Ex vivo Freisetzung von Calcitonin-Gen-verwandtem Peptid aus dem trigeminovaskulären System bei Nagetieren

Diese Methode ist ein Werkzeug, um Mechanismen zu untersuchen, die an der Freisetzung von CGRP aus dem trigeminalen Gefäßsystem beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Methode ist die Fähigkeit, das trigeminale Gefäßsystem in drei verschiedene Stellen zu unterteilen und die Freisetzung des CGRP innerhalb jeder einzelnen Stelle zu beurteilen. Das Verfahren wird von mir und Inger Jansen-Olesen, einer leitenden Wissenschaftlerin aus unserer Gruppe, demonstriert.

Bereiten Sie zunächst das Rattengewebe vor, indem Sie die Haut und den Muskel um Kopf und Hals mit einer Schere entfernen. Als nächstes verwenden Sie einen Knochenschneider und eine Schere, um den Unterkiefer vom Kopf zu trennen. Legen Sie nun das Rückenmark und den Hirnstamm frei, indem Sie einen Knochentrimmer kaudal in den dorsalen Teil der Wirbel einführen und entfernen.

Schneiden Sie dann den kaudalen Teil des Schädels an den Rändern der Hinterhaupts- und Beckenknochen ab, um diese Knochenstrukturen zu entfernen und das Kleinhirn freizulegen. Um das etwa 13 bis 16 Millimeter vom Bregma auf jeder Seite kaudal verlaufende TNC zu isolieren, schneiden Sie den dorsolateralen Teil des Hirnstamms mit einer Federschere ab. Danach wird der linke und rechte TNC in SIF eingetaucht.

Als nächstes schneiden Sie den Kopf in der Mitte ab, um den Schädel mit einer Säge in zwei Teile zu teilen. Entfernen Sie nun vorsichtig das Gehirn, ohne die am Schädel befestigte Dura mater mit einem Spatel zu berühren. Um die TG zu isolieren, schneiden Sie sie einschließlich ihrer Äste an den visuellen Rändern ab, wobei der Unterkieferast in das Foramen ovale und die ophthalmologischen und Oberkieferäste in den Schädel eintreten.

Tauchen Sie dann die Schädelhälften und die TGs in SIF. Um das Mausgewebe vorzubereiten, entfernen Sie die Haut und den Muskel um Kopf und Hals mit einer Schere. Legen Sie nun das Rückenmark und den Hirnstamm frei, indem Sie eine Schere kaudal in den Rückenteil der Wirbel einführen und entfernen.

Schneiden Sie dann den kaudalen Teil des Schädels an den Grenzen der Hinterhaupts- und Scheicheknochen ab, um diese Knochenstrukturen zu entfernen, die das Kleinhirn freilegen. Schneiden Sie den Scheitelbein mittig und entfernen Sie den Knochen, um das Großhirn freizulegen. Entfernen Sie vorsichtig das Kleinhirn, um den Hirnstamm mit einem Spatel freizulegen.

Isolieren Sie das TNC, das einen Teil des Hirnstamms enthält, mit einer Federschere, gefolgt von einem Eintauchen des Hirnstamms in SIF. Entfernen Sie nun vorsichtig das Gehirn mit einem Spatel und schneiden Sie den Trigeminusnerv dort ab, wo er in den Hirnstamm eintritt. Um die TG zu isolieren, schneiden Sie sie einschließlich ihrer Äste um die visuellen Grenzen mit dem Unterkieferast ab, wo sie in das Foramen ovale und die ophthalmologischen und Oberkieferäste eintritt, die in den Schädel eintreten.

Als nächstes tauchen Sie TGs in SIF ein. Für einen einfachen Austausch von SIF fügen Sie einen Zolldeckel zu den Kunststoffbehältern hinzu und waschen Sie das Ratten- und Mausgewebe 30 Minuten lang in SIF, indem Sie das SIF alle fünf Minuten austauschen. Nach 30 Minuten Waschen bei Raumtemperatur werden die TNC-Hälften der Ratte und die TGs der Ratte in die Kappen des Mikrozentrifugenröhrchens mit 350 Mikrolitern SIF umgefüllt.

Übertragen Sie den Hirnstamm der Maus mit TNC in eine Mikrozentrifugenröhrchenkappe mit 250 Mikrolitern SIF. Zum Schluss werden die beiden Maus-TGs in einen Mikrozentrifugenröhrchenverschluss mit 250 Mikrolitern SIF überführt. Legen Sie die Rattenschädelhälften auf eine Sechs-Well-Kulturplatte und füllen Sie den Schädel mit 400 Mikrolitern SIF.

Legen Sie Rattenschädel in Mikrozentrifugenröhrchenkappen mit Ratten- und Mausgewebe in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie SIF mit einer Pipette alle fünf Minuten für 20 Minuten, ohne das Gewebe zu berühren. Bereiten Sie Mikrozentrifugenröhrchen für die Probenentnahme durch entsprechende Etikettierung vor.

Dann fügen Sie 50 Mikroliter 10-prozentigen EIA-Puffer zu jedem Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Als nächstes werden die Testverbindungslösung und die Vehikellösung durch Verdünnen in SIF für alle Konzentrationen hergestellt. Nach dem letzten Waschen fügen Sie 250 Mikroliter SIF zu Maus TG und TNC, 350 Mikroliter SIF zu Ratten-TG und TNC und 400 Mikroliter SIF zu jedem Rattenschädel hinzu.

Nach 10 Minuten Inkubation werden 200 Mikroliter der Probe in einem vormarkierten Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 Mikrolitern 10-prozentigem EIA-Puffer gesammelt, um die Messung der basalen CGRP-Freisetzung zu ermöglichen. Entsorgen Sie die restliche Flüssigkeit und lagern Sie die Proben sofort bei minus 20 Grad Celsius. Die Prüfsubstanz wird in steigender Konzentration, beginnend mit der niedrigsten Konzentration, in das entsprechende Vehikel gegeben und 10 Minuten lang inkubiert.

Nach 10 Minuten Inkubation werden 200 Mikroliter der Probe in einem vormarkierten Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 Mikrolitern 10-Stärke-EIA-Puffer gesammelt. Entsorgen Sie die verbleibende Flüssigkeit und fügen Sie dem Gewebe die zweitniedrigste Konzentration hinzu. Lagern Sie die Proben sofort bei minus 20 Grad Celsius und wiederholen Sie diesen Vorgang mit der verbleibenden Konzentration.

Um eine Positivkontrolle für das Experiment durchzuführen, fügen Sie die Positivkontrolle am Ende des Protokolls dem Gewebe hinzu. Nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten wird eine 200-Mikroliter-Probe in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 Mikrolitern 10-prozentigem EIA-Puffer entnommen. Die in den entnommenen Proben freigesetzten CGRP-Konzentrationen werden unter Verwendung eines UVP-Kits unter Beachtung der mit dem UVP-Kit gelieferten Anweisungen des Herstellers gemessen.

Bei der Ratte induzierte die Capsaicin-Exposition im Vergleich zum Vehikel eine signifikante CGRP-Freisetzung aus Dura mater und TG. In der Dura mater wurde die maximale Freisetzung von CGRP bei einem Mikromolar Capsaicin gefunden. Und in TG wurde die maximale CGRP-Freisetzung bei 10 Mikromolar Capsaicin gefunden.

Bei der Analyse mit einer Einweg-ANOVA zeigte Glibenclamid keine Wirkung auf die basale CGRP-Freisetzung aus Dura mater und TG. Glibenclamid reduzierte signifikant die Capsaicin-induzierte CGRP-Freisetzung in der Dura mater um 40 % und TG um 39 % im Vergleich zu Capsaicin mit dem Vehikel, wenn es mit einer Einweg-ANOVA analysiert wurde. Es wurde festgestellt, dass das transiente Rezeptorpotenzial Ankyrin-1-Agonist Super-Zimtaldehyd CGRP in einer konzentrationsabhängigen Weise aus dem TG mit 1, 10 und 100 Mikromolar Super-Zimtaldehyd freisetzt, was zu einer um 9%, 52% und 69% erhöhten Freisetzung von CGRP im Vergleich zum Vehikel führt, wenn es mit Zwei-Wege-ANOVA analysiert wurde. Die erhöhte Freisetzung von CGRP fehlte bei TG bei den transienten Rezeptorpotential-Ankyrin-1-Knockout-Mäusen, bei denen die Exposition gegenüber 1, 10 und 100 Mikromolar Super-Zimtaldehyd zu einer 11%-minus 13%- bzw. 9%-Veränderung der Freisetzung von CGRP im Vergleich zum Vehikel führte, wenn sie mit Zwei-Wege-ANOVA analysiert wurden.

Es ist wichtig, darauf zu achten, das Gewebe während der Probenentnahme nicht zu berühren und die Inkubationszeit für alle Proben genau zu bestimmen. Wenn geeignete ELISA-Kits zur Verfügung stehen, ist es möglich, dieses Verfahren anzuwenden, um die Freisetzung anderer Peptide im trigeminalen Gefäßsystem zu messen.