Rilevamento del bersaglio basato su aptamero facilitato da una reazione di amplificazione esponenziale isoterma G-quadruplex a 3 stadi

Questo metodo offre un modo per amplificare il segnale dagli eventi di legame in una forma che è rilevabile visivamente per un basso utilizzo delle risorse o può essere quantificata utilizzando strumentazione basata sull'assorbanza. Questo è un protocollo relativamente veloce, one-pot, per determinare la presenza del bersaglio dell'aptamero in un campione di interesse. I risultati possono essere confrontati con una curva di taratura standard se si desidera quantificarla.

Gli individui devono essere molto precisi durante il trasferimento e la miscelazione delle soluzioni, poiché una miscelazione insufficiente porterà a risultati negativi. Inoltre, assicurarsi che i reagenti e le soluzioni siano mantenuti refrigerati fino all'uso per ridurre al minimo il segnale di fondo. Inizia attivando i prodotti di scissione del ribozima aggiungendo cinque unità di polinucleotide chinasi T4 in una provetta PCR.

Quindi, aggiungere un microlitro di tampone ribozima 5X pre-preparato a ciascuna provetta del campione. Per dimostrare visivamente la specificità, aggiungere 1,5 microlitri di due teofillina millimolare o due caffeina millimolare a ciascuna provetta come campioni di prova e mescolare accuratamente ciascun campione pipettando da cinque a 10 volte. Quindi, aggiungere due microlitri di RNA nanomolare 600 contenenti un dominio aptamerico specifico per bersaglio a ciascuna provetta del campione, seguita dal pipettaggio per mescolare rapidamente i componenti.

Ora, posiziona il tubo su un blocco freddo per ridurre al minimo il segnale di fondo. Dopo aver preparato tutte le provette di reazione, incubare ogni campione a temperatura ambiente per esattamente tre minuti. Al termine dell'incubazione, riportare immediatamente le provette a ghiaccio per il campione.

Aggiungere 3,5 microlitri di miscela enzimatica nicase polimerasi a ciascuna provetta e mescolare bene. Quindi, aggiungere 31,5 microlitri di miscela di reazione EXPAR contenente nucleotidi modello e tampone di reazione a ciascuna provetta e miscelare mediante pipettaggio. Una volta preparati tutti i campioni, incubare il campione preparato a 55 gradi Celsius per cinque minuti utilizzando un timer.

Riportare immediatamente le provette nel ghiaccio dopo l'incubazione. Aggiungere due microlitri di soluzione di emina a ciascuna provetta per lo sviluppo del colore e mescolare bene. Quindi, aggiungere 58 microlitri della soluzione TMB disponibile in commercio a ciascuna provetta di campionamento, mescolare bene e incubare per lo sviluppo del colore.

Leggere i campioni qualitativamente ad occhio o quantificare i risultati utilizzando un lettore di piastre di assorbanza, come descritto nel manoscritto. Il costrutto ottimizzato potrebbe riconoscere un minimo di 500 teofillina nanomolare in 30 minuti. I preparati campione esposti al bersaglio producono un colore blu, mentre i campioni che non contengono alcun bersaglio rimangono incolori.

Una curva standard è stata preparata dal segnale misurato a A450 dopo 30 minuti di sviluppo del colore. È importante mantenere i campioni sul ghiaccio quando non si eseguono incubazioni, poiché anche l'RNA ottimizzato mostrerà comunque un basso livello di attività di fondo.