Name: שיטה יעילה וניתנת לשחזור לייצור צמחים מרוכבים על ידי טרנספורמציית שורשים שעירים מבוססי קנה שורש אגרובקטריום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 9 s
Description: למד שיטת טרנספורמציה בצעד אחד באמצעות Agrobacterium rhizogenes לייצור שורשים שעירים בצמחים. טכניקה יעילה זו מאפשרת חקר פונקציית גנים והנדסה מטבולית בדו-פסיגיים וחד-פסיגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר של אוניברסיטת ליאוצ'נג (318012028) והקרן למדעי הטבע של פרובינציית שאנדונג (ZR2020MC034).

1. תנאי גידול צמחים ותרבית A. rhizogenes 
<ol><li>זריעת זרעים הערה: זרעי סויה פראיים נאספו במחוז יאנגו, ליאוצ'נג, סין; זרעים של S. americanum ודלעת זן מקומי Yinsu נרכשו מהשוק.<ol><li>לאסוף זרעים של סויה בר, S. americanum, ואת הזן המקומי של דלעת, לזרוע אותם vermiculite בעומק של 1 ס"מ, ולהשקות אותם היטב. לשתול 20 זרעים בקופסאות פלסטיק בגודל 8 ס"מ על 11 ס"מ על 9 ס"מ. טפחו את הצמחים בתא גידול בטמפרטורה של 24 ± 2°C עם מחזור אור של 16 שעות / 8 שעות חושך בכ-70% לחות יחסית. הערה: יש לשבור מעילים של זרעי סויה פראיים לפני הזריעה. אם שאלת המחקר מתמקדת באינטראקציות בין צמחים למיקרואורגניזמים, יש לעקר זרעים, ורמיקוליט, קופסאות פלסטיק ומים לפני השימוש.</li>
		<li>הפעלה ותרבות של A. rhizogenes K599 הערה: לזן A. rhizogenes K599 היה וקטור בינארי אחד pRed13052 הנושא גן כתב פלואורסצנטי אדום DsRed2.
		<ol><li>הסר את זן קנה השורש A . K599 מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C, והפעל את החיידקים על LB בינוני מוצק (עם 50 מ"ג/ליטר קנמיצין ו-50 מ"ג/ליטר סטרפטומיצין) ב-28°C למשך 48 שעות.</li>
			<li>בחר שיבוט יחיד של זן K599 ותגדל אותו בתרבית של 1 מ"ל של מדיום LB נוזלי המכיל אנטיביוטיקה למשך 12 שעות.</li>
			<li>פיזור שווה של 500 μL של תרחיף החיידקים על מדיום LB מוצק המכיל אנטיביוטיקה, ואחריו דגירה ב 28 ° C במשך 24 שעות.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. שיטת שינוי שורש שעיר בתיווך קנה שורש A. שלב אחד
<ol><li>חתך היפוקוטיל<ol><li>לאחר 7 ימים (הגדירו את זריעת הזרעים כיום 0), שתילי קוטילדונים נפרשו, זה עתה (איור 1A), השתמשו באזמל מעוקר וחד כדי לחתוך בערך 0.5-1 ס"מ מההיפוקוטיל (איור 1B). יש להשליך את השורש הראשוני וחלק מההיפוקוטיל החלקי. הערה: השתמש באזמל בזהירות.</li>
	</ol></li>
	<li>חיסון K599<ol><li>צפו את חתך ההיפוקוטיל בחיידקי K599 (איור 1C).</li>
		<li>שתול את השתילים בוורמיקוליט לח (איור 1D).</li>
		<li>להדביק 30 צמחים מכל מין באמצעות שינוי שורש שעיר בתיווך A. rhizogenes. השקו כל צמח עם 5 מ"ל של תרחיף חיידקי K599 מרחף מחדש (OD600 = 0.5-0.6) בתווך בסיסי Gamborg B-5 בחוזק רבע (0.25x).</li>
		<li>כסו את הסירים בשקית ניילון שקופה במיוחד (איור 1F) והניחו אותם בתא גידול.</li>
	</ol></li>
</ol>3. ייצור שורשים שעירים
<ol><li>לגדל את הצמחים במשך ~ 12 ימים לאחר החיסון, שורשים שעירים חדשים יושרו וייווצרו באתר החתך. לאחר 15 יום, אורכי השורשים השעירים מגיעים בדרך כלל ל-2-5 ס"מ (איור 2).</li>
	<li>כדי לקבוע אם השורשים השעירים המיוצרים הם טרנסגניים, בחנו את ביטוי הגנים הכתבים התלויים בווקטור שעבר טרנספורמציה ב-K599.<ol><li>זהו את הביטוי של הגן המדווח DsRed2 באמצעות מערכת הדמיה כימילומינסנטית עם אור עירור ירוק ב-540 ננומטר ופליטה ב-600 ננומטר (איור 2B, איור 2D ואיור 2F).</li>
	</ol></li>
</ol>

שיטת טרנספורמציה של שורש שעיר בצעד אחד לקידום ביולוגיה הקשורה לשורשים

<ol><li>Chilton, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes+inserts+T-DNA+into+the+genome+of+the+host+plant+root+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genome of the host plant root cells.</a> Nature. 295, 432-434 (1982).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+simple%2C+high+efficient+and+one-step+generation+of+composite+cucumber+plants+with+transgenic+roots+by+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%2C+Tissue+and+Organ+Culture+%28PCTOC%29%22%5BJournal%5D)">A fast, simple, high efficient and one-step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation.</a> Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 141, 207-216 (2020).</li>
<li>Du, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+mutagenesis+in+soybean+by+TALENs+and+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted mutagenesis in soybean by TALENs and CRISPR/Cas9.</a> Journal of Biotechnology. 217, 90-97 (2016).</li>
<li>Nguyen, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+hairy+root+system+for+validation+of+plant+transformation+vector+and+CRISPR%2FCas+construct+activities+in+cucumber+%28Cucumis+sativus+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">An efficient hairy root system for validation of plant transformation vector and CRISPR/Cas construct activities in cucumber (Cucumis sativus L.).</a> Frontiers in Plant Science. 12, 770062(2022).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtGCS+promoter-driven+clustered+regularly+interspaced+short+palindromic+repeats%2FCas9+highly+efficiently+generates+homozygous%2Fbiallelic+mutations+in+the+transformed+roots+by+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">AtGCS promoter-driven clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 highly efficiently generates homozygous/biallelic mutations in the transformed roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation.</a> Frontiers in Plant Science. 13, 952428(2022).</li>
<li>Irigoyen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+hairy+roots+enable+high+throughput+identification+of+antimicrobials+against+Candidatus+Liberibacter+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Plant hairy roots enable high throughput identification of antimicrobials against Candidatus Liberibacter spp.</a> Nature Communications. 11 (1), 5802(2020).</li>
<li>Plasencia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eucalyptus+hairy+roots%2C+a+fast%2C+efficient+and+versatile+tool+to+explore+function+and+expression+of+genes+involved+in+wood+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation.</a> Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2016).</li>
<li>Gutierrez-Valdes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+cultures-a+versatile+tool+with+multiple+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 33(2020).</li>
<li>Stougaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes+as+a+vector+for+transforming+higher+plants.+Application+in+Lotus+corniculatus+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes as a vector for transforming higher plants. Application in Lotus corniculatus transformation.</a> Methods in Molecular Biology. 49, 49-61 (1995).</li>
<li>Kereszt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+soybean+to+study+root+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology.</a> Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).</li>
<li>Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+tomato+suitable+for+the+study+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Plant Methods. 14, 34(2018).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+phosphatidylserine+synthase+IbPSS1+affords+cellular+Na%2B+homeostasis+and+salt+tolerance+by+activating+plasma+membrane+Na%2B%2FH%2B+antiport+activity+in+sweet+potato+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulture+Research%22%5BJournal%5D)">Overexpression of phosphatidylserine synthase IbPSS1 affords cellular Na+ homeostasis and salt tolerance by activating plasma membrane Na+/H+ antiport activity in sweet potato roots.</a> Horticulture Research. 7, 131(2020).</li>
<li>Boisson-Dernier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Medicago+truncatula+for+the+study+of+nitrogen-fixing+and+endomycorrhizal+symbiotic+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%3A+MPMI%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 14 (6), 695-700 (2001).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+composite+soybean+plants+with+transgenic+roots+by+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">One-step generation of composite soybean plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation.</a> BMC Plant Biology. 20 (1), 208(2020).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthocyanin%2C+a+novel+and+user-friendly+reporter+for+convenient%2C+non-destructive%2C+low+cost%2C+directly+visual+selection+of+transgenic+hairy+roots+in+the+study+of+rhizobia-legume+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Anthocyanin, a novel and user-friendly reporter for convenient, non-destructive, low cost, directly visual selection of transgenic hairy roots in the study of rhizobia-legume symbiosis.</a> Plant Methods. 16, 94(2020).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+AtMYB75+as+a+reporter+gene+in+the+study+of+symbiosis+between+tomato+and+Funneliformis+mosseae%5BTitle%5D)+AND+%22Mycorrhiza%22%5BJournal%5D)">Application of AtMYB75 as a reporter gene in the study of symbiosis between tomato and Funneliformis mosseae.</a> Mycorrhiza. 33 (3), 181-185 (2023).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+set+of+novel+binary+expression+vectors+for+plant+gene+function+analysis+and+genetic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Development of a set of novel binary expression vectors for plant gene function analysis and genetic transformation.</a> Frontiers in Plant Science. 13, 1104905(2023).</li>
<li>Li, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytochrome+B+inhibits+darkness-induced+hypocotyl+adventitious+root+formation+by+stabilizing+IAA14+and+suppressing+ARF7+and+ARF19%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%3A+For+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Phytochrome B inhibits darkness-induced hypocotyl adventitious root formation by stabilizing IAA14 and suppressing ARF7 and ARF19.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 105 (6), 1689-1702 (2021).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

שיטת השורש השעיר בתיווך קנה שורש A. היא שיטה פשוטה ויעילה יותר לייצור צמחים מרוכבים מאשר שיטת הזרקת היפוקוטיל. שיטת ARM החד-שלבית משפרת משמעותית את יעילות טרנספורמציית השורשים השעירים, מקצרת את זמן ייצור השורשים השעירים, מגדילה את מספר השורשים השעירים ומפחיתה את כמות העבודה הכרוכה בכך. פרוטוקול הטרנספורמציה המשופר הוא אופטימלי למחקרים על סימביוזות בין צמחים קטומים לריזוביה ובין צמחים ופטריות מיקוריזה ארבוסקולריות. ניתן לייחס זאת לעובדה כי השתלת צמחים מרוכבים לאחר ייצור שורשים שעירים אינה נדרשת, אשר מונעת את הזיה...

Agrobacterium rhizogenes הוא חיידק קרקע גראם-שלילי ממשפחת Rhizobiaceae. A. rhizogenes יכול להדביק כמעט את כל dicotyledons, כמה monocotyledons, ואת gymnosperms בודדים דרך פצעים, לייצר שורשים שעירים בצמחים נגועים. החיידק נושא את פלסמיד Ri (השראת שורש), וה-T-DNA של פלסמיד Ri נושא את הגן הסינתזה opine ואת הגנים rol (גנים לוקוס שורש). לאחר שה-T-DNA של פלסמיד Ri נכנס לתא צמח ומשולב בכרומוזום מארח, ביטוי הגנים של הרול גורם לייצור שורשים שעירים1. וקטור ביטוי בינארי של צמח הנושא גן מטרה הופך לקנה שורש A, וקנה השורש A. שעבר טרנספורמציה משמש להדבקת צמח. שורשים טרנסגניים יכולים להיות מושרים בצמחים נגועים, לייצר צמחים מרוכבים המכילים שורשים טרנסגניים וגבעולים וניצנים שאינם מהונדסים . בדרך כלל, צמח מורכב ניתן להשיג בתוך 14-20 ימים. A. שינוי שורש שעיר בתיווך קנה שורש אינו מוגבל בדרך כלל על ידי גנוטיפ בצמחים dicotyledonous2. השורשים השעירים המיוצרים על ידי צמחים נגועים בריזוגנים מאופיינים בקצב צמיחה מהיר, תורשה יציבה ותפעול קל. טרנספורמציה של שורשים שעירים בתיווך A. rhizogenes נמצאת כיום בשימוש נרחב לחקר ביולוגיה הקשורה לשורשים. יתר על כן, ניתן להשתמש בטרנספורמציה של שורשים שעירים גם כדי לאמת ולמטב את יעילות עריכת המטרותשל מערכת CRISPR/Cas9 3,4,5 ולוקליזציה תת-תאית של חלבונים. לכן, טרנספורמציה של שורשים שעירים היא כלי חשוב במחקר על תפקוד גנים של צמחים, הנדסה מטבולית ואינטראקציות בין שורשים למיקרואורגניזמים בריזוספרה 6,7,8.
צמחים מרוכבים המכילים שורשים טרנסגניים המתקבלים באמצעות טרנספורמציה של שורשים שעירים הופקו באופן נרחב בצמחים דיקוטילדוניים, במיוחד בקטניות. השיטה המסורתית של הזרקת hypocotyl עם קנה שורש A. שימש לייצור מרוכב Lotus corniculatus9, פולי סויה10, עגבניות 11, בטטות12, וצמחים רבים אחרים 5,8. שיטת הזרקת ההיפוקוטיל אינה יעילה ועלולה לגרום למוות של צמחי היפוקוטיל צעירים או זעירים. לכן, השיטה שופרה על ידי חיתוך שורשי העובר, ציפוי חתך השתיל עם A. rhizogenes, ולאחר מכן הנחת hypocotyl על מדיום תרבית סטרילית עבור השתרשות טיפוח13. עם זאת, שלבים אלה מבוצעים בסביבה סטרילית, ושלבי הניתוח מסורבלים יחסית. בפרט, צמחים מרוכבים וכתוצאה מכך צריך להיות מושתל, אשר מגדיל את כמות העבודה. בעבודה קודמת נקבעה טרנספורמציה של שורש שעיר בתיווך A. rhizogenes (ARM) במלפפון, סויה, לוטוס japonicus, Medicago truncatula, ועגבניות 2,14,15,16,17. השורש הראשוני וההיפוקוטיל החלקי הוסרו, אתר החתך של ההיפוקוטיל הנותר היה מצופה בקנה-שורש A. שעבר טרנספורמציה, והשתיל הושתל לתוך ורמיקוליט סטרילי לח. לאחר 12 ימי גידול, שורשים שעירים הופקו באתר החתך. שיטת ARM החד-שלבית יעילה ביותר ודורשת פחות זמן לייצר שורשים שעירים. השתלה לאחר יצירת שורשים שעירים הוא גם לא הכרחי. מאחר שניתן להימנע מזיהום מיקרוביאלי ללא השתלה, שיטת ARM החד-שלבית יכולה להיות שימושית במיוחד כאשר חוקרים אינטראקציות בין צמחים ומיקרואורגניזמים, כגון קיבוע חנקן סימביוטי בין צמחים קטומים לריזוביה, וסימביוזה בין צמחים ופטריות מיקוריזה ארבוסקולריות. במאמר זה, פרוטוקול טרנספורמציה מפורט של שורש שעיר בתיווך A. rhizogenes מספק דוגמאות של צמחים מרוכבים המיוצרים בפולי סויה בר, Solanum americanum ודלעת. בעזרת הפרוטוקול, חוקרים יכולים לבצע בצורה חלקה את טרנספורמציית ARM בצעד אחד.

<table><tbody><tr><td>kanamycin</td><td>סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td></td><td></td>A506636</tr><tr><td>LB בינוני</td><td>סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B540113 קופסת פלסטיק</td><td>LiaoSu</td><td></td><td>8 ס"מ x 11 ס"מ x 9 ס"מ</td></tr><tr><td>דלעת</td><td></td><td></td><td>זן מקומי Yinsu</td></tr><tr><td>streptomycin</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>A610494&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tanon-5200Multi machine</td><td>Tanon Co., Ltd., סין</td><td>5200Multi</td><td>כימילומינסנציה מערכת הדמיה</td></tr><tr><td>עגבניות</td><td></td><td></td><td>זן מקומי Zhongshu4</td></tr><tr>פולי <td></td><td></td><td>סויה בר</td><td>שנאספו במחוז יאנגו, ליאוצ'נג, סין</td></tr></tbody></table>

שיטה יעילה וניתנת לשחזור לייצור צמחים מרוכבים על ידי טרנספורמציית שורשים שעירים מבוססי קנה שורש אגרובקטריום

An Efficient and Reproducible Method for Producing Composite Plants by Agrobacterium rhizogenes-Based Hairy Root Transformation

ייצור צמחים מרוכבים עם שורשים טרנסגניים וגבעולים וניצנים שאינם מהונדסים באמצעות טרנספורמציית שורשים שעירים בתיווך אגרובקטריום הוא כלי רב עוצמה לחקר ביולוגיה הקשורה לשורשים. טרנספורמציית שורשים שעירים מתבססת במגוון רחב של דיקוטילדונים ובמספר מיני מונוקוטילדונים והיא כמעט בלתי תלויה בגנוטיפ. השיטה המסורתית של הזרקת היפוקוטיל עם קנה שורש A . להשגת צמחים מרוכבים אינה יעילה, גוזלת זמן, מייגעת, ולעתים קרובות גורמת למוות של צמחי היפוקוטיל רכים וזעירים. בעבר הוקמה טרנספורמציה יעילה ביותר, חד-שלבית, של שורש שעיר בתיווך A. rhizogenes , אשר מבטלת את הצורך בהשתלה לאחר ייצור שורשים שעירים. במחקר זה הוסרו היפוקוטיל חלקי ושורש ראשוני, אתר חתך ההיפוקוטיל היה מצופה בקנה-שורש A, ולאחר מכן נשתלו היפוקוטיל בוורמיקוליט סטרילי. לאחר 12 ימי טיפוח, חתך ההיפוקוטיל התרחב והושרו שורשים שעירים חדשים. מאמר זה מספק את הפרוטוקול המפורט של שיטת טרנספורמציה חד-שלבית בתיווך A. rhizogenes, כאשר יעילותה הודגמה על ידי ייצור צמחים מרוכבים של סויה בר, Solanum americanum ודלעת.

טרנספורמציה יעילה ביותר של שורש שעיר בתיווך קנה שורש A. rhizogenes שורשים שעירים יוצרו באתר החתך היפוקוטיל 12 יום לאחר החיסון עם K599 מהונדס. שורשים שעירים טרנסגניים נקבעו על סמך ביטוי הגן המדווח הכלול בווקטור הבינארי. שורשים טרנסגניים שעברו טרנספורמציה בעזרת גן הכתב DsRed2 של פולי סויה בר מרוכבים, S. americanum ודלעת נצפו באור עירור טבעי (איור 2A, איור 2C ואיור 2E) וירוק (איור 2B, איור ...

כאן, אנו מספקים את הפרוטוקול המפורט של שיטת טרנספורמציה חד-שלבית בתיווך Agrobacterium tumefaciens לייצור צמחים מרוכבים.

Producing composite plants with transgenic roots and nontransgenic stems and buds using Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation is a ...

הצוות שלנו מתמקד בטרנספורמציה של שורשים שעירים מבוססי קנה שורש Agrobacterium. טרנספורמציה של שורשים שעירים חיונית לחקר תפקוד גנים של צמחים, הנדסה מטבולית ואינטראקציות בין שורשים למיקרואורגניזמים של ריזוספרה. מאמר זה מספק שיטת טרנספורמציה חד-שלבית, בתיווך קנה שורש אגרובקטריום.טרנספורמציית שורשים שעירים נוצרת במינים שונים של דיקוטילדונים ומונוקוטילדונים, והיא כמעט בלתי תלויה בגנוטיפ. השיטה החד-שלבית המתווכת על ידי קני שורש אגרובקטריום להשראת שורשים שעירים פשוטה ויעילה יותר ליצירת צמחים מרוכבים בהשוואה לשיטת הזרקת היפוקוטיל. שיטת הזרקת ההיפוקוטיל אינה יעילה ועלולה לגרום למוות של צמחי היפוקוטיל צעירים או זעירים.השיטה החד-שלבית בתיווך קנה שורש אגרובקטריום יעילה מאוד ודורשת פחות זמן כדי לייצר שורשים שעירים. יתר על כן, אין צורך להשתיל מעבר להיווצרות שורשים שעירים. גנים לוויסות סימני אלפא וגנים לסינתזה של סימני בטא שימשו כסמני מסך נגיפיים בטרנספורמציית שורשים שעירים בתיווך קנה שורש אגרובקטריום.

an-efficient-reproducible-method-for-producing-composite-plants

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מדגימים כיצד צמחים שורש שעיר המשולב יכול לשמש כדי ללמוד צמחים rhizobium אינטראקציות nodulation ב קשות להפוך...

דור של צמחים Composite ב Medicago truncatula המשמש מבחני Nodulation

באמצעות הרכבת DNA, וקטורי CRISPR מרובים ניתן לבנות במקביל לתגובת שיבוט יחידה, מה שהופך את הבנייה של מספר רב של CRISPR וקטורי משימה פשוטה. עגבניות שורשי שעירים מהווים מערכת מודל מצוינת כדי לאמת וקטורי CRISPR וליצור חומרי מוטציה.

CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים להפוך את תפוחי האדמה צמחים. הטרנספורמציה Agrobacterium tumefaciens מוביל צמח מהונדס מלאה בעוד Agrobacterium rhizogenes מייצרת הטרנסגניים שורשים שעירים יורה פראי סוג זה יכול להיות עצמי שעבר בירושה. אנחנו מכן לזהות יזם פעילות על-ידי גאס צביעת שורשים טרנספורמציה.

Agrobacterium tumefaciens , Agrobacterium rhizogenes-מתווכת טרנספורמציה של תפוחי אדמה, יזם פעילות של גן Suberin על ידי גאס Staining

אנו מתארים שיטה של גרימת שורשים שעירים על ידי Agrobacterium ריזוגנים-שינוי מתווך של כוסמת טרארי (Fagopyrum tataricum). זה יכול לשמש כדי לחקור פונקציות גן וייצור של מטבוליטים משני ב כוסמת טרארי, להיות מאומץ עבור כל שינוי גנטי, או משמש צמחי מרפא אחרים לאחר שיפור.

שורש שעירים על ידי Agrobacterium ריזוגנים-שינוי מתווך בתוך הטאררי כוסמת (Fagopyrum טאטארנום)

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור יעיל של שורשים שעירים סויה מהונדסים.

טרנספורמציה של שורש סויה שעיר לניתוח תפקוד גנים

הפרוטוקול מתאר השראת שורשים שעירים באמצעות גבעולי תפרחת ראשוניים Arabidopsis והיפוקוטיל Brassica napus . ניתן לגדל את השורשים השעירים ולהשתמש בהם כצמחים להתחדשות צמחים טרנסגניים.

טרנספורמציה והתחדשות של שורשים שעירים ב-Arabidopsis thaliana וב-Brassica napus

צמחים מציעים מערכת חדשנית לייצור של חלבוני תרופות בהיקף מסחרי, כי הוא יותר ניתן להרחבה, יעיל וחסכונית ובטוחה יותר מפרדיגמות ביטוי הנוכחיות. במחקר זה, אנו מדווחים גישה פשוטה ונוחה, אך ניתן להרחבה להציג את היעד של גן...

Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

סרקומה קפוסי (קאי אס) הוא גידול הנגרמת על ידי זיהום עם oncogenic וירוס ההרפס-8/KS ההרפס האנושי (HHV-8/KSHV). המודל התרבות תאי אנדותל המתואר כאן הוא לצורכיכם לימוד המנגנון שבאמצעותו KSHV המרות התאים המארחים.

מודל במבחנה עבור לימודי טרנספורמציה התאית על ידי ההרפס סרקומה קפוסי

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מהיר וגמיש ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים של תאים באמצעות צבירת תאים. זה מותאם בקלות לסוגי תאים מרובים ומתאים לשימוש במגוון יישומים כולל נדידת תאים, פלישה או מבחני אנויקיס, ולהדמיה וכימות אינטראקציות בין תאים-מטריצות.

שיטת Aggregation Cell יעילה וגמישה עבור הפקת 3D אליפטית

פרוטוקול זה מתאר שיטה להשיג שילוב יציב הגן עניין הגנום האנושי על ידי המערכת היפהפייה הנרדמת transcriptionally מוסדרים. הכנת השילוב של וקטורים lentiviral פגומים, התמרה של במבחנה חושית של תאים אנושיים ואת וזמינותו המולקולרית בתאי transduced מדווחים.

שיטת טרנספוזיציה יעיל במבחנה על-ידי מערכת יופי ישן Transcriptionally מוסדרים הארוזים לתוך וקטור Lentiviral פגומים אינטגרציה

למד שיטת טרנספורמציה בצעד אחד באמצעות Agrobacterium rhizogenes לייצור שורשים שעירים בצמחים. טכניקה יעילה זו מאפשרת חקר פונקציית גנים והנדסה מטבולית בדו-פסיגיים וחד-פסיגיים.

שיטה יעילה וניתנת לשחזור לייצור צמחים מרוכבים על ידי טרנספורמציית שורשים שעירים מבוססי קנה שורש אגרובקטריום

גלה סרטונים נוספים