التوليف المباشر لجسيمات الذهب النانوية المرئية EM في الخلايا لتحليل توطين البروتين مع البنية التحتية المحفوظة جيدا
April 28th, 2023
يصف هذا البروتوكول تقنية لصق المجهر الإلكتروني القابل للاستنساخ للكشف عن البروتينات الموسومة بالميتالوثيونين في الخلايا باستخدام تقنية جديدة لتخليق الجسيمات النانوية الذهبية القائمة على آلية قمع النوى الذاتية.
يعد اكتشاف البروتين وتوطينه أمرا ضروريا في البحث البيولوجي. يصف بروتوكولنا تقنية جديدة لوضع العلامات EM باستخدام علامات مشفرة وراثيا تسمح بتصور جزيء واحد في الموقع مع بنية فائقة محفوظة جيدا. من الأهمية بمكان تجنب الإفراط في التثبيت.
تعتمد طريقة وضع العلامات على نشاط cysteines في العلامات ، والتي هي حساسة للغاية للربط المتقاطع للألدهيد. يتجنب بروتوكولنا استخدام مثبتات الألدهيد ويحافظ على نشاط العلامة والبنية الفائقة. في نفس الوقت.
لطالما كان وضع العلامات EM يمثل تحديا ، حيث يعاني من ضعف التشكل أو وضع العلامات غير الفعالة. تقوم بروتوكولاتنا بتجميع الجسيمات النانوية في الموقع مباشرة على البروتينات الفردية لتوفير توطين واضح ودقيق للبروتينات المستهدفة ، مع نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية وكفاءة عالية ونوعية. لقد حققنا حتى الآن علامات ممتازة في البروتينات المعزولة وخلايا E.coli وخلايا الخميرة وخلايا HeLa.
سوف نستكشف ونحسن طريقة التطبيق على عينات الأنسجة. سيسمح لنا الجمع بين تقنيات cryo-FIB و cryo-EM السائدة بمعالجة الأسئلة البيولوجية المهمة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة تقنية تمييز جديدة للميكروسكوب الإلكتروني (EM) مصممة لكشف البروتينات الموسومة بالميتالوثيونين داخل الخلايا. باستخدام آلية لقمع التنوي الذاتي، تسمح الطريقة بتصوير دقيق لجزيء واحد مع الحفاظ على البنية التحتية الخلوية.
مكونات الدراسة الرئيسية
منطقة البحث
- بيولوجيا الخلية
- الميكروسكوب
- تحديد مكان البروتين والكشف عنه
الخلفية
- الكشف عن البروتينات وتحدد مكانها أمر بالغ الأهمية للعديد من تطبيقات البحوث البيولوجية.
- غالبًا ما تؤثر طرق تمييز EM التقليدية على المورفولوجي والكفاءة.
- يمكن أن تعزز العلامات المشفرة وراثيًا حساسية وخصوصية اكتشاف البروتين.
الطرق المستخدمة
- تقنية تمييز EM جديدة تتجنب المواد الثابتة الألديهادية للحفاظ على نشاط البروتين.
- التطبيق على البروتينات المعزولة، E. coli، خلايا Easter، وخلايا HeLa.
- الجمع بين تقنيات cryo-FIB و cryo-EM لتحسين التصوير.
النتائج الرئيسية
- نجاح تصنيع جسيمات الذهب مباشرة على البروتينات الفردية.
- تحقيق تحديد مكان واضح ودقيق مع نسبة إشارة إلى ضجيج عالية.
- التحقق من كفاءة الطريقة وخصوصيتها عبر عينات بيولوجية مختلفة.
الاستنتاجات
- تظهر هذه الدراسة تقدمًا كبيرًا في تقنيات كشف البروتين.
- تعد الطريقة واعدة لمعالجة الأسئلة البيولوجية الحيوية على المستوى الجزيئي.
