Selección in vitro de aptámeros para diferenciar virus infecciosos de virus no infecciosos

Este protocolo describe cómo seleccionar aptámeros de ADN que puedan distinguir virus infecciosos de virus no infecciosos para obtener moléculas de detección capaces de informar la infectabilidad de muestras clínicas o ambientales. Esta técnica se puede aplicar para obtener aptámeros selectivos para muchos otros virus, incluidos los virus emergentes, ya que no requiere un conocimiento previo de las estructuras o secuencias del virus. Esta técnica permite el desarrollo de sensores aptámeros para el diagnóstico clínico y el monitoreo ambiental de virus infecciosos para detectar si alguien es contagioso o si un método de desinfección ambiental funciona según lo previsto.

La selección puede ser un proceso difícil, especialmente para aquellos que son nuevos en ella. Es importante optimizar las condiciones de PCR y monitorear el progreso de la selección con qPCR. Demostrando el procedimiento estará Marcos Gramajo, un estudiante graduado de mi laboratorio.

Para comenzar, diseñe la biblioteca y los cebadores iniciales de monocatenario o SS-ADN. Obtenga los oligos de ADN de fuentes comerciales con purificación de desalinización estándar. Purificar la biblioteca de SS-DNA y los cebadores en electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante al 10% seguida de precipitación de etanol.

A continuación, obtenga una solución madre de virus infecciosos y no infecciosos o prepárelos como se describe en el texto manuscrito. Para la desnaturalización de la biblioteca de SS-ADN, mezcle 10 microlitros de la biblioteca de ADN-SS de 100 micromolares con 240 microlitros de tampón SELEX. Caliente la mezcla a 95 grados centígrados durante 15 minutos en un baño seco, luego coloque el tubo en hielo durante 15 minutos.

Mezcle 250 microlitros de la biblioteca SS-DNA en el tampón SELEX con 50 microlitros de virus infecciosos para una selección positiva. Incubar durante dos horas a temperatura ambiente. Luego agregue 400 microlitros de una secuencia T20 milimolar a un filtro de 0.5 mililitros para bloquear los sitios no específicos.

Incubar los filtros durante 30 minutos. Centrifugar el filtro a 14, 000 G durante 10 minutos para eliminar la solución T20. A continuación, lave el filtro tres veces con el tampón SELEX para eliminar el exceso de secuencias T20.

A continuación, agregue la mezcla de virus infecciosos de la biblioteca SS-DNA al filtro bloqueado de 100 kilodalton y al centrífugo para lavar las secuencias no unidas. Lave el filtro tres veces añadiendo 400 microlitros de tampón SELEX y centrifugación. Mantenga la fracción en el filtro y deseche el flujo.

Para eluyir secuencias unidas, cambie el tubo de recolección del filtro centrífugo y agregue 300 microlitros de tampón SELEX que contiene ocho molares de urea al filtro. Caliente el filtro a 95 grados centígrados durante 15 minutos, luego centrifugar para recoger el flujo que contiene las secuencias eluyidas. Una vez hecho esto, lava los materiales con lejía al 10%.

A continuación, agregue la solución de virus infeccioso SS-DNA recolectada en el paso anterior a un filtro bloqueado de 10 kilodalton, centrifugar a 14, 000 G durante 15 minutos y desechar el flujo. Lave el filtro tres veces con 300 microlitros de tampón SELEX para eliminar la urea por centrifugación y deseche el flujo continuo. Recupere la solución en el filtro dándole la vuelta en un tubo de recolección limpio y centrifugando durante cinco minutos.

Mida el volumen final de la solución recuperada con una pipeta y etiquétela como una muestra de la Ronda 1A. Tome el 90% de la muestra de la Ronda 1A como plantilla en la primera ronda y ejecute la PCR utilizando condiciones optimizadas. Para recuperar SS-DNA utilizando perlas magnéticas modificadas con estreptavidina o MB, divida el producto en alícuotas de 50 microlitros y agréguelas a tubos de microcentrífuga que contengan 50 microlitros MB. Incubar el tubo durante 30 minutos con agitación leve a temperatura ambiente.

Luego coloque el tubo en la rejilla magnética para aislar el MB y retire el sobrenadante mediante pipeteo. Lave el MB dos veces agregando 200 microlitros de tampón de unión y lavado al tubo. A continuación, retire el tubo de la rejilla magnética y golpee antes de volver a suspender el MB a una solución homogénea mediante pipeteo.

Coloque el tubo de nuevo en la rejilla magnética y retire el sobrenadante. Después del segundo lavado, resuspender el MB en 100 microlitros de tampón SELEX y calentar la solución a 95 grados centígrados durante 10 minutos. Coloque inmediatamente el tubo en la rejilla magnética y recoja el sobrenadante que contiene la piscina de ADN-SS.

Repita este paso de recuperación añadiendo 50 microlitros de tampón SELEX. Mida el volumen final de la fracción recuperada y etiquétela como Ronda 1X. Para la desnaturalización de la reserva de ADN-SS, tome el 60% de la muestra Round 1X y mézclela con 50 microlitros de tampón SELEX.

Caliente la muestra en un baño seco, luego coloque el tubo en hielo durante 15 minutos. A continuación, mezcle la piscina de SS-DNA desnaturalizada en el tampón SELEX con 50 microlitros de cada virus como paso de contraselección e incube durante una hora a temperatura ambiente. Después de bloquear los sitios no específicos en los filtros de centrífuga, agregue la mezcla desnaturalizada SS-DNA pool incubada con una solución de virus a un filtro bloqueado de 100 kilodalton.

Centrifugar el filtro a 14, 000 G durante 10 minutos y recoger el flujo a través. Tome 300 microlitros de fracción y mezcle con 50 microlitros de virus infecciosos que contengan 100 millones de copias por mililitro. Incubar durante dos horas a temperatura ambiente.

Prepare una mezcla maestra estándar de qPCR y diluciones de la biblioteca de ADN-SS purificada como se describe en el texto. Ejecute la qPCR para determinar el ciclo de umbral. Después de la carrera, use una curva estándar para cuantificar la cantidad de SS-DNA en la Ronda 1A y la Ronda 1X.

Luego calcule el rendimiento de elución como la cantidad de ADN unida dividida por la cantidad inicial de ADN y trace el rendimiento de elución frente al número redondo. Finalmente, trace las curvas de fusión para diferentes rondas. Para una secuenciación de alto rendimiento, seleccione un kit apropiado disponible comercialmente.

Prepare varios grupos de rondas de selección que representen un enriquecimiento alto, medio y bajo, así como el grupo final utilizando un par diferente de índices en los adaptadores para cada grupo. A continuación, envíe la biblioteca final preparada a la instalación de secuenciación. Para el análisis de secuenciación, las secuencias han sido desmultiplexadas por la instalación de secuenciación.

Elimine los adaptadores de secuenciación y los cebadores de selección mediante el programa de línea de comandos Cutadapt. A continuación, utilice el programa FASTX-Toolkit para eliminar secuencias de baja calidad. A continuación, combine los archivos de secuencia en la dirección inversa con los de la dirección de avance utilizando la función de complemento de FASTX_reverse_ FASTX-Toolkit en los archivos de dirección inversa.

Luego use el programa CAT incorporado para combinar los archivos en un solo archivo. Utilice el kit de herramientas de análisis FASTAptamer para analizar el enriquecimiento de secuencias en diferentes grupos de selección. En primer lugar, utilizar las funciones de recuento de FASTAptamer y clúster de FASTAptamer para agrupar secuencias similares en clústeres.

A continuación, utilice la función de enriquecimiento FASTAptamer para obtener información sobre el enriquecimiento de secuencias y grupos. Identificar las secuencias de aptámeros candidatos a partir de la información de enriquecimiento obtenida a través del análisis de secuencias. Seleccione varias secuencias de aptámeros y realice el cribado inicial mediante un ensayo de enlace.

En este análisis, se utilizó qPCR para monitorear el progreso de SELEX de aptámeros infecciosos específicos del SARS-CoV-2. El rendimiento de elución aumentó inicialmente con cada ronda de SELEX y se niveló en las rondas ocho y nueve. Al comparar las curvas de fusión, se observó un cambio desde el pico a una alta temperatura de fusión de 77 a 79 grados centígrados.

Además, en las dos últimas rondas, se observó un pico a una baja temperatura de fusión. Se muestra la abundancia relativa en lecturas por millón para el SARS2 AR10 secuenciado obtenido en rondas de selección consecutivas. La estructura predicha del SARS2 AR10 mostró una estructura secundaria estructurada que contiene una región del bucle del tallo que podría estar involucrada en el reconocimiento del virus.

Una vez que se obtienen los aptámeros, se pueden incorporar a ópticas eléctricas, otro tipo de sensores, para desarrollar una prueba de detección rápida y portal de virus que pueda informar la infectividad del virus. Prevemos que se puede obtener aptámero específico para diferentes variantes o estereotipos de virus, lo que hace posible el monitoreo rápido de las variantes que son la mayor amenaza para la sociedad.