Name: 광대역 자극 라만 산란 현미경을 기반으로 한 멀티플렉스 화학 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 배우세요 광대역 자극 라만 산란 현미경을 이용한 멀티플렉스 화학 이미징 방법을. PMMA와 폴리스티렌 미소구슬을 활용한 생물학적 샘플의 비표적 비침습적 화학 성분 분석 기술입니다.

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G. C.는 광대역 SRS 현미경 기술을 상용화하는 것을 목표로하는 Cambridge Raman Imaging이라는 회사와 계약을 체결했다고 선언합니다. 다른 저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

광대역 SRS 현미경 검사는 이종 샘플의 화학적 성분을 식별하고 분리하기 위해 진정한 화학적 대비를 제공하는 강력한 이미징 기술입니다. 이 분석 도구의 잠재력은 재료 과학에서 조직 병리학에 이르기까지 여러 연구 분야에 도움이 될 수 있습니다. 광대역 SRS 현미경 검사의 단점은 기술적으로 요구된다는 사실입니다. 실험자는 광대역 레이저 소스에 대한 노하우가 필요할 뿐만 아니라 레이저 펄스를 조작하여 SRS를 효율적으로 생성해야 하며, 이는 정교한 검출 방식으로 측정해야 하는 신호입니다. 이 백서에서는 멀티플렉스 광대역 SRS 현미경을 사용하여 혼합 화학 화합물의 화학 맵을 생성하는 워크플로우를 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 설명 된 연구가 일부 레이저 물리학 자 및 비선형 현미경 학자에게는 사소한 것일 수 있지만, 과학적 지식이 이러한 영역 외부에 상주하는 광대역 SRS 현미경의 이점에 관심이있는 독자에게는 그렇지 않을 수 있습니다. 따라서 우리는 광대역 SRS 현미경에 관심이있는 광범위한 청중을 안내하기위한 모든 단계를 자세히 설명하고자했습니다.
당면한 프로토콜은 몇 가지 강력하고 잘 알려진 라만 산란기로 구성된 간단하면서도 분광학적으로 풍부한 샘플을 준비하는 방법을 보여주는 것으로 시작되었습니다. 우리는 SRS 현미경을 설정하는 데 필요한 광대역 펌프 및 협대역 스토크스 빔을 얻는 방법에 대해 논의했습니다. 도 5C는 SHG 및 OPO 셋업의 스킴을 도시한다. 렌즈 f 1은 기본 빔을 LBO1에 집중시켜 SHG를 생성하는 반면, 이색성 미러는 SHG 방사선을 반사하고 잔류 기본 빔을 전송합니다. 두 번째 렌즈 f2는 SHG 빔을 시준합니다. f2 &gt; f 1 인 SHG 빔은 f2 / f1과 동일한 계수로 확장됩니다. 세 번째 렌즈 f3은 확장된 SHG 빔을 θ = 90° 및 φ = 29.0°에서 절단된 제2 타입 I LBO 결정(LBO2)에 초점을 맞춥니다. LBO 2를 전술한 SGH(520nm)로 펌핑하면 680-910nm 범위 내의 방사선이 DFG(difference-frequency generation)를 통해LBO2에서 나오게 되어 신호와 아이들러(27)라는 두 개의 빔이 생성됩니다(그림 5D, E). 후자는 SRS 실험에 사용되는 펌프 펄스를 전달하기 위해 OPO 공동에서 증폭되는 동안 폐기된다. 520 nm에서의 OPO의 펌프, 즉 SHG 빔은 SRS 실험의 펌프(즉, OPO의 신호 빔)와 혼동되어서는 안 된다.
SRS 현미경의 대비는 현미경의 초점 스폿에서 생성 된 비선형 신호, 주어진 시간에 샘플 평면에서 많은 수의 광자를 제한해야하는 신호에서 비롯됩니다. 이 광자 감금은 높은 수치 조리개 (NA) 현미경 목표, 시스템의 공간 해상도를 설정하는 렌즈 배열로 달성됩니다 : NA가 높을수록 공간 해상도가 높아집니다. 그러나, 높은 NA 목표들은 유리로 조밀하게 포장되며, 이는 펄스 방사선에 양의 GDD를 도입하며, 이는 궁극적으로 펄스들(39)의 시간적 프로파일을 넓히는 주파수 처프이다. 따라서, 현미경 목표에 의해 도입된 GDD는 광대역 펌프 펄스의 지속 시간을 증가시켜 스토크스 시간 엔벨로프보다 훨씬 더 길게 만들고 라만 신호의 효과적이고 접근가능한 대역폭을 감소시킬 수 있다. 또한, 이러한 확대는 또한 측정된 SRS 스펙트럼의 스펙트럼 프로파일의 왜곡을 야기할 수 있다.
CARS에서, 분광학적으로 관련된 신호는 여기 필드의 파장과 다른 파장에서 나타난다. 간단한 광승수 튜브 또는 전하 결합 장치(CCD) 카메라를 사용하여 CARS 신호를 제 시간에 통합하여 수천 개의 펄스를 합산하여 레이저 잡음을 평균화할 수 있습니다. 대신, SRS 신호는 강하고 변동하는 레이저 배경 내에 내장된 희미한 변조 전송으로 나타난다. 이러한 변조가 약하기 때문에 레이저 노이즈가 쉽게 압도되어 SRS 현미경의 이미징 속도와 감도가 모두 감소할 수 있습니다. 따라서, 이미징 전에, 상대 강도 잡음(RIN)을 측정하여 레이저가 고속 SRS 이미징에 적합한지 여부를 결정하고 가장 낮은 잡음을 갖는 변조 주파수를 선택하는 것이 필수적이다. RIN은 평균 광 전력 () 40,41에 의해 정규화 된 레이저의 잡음 전력 스펙트럼 밀도 [δP (<img alt="정적 평형 ΣFx=0 다이어그램; 구조 분석에서 힘 균형; 교육 물리학 도구." src="/files/ftp_upload/63709/63709eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2">f), W2 / Hz 단위]로 정의됩니다. 즉, RIN은 상이한 주파수들에서의 정규화된 레이저 변동들을 기술한다(Eq[4]).
<img alt="상대 강도 노이즈, 방정식: RIN=10log₁₀(δP(f)/P̅²) [dB/Hz], 광 신호 안정성." src="/files/ftp_upload/63709/63709eq07.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 7"> (4)
따라서, RIN은 실험을 위한 이상적인 변조 주파수 범위를 결정하는 SRS 시스템의 파라미터이다. 예를 들어, 도 8 의 올리브 바는 SRS 이미징을 위한 이상적인 변조 주파수 범위를 나타낸다. 협대역 SRS의 경우, 사용자는 펌프와 스토크스의 RIN을 측정하여 최적의 성능을 달성하기 위해 어떤 빔을 변조해야 하는지를 선택해야 합니다. 예를 들어, 그림 8의 Stokes 빔은 펌프보다 약간 높은 RIN을 가지며, 이는 SRG 측정이 SRL 빔보다 시끄러울 것임을 의미합니다. 광대역 SRS의 경우, 변조되어야 하는 빔은 협대역 빔이다.
격자의 각도 분산 D 는 회절각을 파장의 함수로 표현하고, 격자 방정식의 미분으로 정의된다. 리트로 구성의 경우, 각도 분산은 Eq(5)에 의해 주어진다.
<img alt="회절식 D = dβ/dλ = 2/λ tanβ; 광분산 분석, 물리 방정식." src="/files/ftp_upload/63709/63709eq08.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 8"> (5)
Eq (5)를 얻으려면 α = β이라고 가정 하고 m / d에 대한 Eq (2)를 풀고 결과를 d β / d λ에 삽입했습니다. Littrow 구성에서 β = sin-1 (m λ / 2 d). 소각 근사 내에서 스펙트럼을 따른 위치 변화는 fdβ ≈ dl입니다(그림 10). 따라서 dβ를 Eq (5)에 삽입하여 Eq (6)를 사용하여 nm mm-1의 단위를 갖는 양인 선형 분산을 계산할 수 있습니다.
<img alt="파장 분산에 대한 미분 방정식; 방정식 공식; 광학, 분광학 개념." src="/files/ftp_upload/63709/63709eq09.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 9"> (6)
1,851.85 그루브/mm를 갖는 리트로우 구성에서 작동하는 회절 격자의 경우, d = 540 nm. ~789 nm에서 빛의 1차 회절을 사용하는 경우, D = 0.0027 rad nm-1. f = 750mm 렌즈를 사용하면 0.5nm≈ mm-1의 선형 분산을 얻을 수 있으며 ≈ 7.8cm-1mm-1로 변환됩니다. 따라서, 렌즈의 초점 거리는 검출기 평면에서 mm 당 nm의 "밀도"를 결정 한다: 초점 거리가 길수록 얻어지는 mm 당 nm가 적을수록 광대역 펌프의 스펙트럼 라인 사이의 공간이 증가한다. 반대로, 초점 거리가 짧을수록 검출기 평면에서 mm 당 nm가 더 많아져 분산 된 펌프가 차지하는 공간이 줄어 듭니다.
균형 잡힌 감지는 시끄러운 설정의 이미지 품질과 감도를 향상시킵니다. 예를 들어, 도 8에 도시된 RIN 스펙트럼에 따르면, 진폭이 1 x 10-5인 일반적인 SRS를 고려하면, 불균형 신호 대 잡음비(SNR)는 ≈60이다. 균형 잡힌 검출(즉, 샷 노이즈에 근접)을 사용하여, ≈145의 SNR을 달성할 수 있다. 도 11은 균형 잡힌 조건과 불균형 조건하에서의 스펙트럼 및 합성 이미지를 보여준다. 당연히 균형 잡힌 탐지의 효과는 실험의 최종 결과, 즉 화학지도에 영향을 미칩니다. 이러한 결과를 뒷받침하는 균형 잡힌 감지는 레이저 변동이 이미지 품질에 미치는 해로운 영향에 대처할 수있는 강력한 기술임을 강조합니다. 균형 잡힌 감지는 파이버 발진기와 같은 시끄러운 레이저에 가장 적합하다는 것을 언급 할 가치가 있습니다. 조용한 광학 광원(예를 들어, 고체 레이저)으로 작동하는 SRS 현미경은 균형 잡힌 검출을 필요로 하지 않을 수 있다.
이 프로토콜은 또한 이러한 빔의 펄스 사이의 시공간 중첩을 찾기 위해 비선형 광학에 기반한 접근법을 설명합니다. AOM의 0번째 회절 순서 대신1st를 변조된 Stokes 빔으로 사용하는 이점에 대해 설명했습니다. 또한, SRS 생성 효율에 대한 분산의 해로운 영향을 프리즘 압축기를 통해 이를 완화시키는 방법의 제안과 함께 설명하였다. 또한이 프로토콜은 프리즘을 정렬하는 방법을 설명하고 최적의 성능을 위해 고려해야 할 세 가지 중요한 측면을 강조합니다. SRS 현미경 검사에 대한 RIN의 관련성에 대해 논의할 뿐만 아니라 잠금 증폭기를 사용하여 이를 측정하는 방법을 보여주고 RIN 스펙트럼을 사용하여 최상의 변조 주파수를 정의합니다. 구체적인 예를 통해 이 백서에서는 격자 방정식이 감지 체인을 설계하는 데 어떻게 도움이 되는지 설명합니다. 마지막으로, 프로토콜은 실제 SRS 데이터를 통해 SRS 하이퍼큐브의 구조와 기존에 사용되는 과학 프로그래밍 언어로 SRS 하이퍼큐브를 분석하는 방법을 보여줍니다.
이 프로토콜에는 세 가지 사소한 제한 사항이 있습니다. 첫째, 이러한 기여에 채택된 검출 방식은 Sciortino et al.26에 의해 사내에서 설계 및 구축된 비전통적 다중 채널 록인 검출기로 구성된다.26 앞서 입증된 바와 같이, 이 검출기는 기성품 균형 잡힌 광 다이오드로 대체될 수 있다. 이 수정은 검출기에만 관련되고 프로토콜은 거의 변경되지 않지만 단일 광 다이오드를 사용하면 한 번에 모두 측정하는 대신 검출기의 각 스펙트럼 구성 요소를 스캔해야합니다. 둘째, 이 프로토콜은 빔 경로에 여러 광학 요소를 삽입해야 하는 인라인 밸런스드 감지를 사용합니다. 이러한 광학 요소는 시스템 복잡성을 증가시키고 광 전력 및 펄스 확장의 손실을 초래합니다.
인라인 균형 잡힌 검출은 또한 두 개의 펌프 레플리카가 샘플을 통과하도록 요구하는데, 이는 살아있는 세포와 같은 빛에 민감한 샘플이나 두 펌프 레플리카가 서로 다른 광학 특성을 경험할 수있는 강한 복굴절성 샘플에 이상적이지 않을 수있는 상황이므로 균형 잡힌 검출을 취소합니다. 셋째, 프로토콜은 쉽게 사용할 수없는 장치 인 가정용 OPO에 의존합니다. 그러나, OPO에 의해 전달되는 광대역 스펙트럼에 대한 대안은 비선형 광섬유 또는 벌크 결정으로부터의 초연속체이다. 후자는 낮은 반복률 레이저 (최대 5MHz)에서만 사용할 수 있습니다. 따라서 모든 실험 설계와 마찬가지로 당면한 프로토콜에는 몇 가지 한계가 있습니다. 그러나 이들은 최소한이며이 접근법의 성공을 손상시키지 않습니다.
참조 샘플이 여기에 설명되어 있지만,이 프로토콜은 셀룰로오스, 지질 종 또는 단백질과 같은 세포 및 동물 및 식물 조직 내의 화학 종을 성공적으로 분리하여 다양한 생화학 적 탐구 또는 조직 병리학의 진단 도구로서 실용적인 응용 프로그램을 찾을 수 있습니다. 마찬가지로,이 프로토콜은 재료 과학에서 가치있는 도구가 될 수 있습니다. 예를 들어, 이 프로토콜에 따라, 중합체 종(42)의 분자 조성 및 농도를 조사할 수 있다. 또한, 이 방법론은 펌프-프로브(43) 및 헤테로다인 CARS(44)에 기초한 광대역 현미경과 같은 다른 비선형 현미경 기술과 호환되며, SRS와 마찬가지로 두 개의 여기 광선 및 변조-전달 측정도 필요로 하는 4파 혼합 공정이다. 마지막으로, 이 논문에 포함된 정보 중 일부는 변조 전달 기술에 의존하지 않지만 종래의 CARS(45) 및 SFG 현미경(46)과 같은 둘 이상의 펄스 레이저 빔을 정렬할 필요가 있는 비선형 이미징 기술에 적용될 수 있다.
요약하면, 이 프로토콜은 광대역의 SRS 현미경을 기반으로 화학적으로 이질적인 혼합물로부터 화학 맵 및 그 특징적인 SRS 스펙트럼을 추출하는 강력한 방법론을 설명하며, 간단한 정량적 데이터 분석을 허용하는 데이터 세트를 제공합니다. 이 방법의 다양성과 단순성은 관심있는 독자에게 다른 비선형 기술에 적응할 수있는 가능성을 제공합니다.

라만 현미경은 입사광 2,3에 반응하여 진동하는 분자에서 발생하는 비탄성 방사 과정인 라만 산란1을 측정하여 풍부한 화학 지도를 제공하는 강력한 이미징 기술입니다. 라만 맵의 각 픽셀에는 샘플의 화학적 구성과 구조에 대한 직접적인 정보를 전달하는 스펙트럼이 포함되어 있어 고유 진동 대비가 있는 이미지가 생성됩니다. 현재까지 라만 현미경은 다른 이미징 기술이 높은 화학적 특이성과 높은 공간 해상도의 이미지를 생성 할 수 없기 때문에 분자 진동에 대한 미세 분광법 연구의 기준 관점입니다4. 뛰어난 화학적 특이성에도 불구하고 라만 산란의 생성 효율은 낮기 때문에 픽셀 체류 시간 연장 또는 고출력 여기가 필요하므로 각각 낮은 획득률과 민감한 샘플과의 비 호환성을 초래합니다.
라만 현미경 검사의 이러한 단일 결핍으로 인해 연구자들은 현미경 검사의 대조 원인으로 일관된 라만 산 란 5,6,7,8,9를 적용하게되었습니다. 이것은 몇 배(최대 일곱 개까지)의 크기 차이로 진동 반응을 향상시키는 비선형 광학 공정으로, 고속 화학 이미징(10,11,12,13)을 가능하게 합니다. 특히, 가장 많이 채택된 두 가지 일관된 라만 산란 기술은 일관된 안티스토크스 라만 산란(CARS)14 및 자극된 라만 산란(SRS)15이다. CARS와는 달리, SRS는 공진 분자의 농도에 대한 선형 의존성을 나타낸다. 그것은 비공명 배경에 면역성이 있으며, 어떤 진동 전이와 무관하지만 분자 진동16,17의 라만 스펙트럼의 특징적인 로렌츠 모양에 왜곡되는 비선형 효과이다. 따라서, SRS 현미경 검사는 직접적인 정량적 이미지 분석을 가능하게 하는 확실한 라만 정보를 산출한다.
SRS는 샘플의 화학 결합에 대한 직접적인 정보를 제공하는 세 번째 순서, 비선형, 광학 공정입니다. 그것은 일반적으로 근적외선 스펙트럼 영역, 즉 주파수ωpu 및 ωS에서 펌프와 스토크스의 시공간 중첩에서 각각 10,11,18에서 기인합니다. 이 중첩은 펌프-스토크스 주파수 디튜닝 Ω =ωpu-ω S에서 박동을 생성합니다. Ω이 분자 진동 ΩR과 일치하면 분자가 공명하여 광장과 분자 사이에 일관된 에너지 전달이 발생합니다. 결과적으로, 분자는 진동적으로 여기된 상태에 도달한다. 이 과정은 펌프 광자의 소멸 (자극 된 라만 손실 [SRL]로 알려진 신호) 또는 스토크스 광자의 수반되는 증폭 (자극 된 라만 이득 [SRG]으로 알려진 과정)을 측정하여 모니터링 할 수 있습니다. SRG 및 SRL은 강렬하고 변동하는 배경(I) 위에 놓이는 작은 신호(ΔI)입니다. SRS 신호(ΔI/I)의 일반적인 값이 10-6-10-4 범위에 있기 때문에 레이저 잡음이 쉽게 가려질 수 있습니다. 신호 대 잡음비(SNR)에 대한 레이저 잡음의 해로운 영향을 완화하고 결과적으로 이미징 속도에 미치는 영향을 완화하기 위해, SRS 검출은 레이저 잡음이 최소값15,19,20에 도달하는 높은 변조 주파수(>1MHz)에서 변조 전송 기술(예를 들어, 록인 증폭기, 공진 회로 또는 박스카 평균기)에 의존한다.
기존의 SRS 현미경은 협대역(≈10cm-1) 펌프 및 스토크스 펄스를 사용하여 단일 진동 주파수에서 화학 이미지를 생성하므로 픽셀 유지 시간이 ≈100ns21,22로 낮은 비디오 속도 이미징이 가능합니다. 그러나, 협대역 SRS 현미경은 단지 몇 개의 진동 주파수에서 샘플을 순차적으로 스캐닝함으로써 화학 지도를 형성하기 때문에, 그 정보는 제한된다(23). 하나 또는 두 개의 진동 콘트라스트를 갖는 SRS 이미지들은 특히 이종 시스템 내에서 겹치는 라만 밴드를 갖는 화학 종을 구별하기에 충분하지 않을 수 있다. 따라서, 패러다임 협대역 SRS 현미경은 소수의 진동 주파수를 조사하는 것이 화학적 특이성을 방해하고 진동 스펙트럼 내에 인코딩된 풍부한 정보를 무시하기 때문에 SRS의 완전한 잠재력을 이용하지 않는다. 또한 서로 다른 주파수에서 샘플을 순차적으로 스캔하면 픽셀 유지 시간이 연장되어 광손상을 유발하고 연속 이미지 간의 엄격한 공간 공동 등록을 방지하여 모션 아티팩트를 유발할 수 있습니다.
협대역 대응과는 달리, 광대역 SRS 현미경은 각 샘플 스캔(10,12,24)에서 픽셀당 진동 스펙트럼을 검색한다. 따라서, 광대역 SRS는 상이한 진동 콘트라스트의 엄격한 공간 공동 등록과 함께 하이퍼스펙트럼 이미징을 제공하여, 엄격한 데이터 분석을 가능하게 한다. 이것은 라만 스펙트럼을 통해 표본의 화학 성분을 밝혀 낼뿐만 아니라 상대적 농도를 결정하는 데 도움이됩니다. 스펙트럼이 획득되는 방법에 따라, 광대역 SRS 현미경은 하이퍼스펙트럼 SRS 또는 멀티플렉스 SRS로 분류된다. 하이퍼스펙트럼 SRS에서, 샘플의 스캔된 포인트당 SRS 스펙트럼은 순차적으로 획득되고(즉, 주파수 디튜닝 Ω를 스윕함으로써 검색됨), 연속적인 라만 시프트에서 SRS 신호들을 함께 적층함으로써 SRS 스펙트럼을 구축한다. 라만 스펙트럼은 멀티플렉스 SRS의 여러 진동 모드에서 동시에 측정됩니다. 따라서, 멀티플렉스 SRS 접근법은 변조된 협대역 펄스와 광대역 펄스를 결합하여 SRS 신호를 상이한 주파수에서 구동하고, 협대역 SRS에 필적하는 감도를 갖는 다중 채널 검출기를 사용하여 SRS 스펙트럼을 검출한다.
이 백서는 멀티플렉스 SRS 현미경을 사용하여 이기종 샘플의 화학 맵을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에 채용된 SRS 현미경의 스킴은 도 1에 묘사되어 있고 다른 곳에서 상세히 설명된다(25,26,27). 간단히 말해서, 10W 평균 전력과 80MHz 반복률로 1040nm를 중심으로 140fs 펄스를 생성하는 상용 모드 잠금 Yb 파이버 레이저가 광대역 SRS 현미경을 구동합니다. 편광 빔 스플리터(PBS)는 기본 빔을 두 개의 브랜치로 분리합니다. 협대역 스토크스 펄스를 생성하기 위해, 기본 빔의 4W를 갖는 하나의 브랜치가 협대역(≈15cm-1) 빔을 생성하는 에탈론으로 보내지고, 이 빔은 음향 광학 변조기(AOM)로 1.6MHz에서 변조된다. 기본 빔의 6W를 갖는 나머지 분획은 2.8mm 두께의 리튬 트리보레이트(LBO) 결정으로 주파수가 두 배로 증가하고, type-I 위상 정합을 위해 절단된다(θ = 90°, φ = 13.8°). 520nm에서 생성된 2차 고조파 생성은 3.0mm 두께의 LBO 결정(유형 I 상 정합, θ = 90°, φ = 9.8°)을 활성 매질로 사용하는 장치인 광학 파라메트릭 발진기(OPO)를 펌핑하기 위해 X접힌 캐비티로 이동하여 680-910nm 스펙트럼 영역 내에서 파장 조정 가능한 광대역 광 방사선을 전달합니다(그림 2). 이러한 광대역 펄스는 SRS 실험에서 펌프 역할을 하며 프리즘 압축기로 전파되어 현미경 목표에 의해 유도된 분산 효과를 미리 보상합니다.
압축 단계 후, λ/2 웨이브플레이트는 YVO4 복굴절 플레이트와 결합되어 두 개의 직교 편광 복제본을 생성하며, 이 복제본은 감지 평면에서의 전자 뺄셈으로 광대역 펌프의 잡음을 상쇄합니다. 이색성 거울은 펌프와 스토크스 빔을 결합하여 직립 현미경으로 보냅니다. 수치 조리개(NA)가 1.27인 침지 목표는 빛을 샘플에 집중시키는 반면, NA가 1.4인 오일 침지 목표는 이를 수집합니다. 검출 단계 전에, 단거리 통과 필터(SPF)는 변조된 스토크를 제거하고, 리트로 구성에서 작동하는 회절 격자는 전송된 광대역 펌프를 분산시킨다. 제2 PBS 2는 펌프 레플리카를 분리하고, 렌즈는 이들을2 개의 광다이오드 어레이에 초점을 맞춘다. 이러한 광 다이오드 어레이의 신호는 전자적으로 뺄 수 있으며 자체 제작된 다중 채널 잠금 증폭기(M-LIA)로 전송됩니다. 복조된 신호는 이어서 광 다이오드 어레이 중 하나의 직류(DC) 판독에 의해 정규화되어, SRL 스펙트럼을 생성한다.
예시적인 실험으로서, 우리는 몇몇 잘 알려진 라만 산란기의 혼합물을 이미지화하며, 각각은 독특한 라만 스펙트럼을 가지고 있다. 따라서, 프로토콜은 참조 샘플을 준비하는 방법을 기술함으로써 시작한다. SRL을 감지하면서 협대역 스토크스 펄스를 얻고 광대역 (≈250cm-1) 펌프 펄스, 즉 자체 제작 OPO를 제공하는 광원을 설정하는 방법을 계속 설명합니다. 이 프로토콜은 광학 빔의 정렬 및 최적화를 보여 주며 협대역 Stokes 및 광대역 펌프의 전력 및 스펙트럼과 같은 중요한 매개 변수를 설명합니다. 이 프로토콜은 특별한 광학 요소가 필요하기 때문에 광대역 펌프의 광 경로를 자세히 설명합니다. 또한 펌프-스토크스 펄스 사이의 시공간 중첩을 찾는 방법을 설명하고 상대 강도 잡음(RIN)을 결정하는 실용적인 방법을 보여 주며, 이는 SRS 실험에 가장 적합한 변조 주파수를 정의하는 데 도움이 됩니다. 그런 다음 감지 체인의 작동 원리와 교정에 대해 설명합니다. 마지막으로, 프로토콜은 데이터 수집 프로세스, 화학법 및 이미지 처리 파이프라인을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>수집 목적</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo Lambda S 60x Oil, NA=1.4, Nikon</td><td>Oil Immersion objective</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Thermo Fisher</td><td>043211-KJ</td><td>Quartz, microscope slide용 커버 슬립, 25.4 x 25.4 x 0.15mm</td></tr><tr><td></td><td>Delay line Physik Instrumente (PI)</td><td>M-406.6PD</td><td>정밀 마이크로 변환 스테이지, 150mm 이동 범위</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck</td><td>D8418-500ML</td><td>Methylsulfinylmethane, 분자 생물학 등급 DMSO, DMSO, Methyl Sulfoxide</td></tr><tr><td>Etalon</td><td>SLS Optics Ltd</td><td>맞춤형</td><td>반사 방지 코팅 1,040 nm, 보호 먼지 캡이있는 38mm 직경 x 35.5 mm 길이의 스테인리스 스틸 셀에 장착되고 50 mm 직경의 ' 핀치 클램프' 마운팅 링</td></tr><tr><td>여기 목표</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo IR 60XC WI, NA=1.27, Nikon</td><td>Water immersion objective</td></tr><tr><td>Grating</td><td>LightSmyth</td><td>T-1850-800s 시리즈</td><td>고효율 전송 격자 T-1850-800s 시리즈</td></tr><tr><td>레이저</td><td>Coherent</td><td>맞춤형</td><td>충실도, HP</td></tr><tr><td>&lambda;/2</td><td>Thorlabs</td><td>SAHWP05M-1700</td><td>장착 초무채색 반파 플레이트</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thorlabs</td><td>CM5-PBS203/M</td><td>16mm 케이지 큐브 장착형 편광 빔스플리터 큐브,</td></tr> <tr><td>PMMA 비드</td><td>Merck</td><td>MFCD00198073</td><td>폴리메타크릴레이트</td></tr><tr><td>프리즘</td> 기반 마이크로 입자 <td>Crisel</td><td>320-8218</td><td>SF11 PS 비드의 레이저 분산 프리즘</td></tr><tr><td></td><td>Merck</td><td>72986-10ML-F</td><td>폴리스티렌</td></tr> <tr><td>기반 마이크로 입자YVO4 크리스탈</td><td>Dr. Sztatecsny GmbH</td><td>맞춤 제작</td><td>&nbsp; 두께 8 mm, 직경 1.00 cm, 1 689,00 689,00 1" 마운트에 적합, 850 - 1,100 nm용 코팅</td></tr></tbody></table>

광대역 자극 라만 산란 현미경을 기반으로 한 멀티플렉스 화학 이미징

Multiplex Chemical Imaging Based on Broadband Stimulated Raman Scattering Microscopy

자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 라벨이 없는 화학 이미징을 위한 비선형 광학 기술입니다. 이 분석 도구는 분자 진동을 직접 조사하여 얇은 샘플의 고속과 높은 공간 분해능으로 화학 맵을 제공합니다. 표준 구현에서 SRS 현미경은 협대역이며 한 번에 하나의 진동 주파수만으로 이미지를 형성합니다. 그러나 이러한 접근법은 SRS의 화학적 특이성을 방해 할뿐만 아니라 진동 스펙트럼 내에 인코딩 된 풍부한 정보를 무시합니다. 
이러한 한계는 이미지의 픽셀당 진동 스펙트럼을 병렬로 추출할 수 있는 구현인 광대역 SRS에 의해 극복될 수 있다. 이는 화학학적 분석과 결합될 때 표본에서 검색된 정보의 양을 최대화하는 하이퍼스펙트럼 데이터를 제공합니다. 따라서, 광대역 SRS는 시스템의 화학적 특이성을 향상시켜, 샘플의 상이한 구성성분의 농도의 정량적 결정을 가능하게 한다. 여기에서는 맞춤형 차동 다중 채널 잠금 증폭기 감지로 작동하는 가정용 SRS 현미경을 기반으로 광대역 SRS 현미경을 사용한 화학 이미징 프로토콜을 보고합니다. 샘플 준비, SRS 장치의 정렬 및 화학법 분석에 대해 설명합니다. 진동 라만 스펙트럼을 획득함으로써, 프로토콜은 혼합물 내의 다른 화학 종을 식별하고 상대적 농도를 결정하는 방법을 보여줍니다.

도 3은 PS, PMMA 및 올리브 오일과 함께 이 프로토콜을 사용하여 수득된 예시적인 결과를 도시한다. LBO1 의 이러한 회전은 SHG 필드에서 경험하는 굴절률을 변화시켜 위상 속도를 직접 수정합니다. SHG 필드의 위상 속도가 LBO1에서 유도된 비선형 분극의 위상 속도와 일치할 때, 비선형 생성 필드와 비선형 분극은 위상에 있게 되어 강렬한 SHG 방사로 이어진다. 즉, LBO1 의 φ각을 조정하면 사용자가 SHG에 대한 이상적인 위상 정합 조건을 얻을 수 있습니다. 여기서 타입 I 위상 정합 결정이 사용됨에 따라, SHG 빔의 편광은 기본 빔의 편광과 직교할 것이다(도 5B).
도 8은 이 프로토콜에 사용된 광원의 RIN과 레이저 잡음에 대한 근본적인 한계를 설정하는 전자와 광자의 양자 성질의 결과인 샷-노이즈 한계를 보여준다. 샷 노이즈 제한 RIN은 Eq (3)에 의해 나타낸 바와 같이 계산 <img alt="헤르츠당 데시벨(dB/Hz)은 신호 강도를 분석하기 위한 수학적 개념인 분수로 표시됩니다." src="/files/ftp_upload/63709/63709eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 5"> 된다.
<img alt="샷 노이즈 방정식, RIN_shot = 10log10(2hv/P̅), 광학 노이즈 분석 공식." src="/files/ftp_upload/63709/63709eq06.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 6"> (3)
여기서 h 는 플랑크의 상수이고 ν는 광 주파수입니다. 따라서, 샷 노이즈는 전자 설계에 유용한 지침을 제공합니다.
도 11A 및 도 11C는 균형 및 불균형 스펙트럼의 예시적인 데이터를 도시한다. 당연히 균형 잡힌 탐지의 효과는 실험의 최종 결과, 즉 화학지도에 영향을 미칩니다. 도 11B 및 도 11D는 각각 불균형 및 평형 조건에서의 합성 이미지를 도시한다. 기술된 프로토콜을 성공적으로 구현하면 이종 샘플의 상이한 화학적 구성성분을 확인 및 국소화하고 이들의 특징적인 SRS 스펙트럼을 추출하는 데 도움이 될 것이다. 도 12의 하이퍼스펙트럼 데이터를 화학학적 분석에 적용하면 도 13을 제공한다. 도 13A는 샘플의 상이한 화학적 구성성분들의 농도 맵들의 복합체를 도시하는 반면, 도 13B는 이들의 특징적인 SRS 스펙트럼을 도시한다. 도 13A에 도시된 데이터는 사용자가 샘플의 상이한 구성성분을 쉽게 식별할 수 있게 할 뿐만 아니라 더 많은 정량적 분석을 수행할 수 있게 한다. 예를 들어, 농도 맵을 사용하여 각 화학 종의 분수 농도의 평균을 계산할 수 있습니다 : 38 % DMSO, 25 % PMMA, 14 % PS 및 22 % 올리브 오일.
<img alt="레이저 분광법 설정 다이어그램; 광학 파라메트릭 발진기, SHG, 과도 흡수." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: 이 프로토콜에 사용된 광대역 SRS 현미경의 회로도. 약어: PBSx = 편광 빔스플리터; SHG = 초고조파 생성 모듈; OPO = 광학 파라메트릭 발진기; AOM = acousto optic modulator; SPF = 단거리 통과 필터; M-LIA: 다중 채널 잠금 증폭기; DM = 이색성 거울. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="크로마토그래피 스펙트럼 다이어그램; 조정 가능한 펌프 및 Stokes 라인; 파장 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: 조정 가능한 광대역 펌프(파란색)와 협대역(빨간색) 스토크스 빔의 스펙트럼. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="액적의 폴리머 분산의 현미경 이미지; PS, PMMA, DMSO, 오일 라벨링; 분산 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3: 화학적으로 불균질 샘플의 브라이트필드 이미지. 기존의 현미경 검사는 상이한 구성성분들이 구별되는 것을 허용하지 않는다는 것을 주목하라. 스케일 바 = 100 μm. 약어: PS = 폴리스티렌; PMMA = 폴리메틸 메타크릴레이트; DMSO = 디메틸 설폭사이드. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="AOM 분광법 설정을 사용한 투과율 대 시간 그래프는 광학 펄스 변조를 나타냅니다." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 그림 4: 협대역 스토크스 펄스의 변조 . (A) 투명한 파란색 트레이스는 0번째 확산 빔을 나타내고, 검은색 트레이스는 해당 1차 시퀀스를 보여줍니다. (B) 여기 목표에 도달하기 전에 1차 확산 빔의 변조 효율을 최적화하고 스토크스 빔의 스폿 크기를 미세 조정하기 위한 광학 설정. 약어: AOM = acousto 광학 변조기; fx = 렌즈 X의 초점 거리. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="SHG 및 DFG 다이어그램; 주파수 변환 및 신호 생성을 위한 LBO 크리스탈을 사용한 광학 설정." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 그림 5: OPO를 구동하는 데 필요한 비선형 광학 프로세스. (A) SHG 상호 작용의 형상. ω1에서 두 개의 기본 광자는 재료 시스템이 접지 상태로 뛰어 내려 ωSHG에서 광자를 방출하는 고에너지 가상 레벨로 재료 시스템을 가져옵니다. (b) SHG 실험의 반응식. (C) SHG 및 OPO 설정의 회로도. (d) DFG 상호작용의 지오메트리. ωSHG 광자는 신호 (ω신호)와 아이들러 (ωIdler) 광자로 분할됩니다. 신호 빔의 이득은 신호 광자를 피드백하고 캐비티에서 공진하게함으로써 달성됩니다. (e) DFG 실험의 반응식. 약어: SMx = 구형 거울 (R = 75 mm); OPO = 광학 파라메트릭 발진기; SHG = 초고조파 생성 모듈; DFG = 차이-주파수 생성; LBO = 리튬 트리보레이트; OC = 오일 응축기; DM = 이색성 거울; fx = 렌즈 X의 초점 거리. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="각도가 있는 프리즘 분산도, 두 개의 프리즘, 거울 반사, 광학 경로 분석" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 그림 6: 프리즘 압축기의 형상. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="총 주파수 생성(SFG)을 위한 광학 설정; SFG 진폭 대 지연선 위치를 보여주는 그래프." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig07.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> 그림 7: 시공간 중첩을 최적화하기 위한 합계 주파수 생성 . (A) 펌프와 스토크스 사이의 SFG와 스크린에 충돌하는 각각의 SHG 사이. 여기서 렌즈는 펌프를 집중시키고 스토크스 빔은 크리스탈에 초점을 맞추었고 저역 통과 필터는 이를 제거했습니다. (B) 시간 지연의 함수로서 펌프와 스토크스 사이의 SFG의 강도. SRS 설정의 시간 제로를 SFG를 최대화하는 위치에 설정합니다. B 에서의 교차 상관관계의 비대칭성은 스토크스 빔의 에탈론에 의해 야기된 시간적 프로파일에 기인한다. 약어: SFG = 합계 주파수 생성; SHG = 초고조파 생성 모듈; SRS = 자극된 라만 산란 분광법. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Stokes-Pump 소음 분석 그래프; RIN 대 주파수; 이상적인 SRS 대역폭이 강조 표시되었습니다. 분광 연구." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig08.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 8"> 그림 8: RIN 스펙트럼. 녹색으로 강조 표시된 밴드는 SRS 실험에 가장 적합한 스펙트럼 영역을 보여줍니다. 이 대역 내의 모든 주파수에서 Stokes 빔을 변조하면 SRS 신호에 대한 레이저 잡음의 영향이 가능한 가장 낮을 수 있습니다. 약어: RIN = 상대 강도 잡음; SRS = 자극된 라만 산란 분광법. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="펌프, 스토크스 및 결합된 신호를 보여주는 일관성 있는 반스토크스 라만 분광법(CARS) 설정." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig09.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 9"> 그림 9: 빔 프로파일 . (A) 펌프, (B) 스토크스, (C) 펌프 및 스토크스. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig09large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="회절 격자 다이어그램, 선형 검출기 정렬, 각도 β, 초점 거리 f, 광학 측정." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig10.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 10"> 그림 10: 분산 격자 및 광 다이오드 어레이 검출기에 대한 형상을 가정합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig10large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="분광학 비교, SRS 스펙트럼 분석 및 현미경 이미지, 균형 대 불균형 설정." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig11.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 11"> 그림 11. 균형 잡힌 탐지의 효과. 스펙트럼(A, C) 및 화학 이미지(B, D)에 대한 영향. 패널 (B) 및 (D)에 도시된 복합체는 실험의 최종 결과(즉, 하이퍼스펙트럼 데이터의 화학학적 분석 후)이다. 자세한 내용은 프로토콜 섹션 4를 참조하십시오). 스케일 바 = 10 μm. 약어: SRS = 자극된 라만 산란 분광법. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig11large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="현미경 검사에서 흡수 피크를 보여주는 파수 분석이 포함된 3D 스펙트럼 이미징 다이어그램." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig12.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 12"> 그림 12: 광대역 SRS 현미경으로 획득한 대표적인 SRS 하이퍼큐브. xy 평면은 스캔된 위치의 좌표를 저장하는 반면, z를 따른 각 벡터는 SRS 스펙트럼을 등록합니다. 약어: SRS = 자극된 라만 산란 분광법. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig12large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="나노입자의 현미경 이미지 및 분광 그래프; 파장 피크를 사용한 스펙트럼 데이터 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig13.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 13"> 도 13: 하이퍼스펙트럼 SRS 데이터의 화학측정 분석 . (A) 샘플의 상이한 구성성분들의 농도 맵의 합성. (B) 화학종의 특징적인 스펙트럼. 두 패널 모두에서 노란색 : 올리브 오일, 파란색 : DMSO, 시안 : PS 및 오렌지 : PMMA. 스케일 바 = 20 μm (A). 약어: SRS = 자극된 라만 산란 분광법; PS = 폴리스티렌; PMMA = 폴리메틸 메타크릴레이트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig13large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 광대역 자극 라만 산란 (SRS) 현미경으로 화학 이미지를 획득하기위한 프로토콜을 제시합니다. 차등 다중 채널 잠금 검출로 작동하는 SRS 현미경을 기반으로 하는 프로토콜은 시료 준비, SRS 장치의 조정 및 화학적으로 이질적인 샘플의 서로 다른 구성 요소를 분리하기 위한 화학측정법을 설명합니다.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a nonlinear optical technique for label-free chemical imaging. This analytical tool delivers chemical maps ...

우리의 프로토콜은 마이크로 초 내에 분자의 진동 스펙트럼을 측정 할 수있는 자극 된 라만 산란 현미경을 구축하는 방법을 설명합니다. 그리고 이미징에 적용될 때, 그것은 라벨이없고 비 침습적 인 방식으로 물질의 화학적 성분을 국소화하고 정량화하기 위해 하이퍼 스펙트럼 현미경을 제공 할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 주로 생물 및 생물 의학 과학에 여러 가지 응용 프로그램이 있습니다.예를 들어, 세포 또는 조직을 이미지화한다. 우리의 접근 방식에는 광대역 광 소스와 탐지 체인이라는 두 가지 중요한 과제가 있습니다. 전자를 다루기 위해 OPR을 구입하거나 직접 만들 수 있습니다.대안적으로, 벌크 결정 또는 비선형 광섬유에서 생성된 백색광 초연속체를 사용할 수 있다. 후자의 과제는 상용 광 다이오드 및 갈보 스캐너로 각 스펙트럼 성분을 순차적으로 스캔하여 해결할 수 있습니다 시작하기 위해 폴리 메틸 메타 크릴 레이트 또는 PMMA 마이크로 비드의 수성 현탁액에서 두 마이크로 리터를 추출하고 현탁액을 현미경 커버 슬립에 붓습니다. 그런 다음 폴리스티렌 마이크로비드의 수성 현탁액에서 두 마이크로리터를 추출하고 커버 슬립의 PMMA 현탁액과 결합합니다.현탁액을 피펫 팁과 부드럽게 혼합하고 24 시간 동안 건조시킵니다. 물이 마르면 덮개 슬립 위에 흰색 구슬 층이 나타납니다. 커버 슬립 위에 20 마이크로 리터의 디메틸 설폭사이드와 20 마이크로 리터의 순수한 올리브 오일을 넣으십시오.그리고 두 번째 현미경 커버 슬립의 가장자리에 매니큐어를 바르십시오. 매니큐어가 아래를 향하도록 혼합물에 커버 슬립을 놓고 밀봉하기에 충분한 압력을 가하십시오. 그것을 말리십시오.협대역 스토크스 빔의 변조 효율을 최적화한다. 렌즈 F1과 F2 사이의 거리를 변경하고 광 다이오드로 변조 빔을 측정합니다. 그런 다음 오실로스코프로 프로파일을 기록하십시오.결과 광대역 펌프 스펙트럼이 1040 나노미터의 협대역 스토크와 함께 2, 800 ~ 3, 100 역 센티미터 내에서 주파수 디튜닝을 생성할 수 있도록 광학 파라메트릭 발진기의 캐비티 길이를 조정하십시오. 이 스펙트럼 범위는 CH 스트레칭 영역의 진동을 포함합니다. 광대역 펌프를 프리즘 압축기로 보내 여기 현미경 목표에 포함된 분산 효과를 보상합니다.펌프를 정점을 통해 프리즘 A에 입력하고 분산 된 펌프를 프리즘 B의 정점쪽으로 안내하십시오.필요한 음의 분산량을 정의하고 그에 따라 프리즘 향신료 사이의 거리를 설정하십시오. 브루스터 컷 프리즘을 사용하고 펌프 빔의 편광이 프리즘의 삼각형 평면 내에 있는지 확인하십시오. 인라인 평형 검출 체계를 최적화하려면 이 복굴절성 크리스탈의 빠른 축을 수직으로 설정하고 편광 펌프를 길이 13.3mm의 YV04 플레이트로 안내합니다.그런 다음 반파 플레이트를 사용하여 펌프 빔의 편광을 45도로 설정합니다. 펌프와 스토크스 빔을 이색성 거울과 결합하고 조심스럽게 한 쌍의 형광 핀홀과 정렬하십시오. 두 빔이 모두 선형으로 전파되고 있는지 확인하십시오.빔을 감쇠시키고 빠른 광 다이오드로 안내하여 일시적으로 겹치게하십시오. 그런 다음 광 다이오드를 제거하십시오. 그런 다음 보정 된 카메라로 빔 프로파일을 측정하고 적외선 카드를 사용하여 눈으로 직경을 추정하십시오.두 개의 망원경을 사용하십시오. 하나는 펌프용이고 다른 하나는 스토크스 빔용이며, 빔 직경을 여기 목표의 후면 조리개와 일치시키려고 합니다. 자극 된 라만 산란 또는 SRS 신호가 얻어지면 펌프 빔의 망원경을 사용하여 직경을 조정하여 레일리 범위를 변경하고 결과적으로 현미경의 초점에서 상호 작용 볼륨을 변경하십시오.최대 SRS가 달성되면 중지하십시오. 광 다이오드를 사용하여 펌프 빔의 강도를 측정하고 광 다이오드의 응답성으로 검출기의 활성 영역에 충돌하는 평균 전력을 계산하십시오. 레이저의 상대 강도 잡음을 측정하려면 저역 통과 필터를 분리하고 고대역폭 광 다이오드의 출력을 잠금 증폭기의 입력에 연결하십시오.잠금 출력을 서로 다른 복조 주파수에서 Hertz의 제곱근 이상의 볼트에 저장하고 포토 다이오드 응답성을 사용하여 볼트를 와트로 변환합니다. 펌프와 스토크스 빔을 현미경으로 안내하십시오. 샘플을 배치하고 펌프 빔을 정렬하는 데 도움이되는 구슬이없는 영역을 찾으십시오.그런 다음 여기 및 수집 목표를 공초점으로 만듭니다. 단거리 통과 필터를 넣어 변조 된 스토크를 제거하고 펌프 빔을 그레이딩으로 안내하십시오. 그레이딩 후에 렌즈를 배치하여 분산된 빔을 검출기에 초점을 맞춥니다.균형 잡힌 감지를 위해 기준의 스펙트럼과 펌프 빔을 따라 전파되는 신호 복제본을 측정하십시오. 그레이딩과 편광 빔 스플리터 사이에 작은 슬릿 또는 아이리스를 배치하여 두 광 다이오드 어레이 간의 스펙트럼 정합을 보장하고 분산된 펌프를 공간적으로 필터링합니다. 펌프 복제본의 스펙트럼 구성 요소 하나를 제외한 모든 스펙트럼 구성 요소를 클립하여 전송 된 광선을 참조 및 신호 광 다이오드 어레이의 N번째 검출기에 집중시킵니다.스티어링 미러를 사용하여 다양한 감지 채널의 상관 관계를 조정합니다. SRS 현미경을 시작하려면:스톡스를 변조하고, 래스터를 스캔하고, 해당 DC 스펙트럼을 사용하여 펌프 스펙트럼에서 변조 전송을 획득하여 각 픽셀에서 정규화된 SRS 스펙트럼을 가져옵니다. 행과 열에 샘플의 스캔된 위치가 포함된 입체 행렬을 생성합니다.XY 평면에 직교하는 각 벡터에 SRS 스펙트럼을 저장합니다. 농도 및 스펙트럼 프로파일을 플롯하여 샘플의 화학 구성 요소의 화학적 이미지 및 특성 스펙트럼을 획득합니다. 대표적인 이미지는 이 프로토콜에 사용된 광학 소스의 상대적 강도 잡음 스펙트럼을 보여준다.여기에 표시된 것은 SRS 실험에 가장 적합한 스펙트럼 영역입니다. 이 대역 내의 모든 주파수에서 Stokes 빔을 변조하면 SRS 신호에 대한 레이저 잡음의 영향이 가능한 가장 낮을 수 있습니다. 불균형하고 균형 잡힌 스펙트럼의 예시적인 데이터가 여기에 도시되어 있다.균형 잡힌 검출의 효과는 실험의 최종 결과에 영향을 미칩니다. 즉, 화학지도. 불균형하고 균형 잡힌 조건의 합성 이미지가 여기에 표시됩니다.대표적인 이미지는 하이퍼스펙트럼 SRS 데이터의 화학학적 분석을 보여준다. 샘플의 상이한 화학적 구성성분의 농도 맵 및 이들의 특징적인 SRS 스펙트럼의 복합체가 여기에 도시되어 있다. 이러한 데이터로부터, 샘플의 상이한 구성성분, 예를 들어, 올리브 오일, DMSO 폴리스티렌, 및 폴리메틸 메타크릴레이트가 용이하게 확인될 수 있다.현재, 우리의 기술은 CH 진동 스트레칭 만 조사 할 수 있습니다. 그러나 광학 소스를 최적화함으로써 동일한 감지 체인을 통해 한 번에 여러 모드를 감지하는보다 유익한 지문 영역을 탐색 할 수 있습니다. 우리의 검출 체인은 광대역 SRS를 클리닉에 통합하기위한 길을 열어 주며 조직 진단을위한 전통적인 조직 병리학 워크 플로우를 보완하고 향상시키는 기술을 도입합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Engineering

공학

출처: Espinoza, R., et al. 조직 진단을 위한 마우스 뇌의 실시간 2색 자극 라만 산란 영상. J. Vis. Exp. (2022).  이 비디오는 쥐의 뇌 조직 절편에 대한 2색 자극 라만 산란(SRS) 이미징을 보여줍니다. 두 개의 동기화된 레이저 빔이 조직 부분으로 향하여 분자 진동을 여기시켜 빔의 상대적인 강도 변화를 초래합니다. 조직의 지질과 단백질은 레이저 빔의 고유한 주파수 쌍을 사용하여 검출됩니다. 그런 다음 결과 신호에 별도의 색상이 할당되어 조직의 단백질과 지질을 식별하는 데 도움이 되는 2색 이미지를 생성합니다.

마우스 뇌 조직의 2색 자극 라만 산란 이미징

이 원고에서, 레이저 스캐닝 현미경과 SRS 실험 설정의 통합에 의해 얻어진 자극된 라만 산란(SRS) 현미경의 구현이 설명된다. SRS 현미경은 두 개의 펨토초(fs) 레이저 소스, Ti-Sapphire(Ti:Sa) 및 동기화된 광학 파라메트릭 발진기(OPO)를 기반으로 합니다.

자극된 라만 산란을 기반으로 한 비선형 현미경 구현

자극라만 산란 (SRS) 현미경 검사법은 특정 화학 적 moieties의 선택적, 라벨없는 이미징을 허용하고 효과적으로 생체 내에서 지질 분자를 이미지하기 위해 사용되었습니다. 여기에서, 우리는 SRS 현미경 검사법의 원리에 대한 간략한 소개를 제공하고 Caenorhabditis elegans에있는 지질 저장에 그것의 사용을 위한 방법을 기술합니다.

자극라만 산란 현미경 검사를 사용하여 Caenorhabditis elegans의 지질 저장 역학의 라벨 프리 이미징

자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 특정 화학 결합의 고유 진동을 기반으로 생체 분자의 라벨 없는 이미징을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서, 통합 SRS 및 이광자 형광 현미경의 도구 셋업은 살아있는 마우스의 척수에서 세포 구조를 시각화하기 위해 기술된다.

생체 내 결합 된 이광자 형광 및 자극 된 라만 산란 현미경을 사용한 생물학적 조직 이미징

자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 강력하고 비파괴적이며 라벨이 없는 이미징 기술입니다. 한 가지 새로운 응용 분야는 자극 라만 조직학이며, 여기서 단백질과 지질 라만 전이에서 두 가지 컬러 SRS 이미징이 의사 헤마톡실린 및 에오신 이미지를 생성하는 데 사용됩니다. 여기에서는 조직 진단을 위한 실시간 이색 SRS 이미징을 위한 프로토콜을 시연합니다.

조직 진단을 위한 마우스 뇌의 실시간 두 가지 색상 자극 라만 산란 영상

무지개 유사 라만 염료의 전자 사전 공명 자극 라만 산란 (epr-SRS) 이미징은 고도로 다중화 된 에피토프 기반 단백질 이미징을위한 새로운 플랫폼입니다. 여기에서는 항체 준비, 조직 샘플 염색, SRS 현미경 어셈블리 및 epr-SRS 조직 이미징을 포함한 실용적인 가이드를 제시합니다.

라만 염료를 이용한 고도의 다중화 조직 이미징

이 기사에서는 스펙트럼 초점 모듈과 이중 출력 펄스 레이저의 통합을 제시하여 금 나노 입자와 암세포의 신속한 초분광 이미징을 가능하게 합니다. 이 작업은 표준 레이저 스캐닝 현미경에서 다중 모드 비선형 광학 기술의 세부 사항을 시연하는 것을 목표로 합니다.

다중 모드 비선형 광학 현미경을 사용한 나노 입자의 세포 흡수의 생체 분자 이미징

이 논문은 동일한 현미경 플랫폼에 통합 된 자극 된 라만 산란 (SRS)과 일관된 스토크스 라만 산란 (CARS)의 해상도, 감도 및 이미징 대비를 직접 비교합니다. 결과는 CARS가 더 나은 공간 분해능을 가지며, SRS는 더 나은 콘트라스트와 스펙트럼 분해능을 제공하며, 두 방법 모두 비슷한 감도를 가지고 있음을 보여줍니다.

화학 이미징을 위한 하이퍼스펙트럼 자극 라만 산란 및 일관된 안티스토크스 라만 산란 현미경의 직접 비교

label-free 광학 이미징 방식을 결합한 멀티모달 플랫폼을 활용하여 세포 역학 및 신진대사를 시각화하고 정량화하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. 다광자 형광, 2차 고조파 생성 및 유도 라만 산란 현미경을 통한 이미징을 통해 세포 및 분자 환경에 대한 전체적인 개요를 생성할 수 있습니다.

세포 대사 연구를 위한 멀티모달 광학 이미징 플랫폼

컴팩트하고 초안정한 이중 굴절 간섭계를 기반으로 한 광시야 푸리에 변환 현미경은 2D 검출기의 모든 픽셀에 대해 스펙트럼을 병렬로 획득할 수 있게 합니다. 시간 영역 접근법은 광발광과 라만 신호의 분리를 가능하게 하며, ~1 μm 공간 해상도와 23 cm-1 스펙트럼 해상도로 빠른 라만 매핑(~5 ms/pixel)을 가능하게 합니다.

다중 모드 광시야 푸리에 변환 라만 현미경

배우세요 광대역 자극 라만 산란 현미경을 이용한 멀티플렉스 화학 이미징 방법을. PMMA와 폴리스티렌 미소구슬을 활용한 생물학적 샘플의 비표적 비침습적 화학 성분 분석 기술입니다.

광대역 자극 라만 산란 현미경을 기반으로 한 멀티플렉스 화학 이미징

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