Human eilandjes van Langerhans Isolatie: Deel I: Spijsvertering en verzameling van alvleesklierweefsel
Summary
Het bereiken van hoge kwaliteit en de juiste hoeveelheid van de menselijke eilandjes is een van de prominente voorwaarden voor een succesvolle transplantatie eilandjes van Langerhans. In deze video, beschrijven we stap voor stap de procedures voor de menselijke eilandjes van Langerhans isolatie (deel I: de spijsvertering en het verzamelen van de pancreas weefsel) met behulp van een aangepaste automatische methode.
Abstract
Het beheer van type 1 diabetes is belastend, zowel voor het individu en de samenleving, voor meer dan 100 miljard dollar per jaar. Ondanks het wijdverbreide gebruik van glucose monitoring en nieuwe insuline-formuleringen, veel mensen nog steeds te ontwikkelen verwoestende secundaire complicaties. Eilandjes van Langerhans transplantatie kan herstellen in de buurt van normale glucose-controle bij patiënten met diabetes<sup> 1</sup>, Zonder het risico van ernstige hypoglycemische episodes die geassocieerd worden met intensieve insulinetherapie. Zorgen voor voldoende eilandje massa is van belang voor een succesvolle transplantatie eilandjes van Langerhans. Echter, donor karakteristieke, orgaanverkrijging en het behoud van invloed op de uitkomst isolatie<sup> 2</sup>. Aan de Universiteit van Illinois in Chicago (UIC) hebben we een succesvolle isolatie protocol met een verbeterde zuivering gradiënt<sup> 3</sup>. Het programma startte in januari 2004, en meer dan 300 isolaties werden uitgevoerd tot en met november 2008. De pancreata werden in koude behoud oplossingen (UW, Universiteit van Wisconsin-of HTK, Histidine-tryptofaan Ketoglutaraat)<sup> 4-7</sup> Om de Cell Isolatie Laboratory van UIC voor eilandje isolatie. Pancreaseilandjes werden geïsoleerd met behulp van de UIC-methode, die is een gewijzigde versie van de methode die oorspronkelijk beschreven door Ricordi<em> Et al.</em><sup> 8</sup>. In het kort, na het reinigen van de pancreas van het omringende weefsel, werd het geperfuseerd met enzym-oplossing (Serva Collagenase + Neutraal protease of Sigma V enzym). De opgezwollen alvleesklier werd vervolgens overgebracht naar de Ricordi spijsvertering kamer, aangesloten op een aangepaste, gesloten circulatie buizen systeem, en opgewarmd tot 37 ° C. Tijdens de spijsvertering, was de kamer zachtjes geschud. Monsters werden continu genomen om de spijsvertering voortgang te bewaken. Eenmaal vrij eilandjes werden ontdekt onder de microscoop, de spijsvertering werd gestopt door spoelen koud (4 ° C) RPMI verdunningsoplossing (Mediatech, Herndon, VA) in de circulatie systeem om het enzym te verdunnen. Na te zijn verzameld en gewassen in M199 media aangevuld met humaan albumine, was het weefsel bemonsterd voor pre-zuivering tellen en geïncubeerd met UW oplossing voor de zuivering. Zuiveringsproces zullen worden beschreven in deel II: Zuivering en cultuur van de mens eilandjes.
Protocol
Discussion
Er zijn verschillende factoren die van invloed de isolatie uitkomst 9,10. Onder hen, de spijsvertering van de pancreas weefsel speelt een prominente rol. Op basis van onze eigen menselijke eilandje isolatie ervaren, hebben we samengevat volgende kritische punten, die mogelijk invloed hebben op de eilandje opbrengst en kwaliteit.
- De spijsvertering is anders wanneer verschillende soorten enzymen worden gebruikt.
- Zodra 40-50% van de eilandjes volledig gescheiden van acinaire weefsel, moet de spijsver…
Acknowledgements
Ondersteund door de financiering van de Universiteit van Illinois in Chicago als Islet Cell Resource Center NIH-subsidie (RFA-RR 05-003), de Christopher Foundation, de Efroymson Foundation, en de Tellabs Foundation.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ice Slush Machine | equipment | Taylor Company | K4036546 | make sterile ice |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter | 424803 | |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Diagnostic Instrument Co | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nunc Brand Products | 174926 | islet counting |
| Digital Water Bath EX7 | equipment | NesLab | 105361058 | |
| Thermometer | equipment | IBI:IR | 60444 | |
| MonoBloc Balance AB 104-S | equipment | Metler Toledo | 1119430864 | measure pancreas weight |
| MasterFlex II Speed Controller | equipment | Cole Parmer Instrument Co | J00006445 | adjust flow speed during degestion |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon | 217267 | |
| Perfusion Unit | equipment | Custom Made/Swiss | n/a | |
| Cooler for perfusion unit | equipment | Fisher Scientific | 3013P | |
| Ricordi Chamber | equipment | University of Miami | n/a | |
| RPMI dilution solution | reagent | Mediatech Inc | 99783024 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech Inc | 99-597-CM | |
| 25% Human Albumin | reagent | GRIFOLS | NDC 61953-0002-2 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech Inc | 99-784-CM | |
| Collagenase NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002937 | |
| Neutral Protease NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002936 | |
| Betadine | reagent | Cardinal Health | 29906-004 | |
| Cefazolin | reagent | West-Ward Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Dithizone | reagent | Sigma | D5130 |
References
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R., et al. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S., et al. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P., et al. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38, 140-142 (1989).
- Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85, 950-955 (2008).
- Toso, C., et al. Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).
