未修饰蛋白质的光诱导交联技术（PICUP）在淀粉样肽中的应用

摘要

光诱导未修饰蛋白质交联（PICUP）技术可用于表征亚稳态蛋白质混合物中寡聚体的大小分布。我们展示了将PICUP应用于三种典型的淀粉样肽：淀粉样β蛋白的40和42个残基形式、降钙素，以及一种对照肽生长激素释放因子。

摘要

淀粉样变性蛋白组装成有毒寡聚体是包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、遗传性肌萎缩侧索硬化症以及2型糖尿病在内的蛋白质错误折叠疾病发病过程中的关键事件。由于这些蛋白质组装体具有亚稳态特性，使用传统方法（如电泳、色谱法、荧光法或动态光散射）难以对其寡聚体大小分布进行定量评估。淀粉样变性蛋白的寡聚体以亚稳态混合物形式存在，其中寡聚体同时发生解离为单体和缔合成更大组装体的过程。光诱导交联法（PICUP）通过共价交联稳定寡聚体群体，当与分馏方法（如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）或尺寸排阻色谱法（SEC））结合使用时，PICUP能够捕捉交联前存在的寡聚体大小分布的快照。因此，PICUP可实现对亚稳态蛋白质群体的可视化和定量分析，并可用于监测蛋白组装过程，解析序列修饰与寡聚化之间的关系。¹. 从机制上讲，PICUP 涉及 Ru 的光氧化²⁺在三联吡啶合钌(II)配合物（RuBpy）中，将钌还原³⁺通过在电子受体存在下用可见光照射。Ru³⁺是一种强效的单电子氧化剂，能够从邻近的蛋白质分子中夺取一个电子，从而生成蛋白质自由基^1,2. 自由基是不稳定的高活性物质，因此会通过多种分子内和分子间反应迅速消失。自由基可利用未成对电子的高能量与另一个蛋白质单体反应，形成二聚体自由基，随后失去一个氢原子，生成稳定的共价连接的二聚体。该二聚体可进一步通过类似机制与单体或其他二聚体反应，形成更高阶的寡聚体。与其它光交联或化学交联方法相比，PICUP 具有以下优势^3,4包括短暂（≤1 秒）暴露于非破坏性可见光，无需pre facto对天然序列的修饰，以及零长度共价交联。此外，PICUP 能够在广泛的 pH 和温度范围内实现蛋白质的交联，包括生理条件。在此，我们展示了 PICUP 在三种淀粉样蛋白——40 和 42 个残基的淀粉样 β 蛋白变体（Aβ40 和 Aβ42）以及降钙素，以及一种对照蛋白生长激素释放因子（GRF）——交联中的应用。

方案

1. 肽的制备

1. 使用微量天平称取约 100–200 μg 冻干肽，并转移至已标记的、硅化涂层、低吸附性的微量离心管中。本实验中使用人源 Aβ40、Aβ42、降钙素和 GRF 的序列。
2. 本实验中使用经 1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇（HFIP）预处理的肽，以获得均一且无聚集物的样品。此步骤是必要的，因为预先形成的聚集体可诱导淀粉样蛋白迅速聚集，导致实验间重复性差⁵。其他方法如过滤和尺寸排阻色谱（SEC）也可用于制备适用于 PICUP 的无聚集物样品⁶。
3. 为用 HFIP 处理肽，首先在冰上预冷 HFIP 容器，操作时需在通风橱内佩戴适当的防护装备（HFIP 具有挥发性和毒性）。冷却一个 250 ml 的瓶子通常需要 10–15 分钟。将 HFIP 加入预先冷却的含有冻干肽的管中，使肽的终浓度为 0.5 mM。
4. 在室温下，将肽溶液置于水浴超声仪中进行超声处理 5 分钟。
5. 轻轻涡旋混匀，并在室温下孵育 30 分钟。
6. 将管置于冰上冷却（1 分钟），然后将溶液分装为 10–50 μl 的等分试样，放入已标记的 0.6 ml 低吸附性管中。
7. 通过通入温和的氮气流蒸发去除 HFIP，或在通风橱中敞口过夜。若选择过夜蒸发，应将敞口管置于管架中，并用一张较大的 Kimwipes 纸覆盖，以防止灰尘和颗粒污染。
8. 将残留的 HFIP 在冻干机或离心浓缩仪中真空干....

讨论

PICUP 最初被开发用于研究稳定的蛋白质复合物²。此后，该方法被应用于对不稳定淀粉样蛋白组装体的定量研究，包括 Aβ¹⁰、朊病毒以及与疾病相关的 PrP^{Sc 11} 和 α-突触核蛋白¹²。设计 PICUP 实验时必须考虑的最重要因素包括试剂的化学计量比、辐照时间以及样品制备流程。前两个问题可能需要通过实验进行优化，而后者则在很大程度上影响实验数据的解读。特别是对于淀粉样变性蛋白，要确定不稳定寡聚体的尺寸分布，必须使用无聚集物的起始样品。PICUP 的背景原理、作用机制、仪器设备、实验方案、优化方法、适用范围、改进形式、应用领域及局限性已在先前的文献中进行了详细阐述^1,2,13。PICUP 可用于生成稳定的可溶性蛋白质寡聚体，这些寡聚体在经过分级分离和纯化后，可用于结构研究、细胞毒性检测、寡聚化抑制研究，以及作为分子识别工具开发的靶标。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dolan-Jenner 200 W 白炽灯	其他	Dolan-Jenner Industries	Model 170-D	灯产生的热量–对短时间孵育的样品无影响。
35毫米单镜头反光相机机身	工具	Pentax	SP500 模型	在我们的设置中，相机机身连接了一个风箱，为放置在距离光源10 cm处的样品提供了一个便于照射的腔室。
透明薄壁 PCR 管	其他	Eppendorf	951010006，由 Fisher L22-003-24 提供
玻璃小瓶（1.8 mL）	其他	Kimble Chase	60940A 2，由 Fisher 03-340-60 提供
GRF	试剂	Bachem	H-3695
HFIP	试剂	TCI America	H0424	在通风橱中操作。
Aβ40 和 Aβ42	试剂	加州大学洛杉矶分校生物聚合物实验室
降钙素	试剂	美国肽	22-1-10
三(2,2-联吡啶)二氯合钌(II)六水合物	试剂	Sigma-Aldrich	224758-1G	涡旋至溶液澄清。用铝箔包裹RuBpy管，以避光保存。RuBpy需每次新鲜配制，且应在48小时内使用。
过硫酸铵	试剂	Sigma-Aldrich	A-7460	涡旋至溶液澄清。APS 每次现配，且应在 48 小时内使用。
β巯基–乙醇	试剂	Sigma-Aldrich	M7154-25 ML	可在进行SDS-PAGE分析时使用。
Novex Tricine SDS 样品缓冲液 (2x)	试剂	Invitrogen	LC1676
XCell SureLock 微型细胞	工具	Invitrogen	EI0001
Novex Tricine 凝胶（10-20%）	其他	Invitrogen	EC6625B0X
Novex Tricine SDS 电泳缓冲液（10x）		Invitrogen	LC1675
银染快速染色试剂盒		Invitrogen	LC6100