소적 소화를 위해 대상은 하기에 언급된 두 가지 방법 중 하나를 사용한다.<ol><li>(옵션 1) 포름산 재가용화를 위해, 단계에서 80% 포름산의 초기 부피를 6.2.2.1 내지 25 μL로 감소시킨다. 단계 6.2.2.3에서, 375 μL의 물을 사용하여 포름산을 5%(v/v)로 희석한다.</li>
		<li>펩신을 대략 단백질 대 효소 비율 50:1로 카트리지에 분배하십시오. 여과 카트리지에 플러그가 부착된 상태에서 샘플을 실온에서 밤새 인큐베이션한다.</li>
	</ol></li>
	<li>(옵션 2) 요소에서의 재가용화를 위해, 단계 6.2.3.2에서 100 mM의 트리스 또는 중탄산암모늄을 포함시켜 8과 8.3 사이의 pH를 보장한다.<ol><li>트립신을 단백질 대 효소 질량비 50:1의 대략적인 비율로 첨가하십시오. 카트리지에 플러그가 부착된 상태에서, 샘플을 37°C의 온수 욕조에서 밤새 인큐베이션한다.</li>
		<li>용액을 10% TFA로 최종 1%까지 산성화시켜 소화를 종료한다.</li>
	</ol></li>
	<li>필터의 베이스로부터 플러그를 제거하고 깨끗한 바이알 내에 포함된 카트리지를 원심분리하여 펩신- 또는 트립신-소화된 단백질을 회수한다(2분, 5000 x g, 실온).</li>
</ol>8. SPE 정리
참고: 소화 또는 용매 교환 후 추가적인 샘플 탈염의 경우, 샘플은 설명된 바와 같이 역상 클러업의 대상이 될 수 있다.
<ol><li>300 μL의 메탄올 (2 분, 400 x g)을 통과시켜 SPE 카트리지 (물질의 표 참조)를 프라임한 다음 300 μL의 5% 아세토니트릴 / 0.1 % TFA (2 분, 400 x g)를 첨가하였다.</li>
	<li>프라이밍된 SPE 카트리지를 재가용화 또는 소화된 단백질을 함유하는 여과 카트리지의 베이스에 연결한다.</li>
	<li>단백질을 SPE 카트리지를 통해 스핀한다(실온에서 5분, 800 x g ). 용매가 상부 카트리지에 남아 있으면 카트리지를 원심분리기로 되돌리고 스핀을 반복하십시오. 주: SPE 카트리지를 통해 샘플을 두 번 통과시키면 복구가 향상될 수 있습니다.</li>
	<li>물에 5% 아세토니트릴/0.1%의 TFA 300μL를 카트리지에 넣습니다. 세척하려면 SPE 카트리지를 통해 흐르십시오 (2 분, 2000 x g). 흐름 통과를 버립니다.</li>
	<li>LMW 단백질 또는 소화된 펩티드의 경우, 50% 아세토니트릴/0.1% TFA (5분, 2500 x g)의 300 μL를 흘려서 샘플을 용출시킨다.</li>
	<li>무손상 단백질의 경우, 75% 아세토니트릴/0.1% TFA의 300μL를 사용하는 추가 용출 단계와 함께 단계 8.5를 따르십시오. 두 개의 결과 추출물을 결합하십시오. 참고: 8.6단계는 선택 사항입니다.</li>
</ol>

Doucette 실험실은이 연구에 사용 된 ProTrap XG를 구상하고 특허를 취득했습니다. AAD는 또한 샘플 준비 카트리지를 상용화한 Proteoform Scientific의 창립 파트너이기도 합니다.

최적의 MS 특성화는 잔류 SDS가 10ppm 미만으로 고갈될 때 달성된다. FASP 및 온비드 소화와 같은 대안적인 접근법은 가변 회수31,32,33으로 정량적 SDS 고갈을 제공하지만, 침전의 주요 목적은 순도와 수율을 동시에 극대화하는 것입니다. 이는 단백질 펠릿을 방해하지 않고 상청액(SDS 함유)을 효과적으로 단리하는 것에 의존한다. 바이알 기반 침전의 경우, 일단 상청액의 대부분이 피펫팅에 의해 제거되면, 응집 된 펠릿 중 일부가 실수로 손실 될 가능성이 점점 커지고 있습니다. 이러한 이유로, 잔류 용매(∼20 μL)의 보다 중요한 분획을 뒤에 남겨두고 세척 단계(34)를 추가하는 것이 필수적이다. 세척 단계는 바이알로부터 잔류 용매를 희석하고 제거한다. 특히 CMW의 경우, 펠릿이 형성되면 샘플 바이알을 와류...

질량 분광법에 의한 프로테옴 분석은 현대 MS 기기의 향상된 감도, 해상도, 스캔 속도 및 다양성으로 인해 점점 더 엄격 해지고 있습니다. MS의 발전은 단백질 식별 효율을 높이고 1,2,3,4,5를 더 정밀하게 정량하는 데 기여합니다. 향상된 MS 계측을 통해 연구자들은 워크플로우 6,7,8,9,10,11의 모든 단계에서 최소한의 시간 내에 고순도 단백질을 정량적으로 회수할 수 있는 상응하는 일관된 프런트 엔드 샘플 준비 전략을 요구합니다. . 생물학적 시스템의 프로테옴 상태를 정확하게 반영하기 위해, 단백질은 효율적이고 편향되지 않은 방식으로 천연 샘플 매트릭스로부터 분리되어야 한다. 이를 위해, 소듐 도데실 설페이트(SDS)와 같은 변성 계면활성제를 포함하여, 효율적인 단백질 추출 및 가용화(12)를 보장한다. 그러나, SDS는 전기 분무 이온화를 강하게 방해하여, 적절하게 제거되지 않을 경우 심각한 MS 신호 억제를 야기한다(13).
다양한 SDS 고갈 전략이 일회용 스핀 카트리지14,15,16 내에 포함된 분자량 컷오프 필터 이상의 단백질의 보유와 같은 후속 프로테옴 분석을 위해 이용가능하다. 필터 지원 샘플 준비 방법(FASP)은 SDS를 10ppm 이하로 효과적으로 고갈시켜 최적의 MS를 용이하게 하기 때문에 선호됩니다. 그러나 FASP를 사용한 단백질 회수는 가변적이어서 다른 기술의 탐구를 촉발시켰다. 단백질(또는 계면활성제)을 선택적으로 포획하는 크로마토그래피 접근법은 다양한 편리한 카트리지 또는 비드 기반 포맷17,18,19,20,21로 진화했다. 단백질 정제에 대한 이러한 간단하고 (이상적으로) 일관된 전략을 감안할 때, 유기 용매를 사용한 단백질 침전의 고전적인 접근법은 종종 단백질 분리에 대한 유망한 접근법으로 간과됩니다. 용매 침전이 SDS를 임계 수준 이하로 성공적으로 고갈시키는 것으로 밝혀졌지만, 단백질 회수는 이러한 접근법의 오랜 관심사였습니다. 여러 그룹은 단백질 농도, 분자량 및 소수성22,23의 함수로서 용납 할 수 없을 정도로 낮은 침전 수율로 단백질 회수 편향을 관찰했습니다. 문헌에보고 된 강수 프로토콜의 다양성으로 인해 표준화 된 강수량 조건이 개발되었습니다. 2013 년 Crowell et al.은 80 % 아세톤24에서 단백질의 침전 효율에 대한 이온 강도의 의존성을 처음 보고했습니다. 조사된 모든 단백질에 대해, 최대 30 mM 염화나트륨의 첨가는 수율을 최대화하는데 필수적인 것으로 나타났다(최대 100% 회수). 보다 최근에, Nickerson et al.은 아세톤 침전 동안 더 높은 이온 강도 (최대 100 mM)와 상승 온도 (20 °C)의 조합이 2-5 분 25 분에 거의 정량적회복을 주었다는 것을 보여주었다. 저분자량(LMW) 단백질의 회수율에서 약간의 감소가 관찰되었다. 따라서, Baghalabadi et al.에 의한 후속 보고서는 특정 염, 특히 황산아연을 더 높은 수준의 유기 용매 (97 % 아세톤)와 결합시킴으로써 LMW 단백질 및 펩티드 (≤5 kDa)의 성공적인 회수를 입증했다.
침전 프로토콜을 정제하는 것은 MS 기반 프로테오믹스에 대해 보다 신뢰할 수 있는 단백질 정제 전략을 제공하지만, 기존의 침전의 성공은 사용자 기술에 크게 의존합니다. 이 연구의 주요 목표는 오염 상청액으로부터 단백질 펠릿의 분리를 용이하게하는 강력한 침전 전략을 제시하는 것입니다. 다공성 PTFE 멤브레인 필터(27) 위에 응집된 단백질을 분리함으로써 피펫팅을 제거하기 위해 일회용 여과 카트리지가 개발되었다. 상청액 내의 MS 간섭 성분은 짧고 저속 원심분리 단계에서 효과적으로 제거된다. 일회용 필터 카트리지는 또한 교체 가능한 SPE 카트리지를 제공하여 질량 분광법에 앞서 가용화 및 선택적 단백질 소화 후 후속 샘플 정리를 용이하게합니다.
변형된 아세톤 및 클로로포름/메탄올/물28 프로토콜을 포함한 일련의 권장 프로테옴 침전 워크플로우가 기존 (바이알 기반) 및 일회용 2 상태 여과 및 추출 카트리지의 반자동 형식으로 제공됩니다. 결과 단백질 회수 및 SDS 고갈 효율은 상향식 LC-MS/MS 프로테옴 커버리지와 함께 강조되어 각 프로토콜에서 예상되는 결과를 입증합니다. 각 접근법과 관련된 실질적인 이점과 단점이 논의됩니다.

<table><tbody><tr><td>아세톤</td><td>피셔 사이언티브</td><td>AC177170010</td><td>&le; 0.002% 알데히드</td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>피셔 사이언티브</td><td>A998-4</td><td>HPLC 등급</td></tr><tr><td>중탄산암모늄</td><td>밀리포어 시그마</td><td>A6141-1KG</td><td>고단하다</td></tr><tr><td>베타 머캅토에탄올</td><td>밀리포어 시그마</td><td>M3148-25ML</td><td>분자생물학 등급</td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>밀리포어 시그마</td><td>B8026-5G</td><td>브로모페놀 블루 나트륨 소금</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>피셔 사이언티브</td><td>C298-400</td><td>클로로포름</td></tr><tr><td>개미산</td><td>허니웰</td><td>56302</td><td>LC-MS용 용출물 첨가제</td></tr><tr><td>융합 루모스 질량분석기</td><td>서모피셔 사이언티픽</td><td></td><td>표준 단백질 혼합물 분석을 위해</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>밀리포어 시그마</td><td>356352-1L-M</td><td>분자생물학의 경우, > 99%</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>피셔 사이언티브</td><td>A4641</td><td>HPLC 등급</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔 사이언티브</td><td>A452SK-4</td><td>HPLC 등급</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>피셔 사이언티브</td><td>75-400-102</td><td>최대 21,000 xg</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브 (1.5 mL)</td><td>피셔 사이언티브</td><td>05-408-130</td><td>테이퍼드 바텀</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브 &nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; (2 mL)</td><td>피셔 사이언티브</td><td>02-681-321</td><td>둥근 바닥</td></tr><tr><td>마이크로피펫 팁&nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; (0.1-10 & mu; L)</td><td>피셔 사이언티브</td><td>21-197-28</td><td>범용 피펫 팁, 비멸균</td></tr><tr><td>마이크로피펫 팁&nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; (1-200 & mu; L)</td><td>피셔 사이언티브</td><td>07-200-302</td><td>범용 피펫 팁, 비멸균</td></tr><tr><td>마이크로피펫 팁&nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; (200-1000 & mu; L)</td><td>피셔 사이언티브</td><td>07-200-303</td><td>범용 피펫 팁, 비멸균</td></tr><tr><td>마이크로피펫</td><td>피셔 사이언티브</td><td>13-710-903</td><td>마이크로피펫 트리오 팩</td></tr><tr><td>펩신</td><td>밀리포어 시그마</td><td>P0525000</td><td>용하 분말, 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; >3200 단위/mg</td></tr><tr><td>프로트랩 XG</td><td>프로테오폼 사이언티픽</td><td>PXG-0002</td><td>박스당 50개의 완성된 유닛</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>밀리포어 시그마</td><td>S9888-1KG</td><td>ACS 시약, >99%</td></tr><tr><td>도데실 설페이트 나트륨</td><td>서모피셔 사이언티픽</td><td>28312</td><td>분말 고체</td></tr><tr><td>timsTOF 프로 질량분석기</td><td>브루커</td><td></td><td>간 단백질체 추출물 분석을 위해</td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산</td><td>서모피셔 사이언티픽</td><td>L06374. AP</td><td>99%</td></tr><tr><td>트리스</td><td>피셔 사이언티브</td><td>BP152-500</td><td>분자생물학 등급</td></tr><tr><td>트립신</td><td>밀리포어 시그마</td><td>9002-07-7</td><td>소 췌장에서 TPCK 처리를 거쳤습니다</td></tr><tr><td>요소</td><td>바이오-래드</td><td>1610731</td><td>고단하다</td></tr><tr><td>물(탈이온)</td><td>사토리우스 아리움 미니 정수 시스템</td><td>76307-662</td><td>타입 1 울트라퓨어 (18.2 M&Omega; cm)</td></tr><tr><td>아연 설페이트</td><td>밀리포어 시그마</td><td>307491-100G</td><td>고단하다</td></tr></tbody></table>

질량 분광법에 앞서 강력한 프로테옴 정제를 위한 유기 용매 기반 단백질 침전

Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

질량 분광법(MS) 장비의 여러 발전으로 정성 및 정량적 프로테옴 분석이 개선되었지만, MS보다 앞서 단백질을 분리, 농축 및 처리하기 위한 보다 신뢰할 수 있는 프런트 엔드 접근법은 성공적인 프로테옴 특성화를 위해 매우 중요합니다. 낮고 일관성 없는 단백질 회수 및 계면활성제와 같은 잔류 불순물은 MS 분석에 해롭다. 단백질 침전은 종종 다른 샘플 준비 전략에 비해 신뢰할 수 없고, 시간이 많이 걸리며, 기술적으로 수행하기가 어려운 것으로 간주됩니다. 이러한 우려는 최적의 단백질 침전 프로토콜을 사용하여 극복됩니다. 아세톤 침전의 경우 특정 염, 온도 조절, 용매 조성 및 침전 시간의 조합이 중요하지만 클로로포름 / 메탄올 / 물 침전의 효율은 적절한 피펫팅 및 바이알 조작에 달려 있습니다. 대안적으로, 이들 침전 프로토콜은 일회용 스핀 카트리지 내에서 간소화되고 반자동화된다. 용매 기반 단백질 침전의 예상된 결과를 통상적인 포맷으로 그리고 일회용, 이단계 여과 및 추출 카트리지를 사용하여 본 작업에 예시한다. 여기에는 상향식 LC-MS/MS 분석에 의한 프로테오믹 혼합물의 상세한 특성화가 포함됩니다. SDS 기반 워크플로우의 우수한 성능은 오염되지 않은 단백질에 비해 입증되었습니다.

도 4 는 아세톤을 사용하는 일회용 필터 카트리지에서 바이알 기반 또는 카트리지-촉진된 단백질 침전에 따른 예상되는 SDS 고갈을 요약한 것이다. 아세톤에서의 종래의 밤새 인큐베이션(-20°C)은 CMW 침전뿐만 아니라 실온에서 신속한 아세톤 침전 프로토콜(단계 2)과 비교된다(단계 4). 잔류 SDS는 메틸렌 블루 활성 물질(MBAS) 분석29에 의해 정량화되었다. 간략하게, 100 μL 샘플을 100 μL MBAS 시약 (메틸렌 블루 250 mg, 황산나트륨 50 g, 황산 10 mL, 물에 희석 1.0 L)과 합한 다음, 400 μL 클로로포름을 첨가하고 UV/Vis 분광광도계 상에서 651 nm에서 유기층의 흡광도를 측정하였다. 모든 접근법은 SDS를 줄여 최적의 MS 분석을 가능하게 합니다.
정량적 및 재현성 단백질 회수는 처리된 효모 총 세포 용해물의 SDS PAGE 분석을...

본 프로토콜은 질량 분광법 전에 프로테옴 샘플의 견고하고 신속한 회수 및 정제를 위한 조절된 조건 하에서의 용매-기반 단백질 침전을 기술한다.

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

이러한 프로토콜은 용매 기반 침전을 통해 단백질의 순도와 회수를 최대화하도록 설계되었습니다. 바이알에서 침전을 수행하는 몇 가지 트릭과 스핀 카트리지 형식의 반자동 접근 방식을 보여 드리겠습니다. 또한 강수량 프로토콜을 일관되고 빠르게 최적화했습니다.전체 프로토콜은 몇 분 밖에 걸리지 않습니다. 이러한 프로토콜은 단백질의 용매 침전이 질량분석법에 앞서 시료 전처리에 이상적임을 보여줍니다. 프로토콜은 상향식 및 하향식 프로 워크플로에 원활하게 맞습니다.오늘 우리를 위해 시연하는 것은 Ziheng Dang과 빅토리아 밀러, 노바 스코샤 핼리팩스에있는 Proteoform Scientific의 수석 과학자입니다 90 마이크로 리터의 미립자가없는 단백질 용액을 폴리 프로필렌 마이크로 원심 분리기 튜브에 넣습니다. 그런 다음 10마이크로리터의 1몰 염화나트륨 수용액과 400마이크로리터의 아세톤을 샘플 용액에 넣고 바이알을 덮고 가볍게 두드려 용매를 결합합니다. 바이알이 그것을 배양하도록하십시오.인큐베이션 후 최소 2분 동안 방해받지 않고 실온에서 바이알의 방향에 주목하는 샘플을 원심분리하고 실온에서 10, 000 RCF 이상에서 최소 2분 동안 스핀합니다. 원심 분리 후, 튜브의 바닥에서 눈에 보이는 흰색 펠릿이 관찰된다. 이 시점에서 튜브의 뚜껑을 풀고 튜브를 뒤집어 폐기물 용기에 상류품을 기울입니다.종이 타월을 사용하여 바이알에서 잔류 용매를 추출하십시오. 샘플을 포함하는 SDS의 경우. 펠릿을 방해하지 않고 400 마이크로 리터의 신선한 아세톤을 조심스럽게 분배하십시오.즉시 샘플을 실온에서 10, 000배 G 이상에서 1분간 원심융합하여 바이알을 초기 스핀과 동일한 방향으로 로터에 넣는다. 앞에서 설명한 대로 세척 용매를 계수합니다. 약 1분 동안 뚜껑을 열고 샘플을 건조시킵니다.흄 후드에서, 펠릿 가용화 전에. 100 마이크로 리터의 단백질 용액을 폴리 프로필렌 바이알에 분배합니다. 흄 후드에 400 마이크로 리터의 메탄올과 100 마이크로 리터의 클로로포름을 첨가하십시오.바이알과 와류를 잠시 뚜껑을 닫아 혼합합니다. 300 마이크로 리터의 물을 바이알 중앙에 직접 신속하게 분배하십시오. 바이알을 덮고 1 분 동안 방해받지 않고 벤치 상단에 앉히고, 폴리 프로필렌 바이알을 원심 분리기에 넣고 실온에서 10, 000 배 G 이상에서 5 분 동안 회전시킵니다.바이알은 대략 45도에서 바이알까지 두 개의 용매 층과 가시적인 백색 펠릿을 갖는 것으로 관찰된다. 초기에 큰 1 밀리리터 마이크로 피펫 팁을 사용하여 균일 한 속도로 상층에서 약 700 마이크로 리터의 용매를 제거하고 나중에 바이알에서 비드를 형성 할 때까지 200 마이크로 리터 피펫 팁을 사용합니다. 400 마이크로리터의 신선한 메탄올을 바이알의 측면 아래로 용매를 분주하여 펠릿을 방해하지 않고 샘플 바이알에 추가합니다.바이알을 덮고 바이알을 부드럽게 흔들어 용매를 함께 소용돌이치게 하여 용매층을 결합합니다. 백색 단백질 펠렛을 관찰하기 위해 로터 원심분리기에서 바이알의 배향을 관찰하기 위해 실온에서 10, 000배 G 또는 그 이상에서 최소 10분 동안 관찰하였다. 펠릿이 아래를 향하도록 바이알의 각도를 맞춥니다.바이알의 상단 가장자리를 따라 피펫 팁을 놓고 느리지만 균일한 속도로 1밀리리터 마이크로 피펫 팁으로 상층액을 제거합니다. 약 20 마이크로 리터의 용매를 유지합니다. 흄 후드에서 잔류 용매를 건조시키십시오.단백질을 침전시킨다. 일회용 여과 카트리지를 사용하여 플러그를 상단 여과 카트리지에 연결합니다. 90 마이크로 리터의 단백질 용액 10 마이크로 리터의 1 몰 아쿠아, 염화나트륨 및 400 마이크로 리터의 아세톤을 결합하십시오.벤치 상단에서 최소 2분 동안 배양하고, 준비된 단백질 샘플을 여과 카트리지에 플러그가 부착된 상태로 실온에서 2, 500배 2분 동안 원심분리 G.At 하고, 카트리지를 뒤집고 나사를 풀고 카트리지 베이스에서 플러그를 제거합니다. 여과 카트리지를 깨끗한 바이알에 넣고 실온에서 500회 G에서 3분 동안 단백질 샘플을 원심분리한다. 하부 바이알로부터 용매를 통한 유동을 버린다.여과 카트리지에 400 마이크로리터의 아세톤을 첨가하여 단백질 펠릿을 세척하고, 실온에서 또는 상부 카트리지에 용매가 남아 있지 않을 때까지 500회 G에서 3분 동안 원심분리한다. 이전에 입증 된 단백질 침전 프로토콜을 따릅니다. 단백질 펠렛의 재가용화를 위한 재가용화 프로토콜을 진행하기 직전에 2 내지 5마이크로리터의 ISO 프로판올을 멤브레인에 직접 분주하여 여과 카트리지의 베이스에 멤브레인을 적셔 단백질을 재가용화하여 물에 포름산의 80% 부피 용액을 준비합니다.이 산성 용액을 섭씨 영하 20도에서 미리 냉각하고 침전된 단백질이 포함된 여과 카트리지를 미리 냉각합니다. 50 마이크로 리터의 차갑게 희석 된 포름산을 냉각 된 카트리지 캡에 분배하고 30 초 동안 와동시킵니다. 여과 카트리지를 섭씨 영하 20도의 냉동실에 10분 동안 다시 넣습니다.이전 와류 및 배양 단계를 반복하십시오. 500 마이크로 리터의 최종 부피에 450 마이크로 리터의 물을 첨가하십시오. 포름산을 8%로 희석하여 카트리지를 뒤집어 나사를 풀고 카트리지 베이스에서 플러그를 제거하고 SPE 카트리지를 바이알에 부착합니다.실온에서 800회 G.용매가 상부 카트리지에 남아 있으면 카트리지를 원심분리기로 되돌리고 스핀을 반복하여 실온에서 5분 동안 SPE 카트리지를 통해 단백질을 회전시킵니다. SPE 카트리지에 물에 0.1 %의 TFA가있는 300 마이크로 리터의 5 % 아세토 니트릴을 첨가하여 헹구고 2000 회 G.For 저 분자량 단백질 또는 소화 된 펩타이드의 경우 300 마이크로 리터를 흘려 샘플을 용리시킵니다. 2, 500 배 G.For 손상되지 않은 단백질의 경우 5 분 동안 0.1 %의 TFA를 함유 한 50 % 아세토 니트릴.300 마이크로 리터의 75 % 아세토 니트릴과 0.1 % 트리 플루오로 고행산을 사용하여 추가 파악 단계를 추적하십시오. 두 개의 결과 추출을 결합합니다. 이 그림은 바이알 기반 또는 일회용 필터 카트리지에서 단백질 침전 후 SDS 고갈을 비교합니다.종래의 급속 및 CMW 프로토콜과 함께 아세톤을 사용합니다. 모든 접근법은 최적의 질량 분석 분석을 허용하기 위해 SDS를 줄입니다. 이 그림은 처리된 효모 총 세포 용해물의 SDS 페이지 분석을 통해 빠른 아세톤 침전 및 CMW 침전에 따른 정량적 단백질 회수를 보여줍니다.모든 침전 프로토콜에서 일관된 회복이 얻어졌다. 일회용 여과 카트리지에 침전되므로 응집된 단백질을 멤브레인 필터 위에 유지하면서 상청액이 포함된 SDS를 조심스럽게 피펫팅할 필요가 없습니다. 따라서 3개의 독립적인 반복실험에 걸쳐 상청액 분획에서 가시적인 밴드가 검출되지 않았습니다.카트리지 기반 단백질 침전은 바이알 기반 침전에 비해 소 혈장의 펩신 소화 샘플의 우수한 회수율을 보여줍니다. 수율의 더 중요한 차이는 염화나트륨을 사용하는 반면 아연 용매를 사용하면 가장 높은 수율을 얻을 때 카트리지에서 나타납니다. 이 수치는 일회용 필터 카트리지에서 처리된 샘플에 대해 더 높은 펩타이드 풍부도를 반영하는 1보다 높은 비율로 각 펩타이드 샘플의 펩타이드 피크 강도를 정량화합니다.이 그림은 세 가지 반복 샘플 준비에서 단백질당 확인된 펩타이드의 수를 비교합니다. 이 그래프에서 0.94에서 0.95까지의 상관 계수는 상향식 질량 분석을위한 샘플 준비 접근법의 높은 일관성을 보여줍니다. 따라서 일단 펠릿이 형성되면 방해를 피하고 싶습니다.손상되지 않은 펠릿으로 보관하면 더 높은 수율을 얻을 수 있습니다. 따라서 추가 아세톤으로 펠릿을 씻는 것을 잊지 마십시오. 이것은 우리가 샘플을 가능한 한 깨끗하게 유지하는 SDS를 제거하고 최상의 질량 분석 분석을 제공한다는 것을 보장합니다.그래서 우리는 샘플을 피펫팅하는 것보다 반전시켜 과도한 용매를 제거하는 것이 훨씬 간단하다는 것을 발견했습니다. 이렇게 하면 보다 일관된 수익률을 얻을 수 있습니다. 실온에서 아세톤 침전을 수행하면 냉동실에서 전통적인 침전보다 더 일관되고 빠른 회수가 가능합니다.

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