Horisontell Skiva Beredning av näthinnan
Summary
Traditionellt vertikal skiva och hela montering beredningen av näthinnan har använts för att studera funktionen av retinala kretsar. Här beskriver vi de nya skivning metod för att bevara de dendritiska morfologi av näthinnan nervceller intakt.
Abstract
Traditionellt vertikal skiva och hela montering beredningen av näthinnan har använts till att studera funktionen av retinala kretsar. Men många av näthinnans nervceller, som amakrina celler, utöka sin dendriter horisontellt, så att morfologin av cellerna ska vara allvarligt skadade i den vertikala skivor. I hela montering förberedelser, särskilt för patch-clamp inspelningar, retinal nervceller i mitten lagret är inte lätt åtkomliga på grund av den omfattande täckning av gliacellsmarkörer (Mueller cell) är endfeets. Här beskriver vi de nya skivning metod för att bevara de dendritiska morfologi av näthinnan nervceller intakt. Segmentet gjordes horisontellt på det inre lagret av näthinnan med hjälp av en vibratome slicer efter att näthinnan var inbäddade i låg temperatur smälter agarosgel. I denna horisontella bit beredningen av näthinnan, studerade vi funktionen av näthinnans nervceller jämfört med deras morfologi, med hjälp av patch-clamp inspelning, kalcium bildteknik, immuncytokemiundersökning och encelliga RT-PCR.
Protocol
Discussion
Det finns flera viktiga fördelar av den horisontella skiva utarbetandet av näthinnan.
För det första är morfologi av de celler som expanderar dendriter horisontellt, såsom amakrina celler och horisontella celler, bevaras. Det har visat sig att det finns över 20 olika typer av amakrina celler i näthinnan (MacNeil och Masland, 1998), så att det är ganska viktigt att jämföra morfologin av cellerna med fysiologiska fastigheten.
För det andra, i hela montering näthinnan, förhindrar den omfattande täckning av gliac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Richard H. Masland och Akimichi Kaneko för att ge oss värdefulla råd och förslag för att fastställa förfarandet för den horisontella skiva utarbetandet av näthinnan.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Agar | Sigma | A-1296 | ||
| Agarose L | Wako | 317-01182 | Low-temperature melting agarose | |
| Hyaluronidase | Sigma | Type I-S, 300 units/mg | ||
| Medium | in mM: 102 NaCl, 3.1 KCl, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 23 NaHCO3, and 10 glucose, maintained at pH 7.8, or, Ames’ Solution (Sigma) | |||
| Microwave | ||||
| Hot water bath | 35 C | |||
| Vibratome slicer | Leica | VT1000S | ||
| MF-Membrane filters | Millipore | HAWP01300 | Filter paper , pore size 0.45 um | |
| Dissection tools | forceps, blade, pinch, twizzer, etc. | |||
| Instant glue | eg., Alonalpha, Krazy Glu | |||
| 50 ml syringe | ||||
| syringe filter | Millipore | SX0001300 |
References
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A., Koizumi, A., TC, J. a. k. o. b. s., Masland, R. H., MA, M. a. c. N. e. i. l., RH, M. a. s. l. a. n. d. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
