15.7:
Complementary DNA
15.7:
Complementary DNA
نظره عامه
الجينات التي يتم نسخها إلى الحمض الريبي المرسال (mRNA) هي فقط الجينات النشطة أو المعبر عنها. لذلك ، يمكن للعلماء استخراج الحمض الريبي المرسال من الخلايا لدراسة التعبير الجيني في الخلايا والأنسجة المختلفة. يحول العالم الحمض الريبي المرسال إلى حمض نووي تكميلي (cDNA) عن طريق النسخ العكسي. نظراً لأن الحمض الريبي المرسال لا يحتوي على إنترونات (مناطق غير مشفرة) وتسلسلات تنظيمية أخرى ، فإن الحمض النووي التكميلي _ على عكس الحمض النووي الجيني _ يسمح أيضاً للباحثين بتحديد تسلسل الأحماض الأمينية للببتيد المشفر بواسطة الجين مباشرةً.
تخليق الحمض النووي التكميلي
يمكن إنشاء الحمض النووي التكميلي بعدة طرق ، ولكن الطريقة الشائعة هي استخراج الحمض الريبي الكلي من الخلايا أولاً ، ثم عزل الحمض الريبي من الأنواع الأكثر شيوعاً _ الحمض الريبي الناقل(tRNA) والريبوزومي (rRNA). يحتوي الحمض الريبي المرسال الناضج في حقيقيات النوى على ذيل بولي (A) _ سلسلة من نيوكليوتيدات الأدينين _ تضاف إلى النهاية 3′ ، في حين أن الأنواع الأخرى من الحمض الريبي لا تفعل ذلك. لذلك ، يمكن ربط سلسلة من نيوكليوتيدات الثايمين (oligo-dTs) بركيزة مثل عمود أو حبات مغناطيسية ، على وجه التحديد زوج قاعدة مع ذيول بولي (A) من الحمض الريبي المرسال. بينما يتم التقاط الحمض الريبي المرسال مع ذيل بولي (A) ، يتم غسل الأنواع الأخرى من الحمض النووي الريبي بعيداً.
بعد ذلك ، النسخ العكسي _ إنزيم بوليميريز الحمض النووي من الفيروسات التراجعية _ يستخدم لتوليد الحمض النووي التكميلي من الحمض الريبي المرسال. نظراً لأنه ، مثل معظم بوليمرات الحمض النووي ، يمكن أن يضيف النسخ العكسي للنيوكليوتيدات فقط إلى النهاية 3′ للسلسلة ، يضاف بولي (T) تمهيدي لربط ذيل بولي (A) لتوفير نقطة انطلاق لتخليق الحمض النووي التكميلي. ينتهي حبلا الحمض النووي التكميلي في حلقة دبوس الشعر. ثم يتحلل الحمض النووي الريبي _ عادة مع العلاج القلوي أو إنزيمات RNase _ وترك الحمض النووي التكميلي أحادي السلسلة سليم.
ثم يتم تصنيع خيط حمض نووي ثانٍ مكمل لـ الحمض النووي التكميلي بواسطة بوليميريز الحمض النووي _ غالباً باستخدام حلقة دبوس الشعر من خيط الحمض النووي التكميلي الأول أو قطعة مقطوعة من الحمض الريبي المرسال كأساس.
يمكن إدخال الحمض النووي التكميلي مزدوج الشريط الناتج في ناقلات بكتيرية أو فيروسية واستنساخه باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية. مكتبة الحمض النووي التكميلي _ تمثل جميع الاحماض الريبية المرسال في الخلايا أو الأنسجة ذات الأهمية _ ويمكن أيضاً إنشاءها لإجراء المزيد من البحث.
Suggested Reading
Pray, Leslie A. “The Biotechnology Revolution: PCR and the Use of Reverse Transcriptase to Clone Expressed Genes.” Nature Education 1, no. 1 (2008): 94. [Source]